基于特異性適配體封蓋介孔納米材料的T-2毒素快速檢測(cè)技術(shù)

徐群博，譚紅霞，馬 良

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

T-2毒素是一種由多種鐮刀霉菌產(chǎn)生的真菌毒素，對(duì)多種糧食作物造成污染[1]。T-2毒素對(duì)動(dòng)物體的生殖系統(tǒng)[2]、免疫系統(tǒng)[3]、神經(jīng)系統(tǒng)[4]等都具有一定毒性作用，且由于強(qiáng)烈的急性毒性，T-2毒素在近幾十年內(nèi)仍被用于生物戰(zhàn)劑中。由于具有與黃曲霉素相似的毒性和危害，對(duì)于T-2毒素的研究正逐漸成為新的熱點(diǎn)。在中國(guó)，對(duì)于T-2毒素的檢測(cè)是谷物、食品、動(dòng)物飼料等安全檢測(cè)的必要環(huán)節(jié)。目前，主要的T-2毒素檢測(cè)方法包括高效液相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、氣相色譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于其中的部分T-2毒素檢測(cè)方法進(jìn)行描述[9-10]。目前的快速檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)和金標(biāo)試紙條等技術(shù)[11]，其原理均為基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的標(biāo)記型檢測(cè)方法，需要通過標(biāo)記酶、膠體金或發(fā)光材料等提高檢測(cè)靈敏性。其中，ELISA方法是主流的檢測(cè)方法，采用試劑盒形式，檢測(cè)時(shí)間約為3 h，適合高通量定性或半定量篩查。而試紙條技術(shù)的檢測(cè)時(shí)間較短，但主要進(jìn)行定性篩查。開發(fā)非標(biāo)記型、低成本T-2毒素快速定量檢測(cè)方法對(duì)快速準(zhǔn)確識(shí)別T-2毒素污染和控制其風(fēng)險(xiǎn)有非常積極的作用。

介孔二氧化硅納米（mesoporous silica nanoparticles，MSN）材料具有表面多孔、性質(zhì)穩(wěn)定等多種優(yōu)點(diǎn)，可以通過空穴起到運(yùn)輸、富集微粒的作用，已有報(bào)道用于藥品的裝載以及物質(zhì)的檢測(cè)[12-14]。核酸適配體能與目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合，在生物傳感器的研究與物質(zhì)檢測(cè)中受到廣泛運(yùn)用[15-19]。本研究期望構(gòu)建一種以MSN材料和T-2毒素特異性適配體為基礎(chǔ)，以熒光信號(hào)探針羅丹明6G（Rhodamine 6G，Rh6G）染料為直接檢測(cè)物，通過體系釋放的染料探針熒光強(qiáng)度和毒素質(zhì)量濃度之間的關(guān)系，間接檢測(cè)T-2毒素含量的非標(biāo)記型T-2毒素快速檢測(cè)方式，相較于ELISA方法，該方法采用適配體作為免疫識(shí)別器，降低了檢測(cè)成本，同時(shí)由于免去了標(biāo)記過程，縮短了毒素檢測(cè)所需的時(shí)間，更適用于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的快速定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-氨丙基三乙氧基硅烷（(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES）、正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、Rh6G 美國(guó)Damas-beta公司；NaOH 中國(guó)重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB） 美國(guó)Biosharp公司；T-2毒素、黃曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉素G1（aflatoxin G1，AFG1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（ochratoxin，OTA） 美國(guó)Sigma公司；T-2適配體（gTA TAT CAA gCA TCg CgT gTT TAC ACA TgC gAg Agg CgA A） 生工生物工程（上海）股份有限公司；所有材料與試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；F-2500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；臺(tái)式高速離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 MSN的制備

參照文獻(xiàn)[20-22]方法。取0.5 g CTAB置于圓底燒瓶中，加入240 mL超純水使CTAB充分溶解，用油浴加熱到80 ℃，加入1.75 mL 2 mol/L的NaOH溶液。在劇烈攪拌下，逐滴緩慢加入2.50 mL TEOS，反應(yīng)2 h后，靜置冷卻，將生成的白色絮狀沉淀在10 000 r/min離心12 min，將沉淀與液相分離，所得產(chǎn)物依次用乙醇和水洗滌3 次，放入真空冷凍干燥箱中過夜干燥，即可得到含有模板CTAB的MSN。

將干燥好的顆粒放入馬弗爐中，調(diào)節(jié)溫度至550 ℃，灼燒5 h，即可得到除去模板的MSN顆粒。

1.3.2 氨基修飾的MSN的制備

參照文獻(xiàn)[21, 23-26]方法。稱取0.5 g MSN顆粒，分散于50 mL含有1.5 mL APTES的無水乙醇中，在110 ℃熱油浴中緩慢攪拌10 h，將沉淀物在12 000 r/min離心10 min，所得產(chǎn)物依次用乙醇和水洗滌3 次，放入真空冷凍干燥箱中過夜干燥，得到氨基修飾的MSN顆粒（NH2-MSN）。

1.3.3 適配體封蓋及可行性分析

準(zhǔn)確稱取 30 mg NH2-MSN置于離心管中，加入500 μL 1 mmol/L的Rh6G溶液，于25 ℃振蕩12 h，然后加入200 μL 50 μmol/L的核酸適配體，于25 ℃封蓋5 h，將多余的染料洗脫。將裝載有Rh6G的適配體封端的MSN重新分散到磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）中。

準(zhǔn)備2 組20 μL上述顆粒分散液，其中一組加入質(zhì)量濃度為10 ng/mL的T-2毒素溶液，另外一組作為對(duì)照。兩組溶液分別于37 ℃反應(yīng)2 h后，離心，取上層清液在25 ℃測(cè)定熒光強(qiáng)度，記錄樣品的熒光光譜。比較兩組溶液的熒光強(qiáng)度。測(cè)試過程采用信號(hào)探針羅丹明的最大激發(fā)波長(zhǎng)（480 nm），掃描波長(zhǎng)范圍為530～600 nm[27]。

1.3.4 影響熒光強(qiáng)度的關(guān)鍵反應(yīng)過程條件分析

以1.3.3節(jié)方法為基礎(chǔ)，在NH2-MSN、Rh6G的量以及封蓋、反應(yīng)及檢測(cè)溫度不變的情況下，分別研究適配體封蓋濃度、封蓋時(shí)間、與毒素反應(yīng)時(shí)間對(duì)于檢測(cè)后熒光強(qiáng)度的影響。設(shè)置濃度分別為5、10、20、40、50、75、100 μmol/L；設(shè)置封蓋時(shí)間分別為40、70、120、150、180、240、300 min；設(shè)置反應(yīng)時(shí)間分別為40、70、90、120、150、180、300 min。分別檢測(cè)熒光強(qiáng)度并比較各項(xiàng)研究中各組之間熒光強(qiáng)度的差異。

1.3.5 T-2毒素質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系分析

在1.3.4節(jié)研究確定的條件下測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0、0.005、0.05、0.5、1、2、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250 ng/mL）T-2毒素的熒光強(qiáng)度，以毒素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過曲線得出該方法的毒素檢測(cè)范圍，以3 倍空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的毒素質(zhì)量濃度為檢出限。

1.3.6 特異性分析

在1.3.4節(jié)研究確定的條件下，測(cè)定干擾毒素（AFB1、AFG1、OTA、ZEN）的熒光響應(yīng)值，對(duì)比T-2毒素的熒光響應(yīng)值分析方法特異性。

1.3.7 方法準(zhǔn)確度分析

以玉米、大麥、小麥等作物[28]為檢測(cè)樣品，向檢測(cè)樣品中加入T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，浸泡過夜后揮干溶劑，配制成不同水平的加標(biāo)陽性樣本，其處理方法為：將5 g加標(biāo)樣品粉碎后分散在20 mL乙腈-水（7∶3，V/V）溶液中，超聲處理2 min（過程中每分鐘取出旋渦振蕩0.5 s），靜置10 min后在15 000 r/min離心15 min，兩次。將上清液稀釋100 倍后添加不同含量的T-2毒素制配成為不同水平的加標(biāo)陽性樣品。按照1.3.3節(jié)方法檢測(cè)并計(jì)算回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，各樣品的指標(biāo)進(jìn)行3 次平行測(cè)定，結(jié)果以表示。使用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.01，差異顯著），用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-2毒素的檢測(cè)策略構(gòu)建及可行性分析

如圖1所示，將具有熒光特性的Rh6G作為信號(hào)探針裝填在MSN的孔穴中，MSN表面的氨基和T-2毒素特異性核酸適配體通過靜電作用結(jié)合，從而對(duì)材料上的孔穴進(jìn)行封蓋，當(dāng)目標(biāo)檢測(cè)樣中存在T-2毒素時(shí)，介孔表面的T-2毒素特異性適配體會(huì)與T-2毒素發(fā)生特異性的結(jié)合并使適配體脫離介孔材料，以此實(shí)現(xiàn)孔蓋的打開，熒光探針隨之被釋放出來，通過檢測(cè)熒光信號(hào)探針相應(yīng)熒光信號(hào)變化情況值間接反映T-2毒素含量。

圖1 T-2毒素檢測(cè)策略原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram showing the principle of toxin detection usin MSN

按照1.3.3節(jié)方法對(duì)該方法進(jìn)行可行性分析，如圖2所示，未加入毒素時(shí)，溶液的熒光值較低，當(dāng)加入10 ng/mL的T-2毒素溶液時(shí)，熒光值顯著升高，這是由于T-2毒素與適配體發(fā)生特異性結(jié)合導(dǎo)致適配體脫落顆粒表面釋放出Rh6G導(dǎo)致，以上結(jié)果表明該方法可行，結(jié)果與設(shè)計(jì)的檢測(cè)策略一致。

圖2 接觸靶標(biāo)T-2毒素前后體系的熒光強(qiáng)度變化（CT-2＝10 ng/mL）Fig. 2 Changes in fluorescence intensity of the system before and after exposure to T-2 toxin (CT-2 = 10 ng/mL)

2.2 NH2-MSN表征分析

按照1.3.1節(jié)方法合成NH2-MSN材料，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示，所合成的NH2-MSN顆粒分散性良好，粒徑大小均一，可以看到明顯的微孔結(jié)構(gòu)，顆粒呈球形，尺寸在100 nm以內(nèi)，屬于納米級(jí)介孔型富集材料。

圖3 透射電鏡表征結(jié)果Fig. 3 TEM image of MSN

圖4 MSN與N2-MSN材料的紅外光譜（A）和Zeta電位（B）表征結(jié)果Fig. 4 FTIR spectra (A) and zeta potential (B) of MSN and NH2-MSN

如圖4所示，MSN的FTIR譜圖中僅有二氧化硅的振動(dòng)峰，而NH2-MSN在1 500 cm－1（圖4A）附近出現(xiàn)了氨基的特征峰，表明顆粒表面已修飾上氨基。同時(shí)，圖4B中MSN顆粒電位為－27.2 mV，NH2-MSN電位為19.7 mV，電位明顯升高，進(jìn)一步表明顆粒表面修飾上了氨基。參考文獻(xiàn)[27]可以得出結(jié)論，微粒表面成功修飾了大量氨基，有大量氨基與適配體產(chǎn)生靜電結(jié)合，將熒光信號(hào)探針Rh6G封蓋在微粒的孔穴中，實(shí)現(xiàn)信號(hào)探針的富集，此時(shí)為檢測(cè)前體系，反應(yīng)較低但較穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度。

2.3 體系條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.3.1 T-2適配體濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

適配體封蓋濃度與時(shí)間是影響微粒表面適配體吸附量主要因素，而適配體吸附量直接影響了方法的檢測(cè)效果，當(dāng)表面附著當(dāng)適配體吸附量較少時(shí)，由于Rh6G無法被完全封蓋在孔隙之中，導(dǎo)致在洗脫外部染料時(shí)，部分孔隙中的染料由于缺乏適配體的阻擋散逸在洗脫液中，導(dǎo)致在反應(yīng)后熒光強(qiáng)度偏小，檢測(cè)性能較差；而當(dāng)適配體的吸附量過大時(shí)，即使核酸適配體與T-2毒素結(jié)合，可能仍有適配體封蓋在NH2-MSN的表面，從而影響Rh6G的釋放，使熒光強(qiáng)度偏低，檢測(cè)性能偏小。因此對(duì)于適配體封蓋濃度、時(shí)間的研究十分必要。

圖5 T-2毒素適配體濃度對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig. 5 Effect of T-2 toxin aptamer concentration on fluorescence intensity of reaction system

由圖5可知，隨著適配體濃度增加，各適配體濃度下的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可以推測(cè)出隨著適配體濃度的上升，首先更多的Rh6G被封蓋在微粒孔穴內(nèi)，而部分孔穴由于適配體濃度不足仍然無法封蓋導(dǎo)致洗脫后微粒中的染料數(shù)量偏低，當(dāng)適配體濃度增加時(shí)，首先所有的孔穴都被封蓋，反應(yīng)后熒光強(qiáng)度達(dá)到最高。但適配體濃度繼續(xù)增大時(shí)，即使適配體與目標(biāo)物T-2毒素結(jié)合，可能仍有少量的適配體封蓋在介孔顆粒的表面，從而影響了Rh6G的釋放，其熒光強(qiáng)度下降。因此，T-2核酸適配體封蓋濃度采用50 μmol/L。

2.3.2 T-2適配體封蓋時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

由圖6可知，隨著封蓋時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中的熒光強(qiáng)度首先上升，直到3 h時(shí)趨于平緩。這是由于隨著封蓋時(shí)間延長(zhǎng)，更多的適配體附著在微粒表面并將Rh6G染料被封蓋在孔隙之中，當(dāng)封蓋時(shí)間到達(dá)3 h后，體系中的適配體幾乎完全附著在納米材料表面，從而達(dá)到封蓋的目的，使得更多的Rh6G富集在納米材料內(nèi)，提高T-2檢測(cè)的靈敏度。因此，T-2核酸適配體封蓋時(shí)間采用3 h。

圖6 N2-MSN封蓋時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig. 6 Effect of capping time of NH2-MSN on fluorescence intensity of reaction system

2.3.3 毒素反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

如圖7所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，且熒光強(qiáng)度在2 h時(shí)達(dá)到最高。這是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的適配體與T-2毒素特異性結(jié)合，使得適配體從NH2-MSN表面脫離，釋放出孔穴中的Rh6G。當(dāng)反應(yīng)2 h后，T-2與適配體反應(yīng)完全，無法再使更多的適配體脫離，體系中的Rh6G濃度不再發(fā)生變化，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度也不再發(fā)生較大變化，因此采用2 h作為與毒素反應(yīng)時(shí)間。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig. 7 Effect of reaction time on fluorescence intensity of reaction system

2.4 體系檢測(cè)的線性范圍

以2.3節(jié)優(yōu)化條件對(duì)不同濃度的T-2毒素進(jìn)行檢測(cè)。以不同質(zhì)量濃度的T-2毒素為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖8所示，隨著T-2毒素質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，說明隨著體系中毒素的增加，更多的適配體與毒素發(fā)生特異性結(jié)合并離開微粒表面，從而導(dǎo)致更多的熒光染料被釋放，熒光強(qiáng)度不斷上升。從圖8可以看出，該分析方法在0～50 ng/mL或50～200 ng/mL之間具有較好的線性關(guān)系，當(dāng)T-2毒素質(zhì)量濃度在0～50 ng/mL之間時(shí)，其線性回歸方程為y＝9.750 2x＋64.939，R＝0.993，當(dāng)T-2毒素質(zhì)量濃度在50～250 ng/mL時(shí)，其線性回歸方程為y＝1.697 0x＋497.90，R＝0.977。該方法檢出限為1.25 ng/mL。實(shí)際應(yīng)用時(shí)可以根據(jù)不同毒素含量水平選擇不同線性范圍計(jì)算。

圖8 T-2毒素質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度關(guān)系Fig. 8 Correlation between T-2 toxin concentration and fluorescence intensity

2.5 特異性分析

圖9 方法特異性Fig. 9 Selectivity of the detection method for different toxins

圖9 顯示，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，體系對(duì)T-2毒素檢測(cè)效果最好，其他干擾毒素的響應(yīng)很低，甚至無響應(yīng)，說明T-2毒素適配體和本檢測(cè)體系對(duì)其他的毒素?zé)o法形成特異性識(shí)別，因此依然吸附在微粒表面，無法釋放在體系中，熒光強(qiáng)度變化值較小。因此，該方法對(duì)T-2毒素具有較好的選擇性，在使用過程中受其他毒素的影響較小，可以用于T-2毒素的特異性檢測(cè)。

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

按照1.3.7節(jié)方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，利用傳感器檢測(cè)的加標(biāo)回收率在85.8%～111.4%范圍內(nèi)，且相同質(zhì)量濃度下測(cè)得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差較小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.6%以內(nèi)，說明該檢測(cè)方法具有較好的準(zhǔn)確性和精密度，可用于真實(shí)復(fù)雜樣品中T-2毒素的測(cè)定。

表1 實(shí)際樣品加標(biāo)回收率（n＝3）Table 1 Recoveries of the method for spiked samples (n= 3)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立一種非標(biāo)記型基于介孔二氧化硅材料結(jié)合適配體封蓋的T-2毒素檢測(cè)技術(shù)，可有效避免目前主流的標(biāo)記型方法在使用標(biāo)記過程對(duì)抗體等免疫產(chǎn)品活性造成影響的問題。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本方法檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)較好的準(zhǔn)確性、精密性和特異性，具有高靈敏度，且線性范圍較寬是一種簡(jiǎn)單快速有效的非標(biāo)記型T-2毒素定量檢測(cè)方式。與目前我國(guó)主流快檢技術(shù)中的ELISA等標(biāo)記型檢測(cè)方法相比，本法檢測(cè)時(shí)間不超過2 h，檢測(cè)速度略高于ELISA方法約1 h；但本方法屬于非標(biāo)記型方法，且原理不需要競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，因此省去了檢測(cè)產(chǎn)品標(biāo)記過程，最大限度保護(hù)了免疫產(chǎn)品（抗體、適配體）活性，也避免了ELISA方法中酶標(biāo)抗原（酶標(biāo)毒素）的使用，對(duì)操作人員和環(huán)境更為安全；而且本方法在同等高靈敏度水平的前提下線性范圍明顯寬于ELISA，可有效用于各污染水平范圍的樣品測(cè)定。因此，本研究方法可以在較寬的線性范圍內(nèi)進(jìn)行T-2毒素快速靈敏的定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的該方法思路和材料具有其他毒素檢測(cè)應(yīng)用的普適性，可以通過不同毒素適配體和條件的研究進(jìn)行推廣應(yīng)用。