利用低場(chǎng)核磁共振及成像技術(shù)鑒別注水肉糜

蓋圣美，游佳偉，張雪嬌，張中會(huì)，劉登勇,2,

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

豬肉糜作為餃子、包子、香腸等傳統(tǒng)食品的原材料，在我國(guó)具有廣闊的市場(chǎng)，產(chǎn)量極大，其品質(zhì)好壞與對(duì)應(yīng)產(chǎn)品的質(zhì)量密切相關(guān)[1]。目前，由于國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上存在肉糜及其制品生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)不夠完善，相關(guān)監(jiān)管部門的管理力度欠缺等問(wèn)題，導(dǎo)致一些不法生產(chǎn)者在實(shí)際生產(chǎn)中為牟取利益，用劣質(zhì)原料取代優(yōu)質(zhì)原料，嚴(yán)重者直接往肉糜中注水、注膠等摻假現(xiàn)象，這種欺詐行為不僅損害了消費(fèi)者的利益，而且對(duì)消費(fèi)者的健康造成極大的安全隱患[2-4]。因此，建立準(zhǔn)確、靈敏、快速的肉類摻假鑒別方法，對(duì)保障肉類安全、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來(lái)，一些新興的方法逐漸被應(yīng)用于摻假肉類的檢測(cè)中，如微波法[5]、生物電阻抗技術(shù)[6]、激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)[7]、近紅外光譜成像技術(shù)[8-9]、多光譜成像技術(shù)[10-11]、高光譜成像技術(shù)[12-14]等，但這些方法存在檢測(cè)設(shè)備造價(jià)昂貴、對(duì)操作人員技術(shù)要求較高等弊端。與這些檢測(cè)方法相比，低場(chǎng)核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)不僅具有檢測(cè)速度快、對(duì)樣品無(wú)損傷、無(wú)需預(yù)處理、實(shí)時(shí)獲得數(shù)據(jù)等特點(diǎn)，同時(shí)還能夠反映樣品中水分子的存在形式及分布狀態(tài)[15-16]。

LF-NMR是利用氫原子在磁場(chǎng)內(nèi)受到一定頻率的射頻脈沖激發(fā)后，產(chǎn)生磁共振現(xiàn)象的物理學(xué)原理，雖然常溫下1H核在靜磁場(chǎng)中進(jìn)行了塞曼能級(jí)分裂，但低能級(jí)和高能級(jí)上的核數(shù)之差非常小，所以需要一定的射頻脈沖激發(fā)使其發(fā)生能級(jí)躍遷，以獲得樣品內(nèi)部質(zhì)子密度與分布，進(jìn)而分析得到樣品中水分分布狀態(tài)[17-18]。目前，該技術(shù)在摻假食品的檢測(cè)方面得以廣泛應(yīng)用?？蓪?duì)摻假牛奶進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，LF-NMR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛奶樣品中的水分子僅有一種結(jié)合狀態(tài)，且不同摻假比例的樣品中弛豫時(shí)間存在明顯差異；通過(guò)偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）模型可以對(duì)摻假比例進(jìn)行很好預(yù)測(cè)（均方根誤差（root mean square error，RMSE）為2.35%）[19]。Zhu Wenran等[20]利用LF-NMR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)摻假比例為10%～90%的花生油進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著摻假比例的增加，單組分弛豫時(shí)間（Tw）、多組分峰面積比（S21、S22）呈現(xiàn)線性變化；通過(guò)主成分回歸（principal component regression，PCR）法能明顯將正?；ㄉ秃蛽郊倩ㄉ蛥^(qū)分。Li Min等[21]利用LF-NMR和MRI技術(shù)結(jié)合PCR對(duì)注膠蝦進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，通過(guò)T2弛豫特性可以將注膠蝦從正常蝦中檢出，此外通過(guò)MRI技術(shù)能清楚觀測(cè)到所注射的膠體在蝦中的分布情況。雖然LF-NMR技術(shù)在肉類摻假檢測(cè)方面得以廣泛應(yīng)用，但多局限于對(duì)樣品的定性分析，在定量檢測(cè)方面還相對(duì)較少[22-26]。

本實(shí)驗(yàn)主要利用LF-NMR技術(shù)分析注水肉糜中水分分布的變化，并結(jié)合PCR法對(duì)注水肉糜進(jìn)行有效區(qū)分；通過(guò)建立回歸預(yù)測(cè)模型對(duì)注水肉糜摻假比例進(jìn)行預(yù)測(cè)；還利用MRI技術(shù)觀察注水肉糜中水分的空間分布情況，以期可直觀地對(duì)注水肉糜進(jìn)行區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉背最長(zhǎng)肌購(gòu)自天添食品有限公司，冷藏條件下帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

PQ001型低場(chǎng)核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；PL203型電子天平 英國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

隨機(jī)選擇10 條新鮮的豬背最長(zhǎng)肌，去除表面的脂肪及結(jié)締組織后，用絞肉機(jī)打碎成糜狀。原料肉不添加任何物質(zhì)，即為正常肉。肉糜總共分為135 份，每份100 g。取其中的90 份肉糜，分為6 組，以4%的梯度向肉糜中注入去離子水并充分混勻，配制注水量為0%、4%、8%、12%、16%、20%的模擬注水肉糜，建立預(yù)測(cè)模型。取剩余45 份肉糜，分為3 組，配制成5%、10%、15%的模擬注水肉糜，用來(lái)評(píng)估預(yù)測(cè)模型。

1.3.2 注水肉糜水分子弛豫信息采集

取2 g左右的肉糜樣品于核磁管中，把裝有樣品的核磁管加塞后放入低場(chǎng)核磁設(shè)備磁體腔中采集T2弛豫信息。LF-NMR測(cè)試參數(shù)為：質(zhì)子共振頻率22 MHz；重復(fù)采樣等待時(shí)間3.5 s；半回波時(shí)間150 μs；回波個(gè)數(shù)5000；重復(fù)掃描次數(shù)16。

1.3.3 核磁共振成像

不同比例注水肉糜的核磁成像實(shí)驗(yàn)，成像方式為冠狀面成像，脈沖序列為自旋回歸脈沖序列，具體參數(shù)為：中心頻率22 MHz，信號(hào)采樣點(diǎn)數(shù)400，采樣頻率20 kHz，重復(fù)采樣等待時(shí)間1 000 ms，回波時(shí)間6 ms，采樣層數(shù)1，采樣厚度2 mm，重復(fù)采樣次數(shù)8。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的肉糜樣品分為校準(zhǔn)集、驗(yàn)證集兩組，注水比例為0%、4%、8%、12%、16%、20%的樣品作為校準(zhǔn)集，建立預(yù)測(cè)模型。注水比例5%、10%、15%的樣品作為驗(yàn)證集，用來(lái)評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。以校準(zhǔn)集肉糜樣品的5 000 個(gè)回波峰點(diǎn)作為自變量x，水分含量作為因變量y，用Unscrambler 9.7數(shù)據(jù)分析軟件（version 9.7，CAMO software AS，Oslo，Norway）對(duì)自變量x和因變量y進(jìn)行PLSR、PCR擬合，得到PLSR、PCR預(yù)測(cè)模型[27]。把驗(yàn)證集樣品的5 000 個(gè)回波峰點(diǎn)代入PLSR、PCR預(yù)測(cè)模型，得到驗(yàn)證集中肉糜注水比例的預(yù)測(cè)值。預(yù)測(cè)模型的評(píng)價(jià)分別從決定系數(shù)R2和RMSE兩個(gè)方面考慮。R2和RMSE分別根據(jù)式（1）、（2）計(jì)算[28]：

式中：R2為決定系數(shù)；n為肉糜樣本數(shù)；yi為肉糜樣品真實(shí)水分含量；為yi的平均值；為肉糜樣品預(yù)測(cè)水分含量。

式中：RMSE為均方根誤差；yi為肉糜樣品真實(shí)水分含量；為預(yù)測(cè)水分含量；n為樣本數(shù)。

PCR是在保留原始變量主要信息的前提下，把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法[29]。通過(guò)將多變量的信息進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，使數(shù)據(jù)可視化。利用降維后的特征向量形成散點(diǎn)圖，直觀地反映樣品之間的差異。

用系統(tǒng)自帶反演軟件對(duì)CPMG衰減曲線進(jìn)行單組分反演得到注水肉糜的單組分弛豫時(shí)間，通過(guò)多組分反演得到注水肉糜中結(jié)合水、不易流動(dòng)水、自由水的弛豫時(shí)間、峰面積、峰面積比；用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析、PCR；通過(guò)Unscrambler 9.7數(shù)據(jù)分析軟件建立和驗(yàn)證PLSR、PCR模型；用Origin 8.5繪制相關(guān)圖形；用系統(tǒng)自帶成像軟件獲取注水肉糜的MRI圖像，隨后通過(guò)Matlab2016a數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)所得MRI圖像進(jìn)行偽彩處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同注水肉糜的CPMG衰減曲線

由圖1可以看出，正常肉糜、注水肉糜由于樣品內(nèi)部水分子數(shù)量及可移動(dòng)性的差異使CPMG曲線表現(xiàn)出不同的衰減特征[30]：正常肉糜由于水分含量少、水分子流動(dòng)性相對(duì)較弱，CPMG衰減曲線的信號(hào)強(qiáng)度較弱且呈衰減速率快（曲線曲率大）的特點(diǎn)；肉糜注水后其水分含量增加（質(zhì)子數(shù)隨之增加）、水分子流動(dòng)性增強(qiáng)，CPMG衰減曲線的信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)且呈衰減速率慢（曲線曲率?。┑奶攸c(diǎn)。正常肉糜、注水肉糜CPMG衰減曲線的差異主要集中在0～600 ms范圍內(nèi)，說(shuō)明這是區(qū)分正常肉糜、注水肉糜的重要信號(hào)區(qū)域。在該區(qū)域內(nèi)，隨著注水比例的增加，衰減曲線的曲率隨著注水比例的增加逐漸減小，信號(hào)完全衰減的時(shí)間也隨之延長(zhǎng)，水分子的流動(dòng)性增強(qiáng)。

圖1 不同注水比例肉糜的CPMG衰減曲線Fig. 1 CPMG attenuation curves of ground meat samples with different proportions of injected water

2.2 注水對(duì)肉糜單組分弛豫時(shí)間的影響

圖2 注水比例對(duì)肉糜單組分弛豫時(shí)間的影響Fig. 2 Effect of different proportions of injected water on singlecomponent relaxation time in ground meat samples

由圖2可以看出，隨著注水比例的增加，肉糜的組分弛豫時(shí)間Tw呈線性增加的趨勢(shì)（R2＝0.953 5）。Tw增加主要是由于去離子水的摻入，使得肉糜中的水分含量增加、水分子流動(dòng)性逐漸增強(qiáng)，從而導(dǎo)致肉糜整體的弛豫過(guò)程變慢，弛豫時(shí)間延長(zhǎng)。

2.3 注水比例對(duì)肉糜多組分弛豫特性的影響

由圖3可以看出，正常肉糜、注水肉糜多組分弛豫圖譜上均存在4 個(gè)明顯的水分群，T2弛豫時(shí)間分別在0.1～1、1～10、10～100、100～1 000 ms范圍內(nèi)，分別對(duì)應(yīng)肉糜中的緊密結(jié)合水（T2b）、結(jié)合水（T21）、不易流動(dòng)水（T22）、自由水（T23）[31-32]，與注膠蝦[21]、循環(huán)凍融海參[32]中的水分分布一致。

圖3 不同注水比例肉糜的多組分?jǐn)M合橫向弛豫圖譜Fig. 3 Distribution of multi-exponentially fitted transverse relaxation time spectra of ground meat samples with different proportions of injected water

圖4 不同注水比例對(duì)肉糜弛豫時(shí)間（A）和峰面積比（B）的影響Fig. 4 Effect of different proportions of injected water on relaxation time (A) and peak area ratio (B) in ground meat samples

由圖4A可以看出，相對(duì)于正常肉糜，注水肉糜的T2b值未發(fā)生顯著變化（P＜0.05），而T21、T22、T23均顯著增加。這說(shuō)明緊密結(jié)合水的流動(dòng)性在注水后未發(fā)生明顯改變，而結(jié)合水、不易流動(dòng)水、自由水在注水后流動(dòng)性明顯增強(qiáng)。P2b、P21、P22、P23分別為T2b、T21、T22、T23所對(duì)應(yīng)峰的積分面積占總積分峰面積的百分比，由圖4B可以看出，在所有處理組中，P2b、P21值最小，注水前后均為2%左右，對(duì)肉中水分分布的影響可以忽略不計(jì)。所有組的P22值均在85%以上，說(shuō)明不易流動(dòng)水是肉糜中水分子的主要存在形式[33]。相對(duì)于正常肉糜的P22值，各注水組的P22值均有所減小，其中當(dāng)注水比例大于8%時(shí)，P22值減小顯著（P＜0.05）。P23的變化與P22相反，正常肉糜的P23值為2.21%，注水后肉糜的P23值增加了3.16%～11.84%，其中當(dāng)注水比例大于8%時(shí)，P22值相對(duì)于正常肉糜增加顯著（P＜0.05）。

2.4 PCR結(jié)果

圖5 不同注水比例肉糜主成分得分圖Fig. 5 Principal component score plots of ground meat samples with different proportions of injected water

為了區(qū)分正常肉糜和注水肉糜，通過(guò)PCR對(duì)不同比例注水肉糜的核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，得到PC1、PC2，如圖5所示。PC1、PC2的貢獻(xiàn)率分別為88.69%、10.41%，而累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.10%。從不同注水比例肉糜在得分圖上的分布看，正常肉糜與注水量較少的肉糜（4%、8%）分布在主成分得分圖的左側(cè)區(qū)域，而注水量較高的肉糜（12%、16%、20%），則分布在得分圖右側(cè)區(qū)域。且隨著注水比例的增加，肉糜PC1的得分逐漸增加，而PC2得分則是先增加后減小?？梢哉f(shuō)明，注水后的肉糜可以通過(guò)PCR的方法從正常豬肉中區(qū)分出來(lái)。與本實(shí)驗(yàn)類似結(jié)果有，Li Min等[21]利用LF-NMR及MRI技術(shù)研究了注膠蝦，結(jié)果表明注射不同濃度明膠的對(duì)蝦在主成分得分圖上可以得到很好地區(qū)分；Santos等[19]利用LFNMR技術(shù)分析了摻假牛奶，結(jié)果表明不同摻假比例的牛奶可以在主成分得分圖上得到區(qū)分；Zhu Wenran等[20]利用LF-NMR技術(shù)結(jié)合PCR、判別分析的方法研究了花生油摻假，結(jié)果表明花生油摻入不同比例的大豆油、菜籽油或棕櫚油后都可以從主成分得分圖上得到區(qū)分。

2.5 利用多元回歸模型預(yù)測(cè)肉糜的注水比例

由圖6、7可以看出，PLSR預(yù)測(cè)模型校準(zhǔn)集和PCR模型校準(zhǔn)集的都是0.97，決定系數(shù)均在0.95以上，且RMSE值均在1.5%以下，說(shuō)明不同注水比例肉糜的預(yù)測(cè)模型擬合結(jié)果較好。PLSR、PCR驗(yàn)證集結(jié)果表明，不同注水比例肉糜的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的決定系數(shù)均在0.90以上，RMSE值均不超過(guò)1.50%，這說(shuō)明LF-NMR結(jié)合PLSR、PCR模型可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)注水肉糜中增加的水分。通過(guò)進(jìn)一步比較PLSR、PCR模型發(fā)現(xiàn)，PLSR、PCR模型驗(yàn)證集RMSE分別為1.27%、1.25%，相差僅為0.02%，說(shuō)明PLSR、PCR模型的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。Zang Xiu等[27]利用LF-NMR技術(shù)，通過(guò)建立PLSR、PCR預(yù)測(cè)模型的方法，對(duì)小黃魚(yú)中的水分含量和脂肪含量做了預(yù)測(cè)分析，同樣也發(fā)現(xiàn)PLSR模型與PCR模型的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

圖6 注水肉糜PLSR模型建立和驗(yàn)證的散點(diǎn)分布圖Fig. 6 Scatter plots of calibration and prediction sets for PLSR model

圖7 注水肉糜PCR模型建立和驗(yàn)證的散點(diǎn)分布圖Fig. 7 Scatter plots of calibration and prediction sets for PCR model

2.6 注水肉糜質(zhì)子加權(quán)成像

圖8 注水肉糜質(zhì)子加權(quán)成像Fig. 8 Proton density-weighted images of water-injected ground meat

通過(guò)質(zhì)子密度加權(quán)成像的方法對(duì)注水肉糜中的水分分布情況進(jìn)行可視化處理。由于質(zhì)子密度加權(quán)成像的信號(hào)強(qiáng)度取決于樣品中的質(zhì)子數(shù)，而水分子又是肉糜中質(zhì)子的主要來(lái)源，因此，樣品中的水分含量越高，質(zhì)子密度圖像的信號(hào)越強(qiáng)，MRI圖像（未做偽彩處理的原始圖像）的亮度也越高。通過(guò)對(duì)MRI原始圖像進(jìn)行偽彩處理，可清晰觀測(cè)到水分子在肉糜中的分布情況（圖8）。圖中紅色區(qū)域表示核磁信號(hào)最強(qiáng)、水分含量最高；藍(lán)色區(qū)域表示核磁信號(hào)最弱、水分含量最低；黃色區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度/水分含量則介于紅色和藍(lán)色區(qū)域之間?？梢钥闯?，正常肉糜的MRI圖像呈藍(lán)色，表明正常肉糜的水分含量較低。注水肉糜中，注水比例為4%～12%時(shí)，肉糜的MRI圖像呈淺藍(lán)色或青色，表明水分含量相比正常肉糜有所增加；注水比例為16%～20%時(shí)，肉糜的MRI圖像呈黃色或紅色，表明水分含量相比正常肉糜明顯增加。此外，對(duì)單個(gè)成像結(jié)果進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，正常肉糜的MRI圖像顏色呈藍(lán)色、顏色較為單一，說(shuō)明正常肉糜中的水分分布較為均勻，而注水肉糜的MRI圖像左右兩側(cè)呈藍(lán)色，中心位置呈紅色或黃色，說(shuō)明注射的水分在肉糜各部位的分布有所差異。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用LF-NMR及MRI技術(shù)對(duì)注水肉糜做檢測(cè)分析，對(duì)不同注水比例肉糜的CPMG衰減曲線分別進(jìn)行單組分?jǐn)M合、多組分?jǐn)M合處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單組分Tw隨著注水比例的增加呈線性增加（R2＝0.953 5）；多組分?jǐn)M合結(jié)果表明，正常肉糜、注水肉糜中均存在4 種水分子，分別對(duì)應(yīng)肉糜中的緊密結(jié)合水、結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不易流動(dòng)水、自由水弛豫時(shí)間相對(duì)于正常肉糜均顯著增加（P＜0.05）。通過(guò)PCR法對(duì)注水肉糜的核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，得到了兩個(gè)主成分PC1和PC2，貢獻(xiàn)率分別為88.69%、10.41%，在主成分得分圖上，正常肉糜、不同比例注水肉糜得到了明顯區(qū)分。注水比例預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PLSR模型與PCR模型的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致RMSE為1.27%；RMSE為1.25%）。MRI結(jié)果表明，隨著注水比例的增加，肉糜偽彩圖由藍(lán)色逐漸向黃色、紅色轉(zhuǎn)變，以此可直觀地對(duì)注水肉糜進(jìn)行區(qū)分。綜上所述，利用LF-NMR及MRI技術(shù)可作為一種檢測(cè)注水肉糜的有效方法。