蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

程婕 徐柳根 邱濤濤

摘要 膜聯(lián)蛋白（Annexin）是一種磷脂結(jié)合蛋白，目前有關(guān)蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白家族的研究較少。對(duì)蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白家族基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，確定了膜聯(lián)蛋白家族基因的數(shù)量、結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系。對(duì)蒺藜苜蓿的幼苗分別進(jìn)行干旱、鹽和冷處理，并利用高通量測(cè)序?qū)?0個(gè)蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明：在干旱脅迫下，3個(gè)基因表達(dá)下調(diào);在鹽脅迫下，5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，4個(gè)基因表達(dá)上調(diào);在冷脅迫下，3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中，MtANX3在各脅迫下均發(fā)生了下調(diào)。綜上所述，非生物脅迫影響了蒺藜苜蓿模聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 蒺藜苜蓿;膜聯(lián)蛋白;非生物脅迫;基因表達(dá)

中圖分類號(hào) S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）21-0115-04

Abstract Annexin is a phospholipid binding protein. There are few studies on the Medicago truncatula annexin family. In this paper，bioinformatics analysis of M.truncatula ?annexin family genes was carried out，and the number，domain and evolutionary relationship of annexin family genes were determined. The M.truncatula seedlings were treated with drought，salt and cold stress，and the expression of 20 M.truncatula annexin genes was analyzed by highthroughput sequencing. The results showed that under drought stress，3 genes were downregulated. Under salt stress，5 genes were downregulated and 4 genes were upregulated. Under cold stress，3 genes were downregulated. Among them，MtANX3 were all downregulated under various stresses. In summary，abiotic stress affects the expression of M.truncatula annexin family genes.

Key words Medicago truncatula;Annexin;Abiotic stress;Gene expression

基金項(xiàng)目 江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ170276）。

作者簡(jiǎn)介 程婕（1994—），女，江西贛州人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 *通信作者，教授，從事植物分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2019-11-28;修回日期 2019-12-18

膜聯(lián)蛋白是在1978年發(fā)現(xiàn)的一種Ca2+和磷脂結(jié)合型蛋白[1]，后續(xù)發(fā)現(xiàn)其能明顯促進(jìn)依賴Ca2+的胞吐作用[2-3]。膜聯(lián)蛋白是一種多功能性蛋白，在生物體內(nèi)分布很廣，它可以分布在除酵母菌外的所有真核生物中。而根據(jù)生物種類的不同，膜聯(lián)蛋白可以分為A、B、C、D、E五類。脊椎動(dòng)物蛋白是A類，無(wú)脊椎動(dòng)物蛋白屬于B類，真菌和一些單核細(xì)胞生物被歸屬于C類，D類包含植物膜蛋白，原核生物屬于E類[4]。不同膜聯(lián)蛋白基因的表達(dá)模式以及蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位具有特異性[5-7]。

膜聯(lián)蛋白在生物體內(nèi)具有許多重要作用，但目前的研究主要集中在動(dòng)物和植物上。在動(dòng)物體內(nèi)，已有研究證明，膜聯(lián)蛋白具有參與細(xì)胞分泌[8]、生物膜的形成和調(diào)節(jié)離子通道的作用，還與細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)有關(guān)[9]。目前，有多個(gè)研究膜聯(lián)蛋白在癌癥方面作用的內(nèi)容，如發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)，膜聯(lián)蛋白通過(guò)纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和腫瘤的侵襲[10-11]。

在植物方面，膜聯(lián)蛋白基因在植物體生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)[12]，也發(fā)揮了各種作用：參與細(xì)胞分泌、胞吐作用，與Ca2+形成離子通道，有一些還具有酶的作用[13-14]。植物膜聯(lián)蛋白還參與調(diào)控植物代謝和生長(zhǎng)發(fā)育并可以協(xié)同調(diào)節(jié)抗旱、耐鹽等多種抗逆反應(yīng)[15-17]，在干旱、冷害和高鹽等非生物脅迫下，參與調(diào)控植物生命活動(dòng)，且膜聯(lián)蛋白的表達(dá)調(diào)控會(huì)因物種的不同而出現(xiàn)差異[18]。還有研究表明植物膜聯(lián)蛋白與根毛和花粉的生長(zhǎng)發(fā)育以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)系[19-20]。

筆者鑒定了蒺藜苜蓿中膜聯(lián)蛋白家族成員，并對(duì)其結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。最后，通過(guò)高通量測(cè)序分析了該家族基因在高鹽、干旱和冷害脅迫下的表達(dá)情況。這一研究初步闡明了蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白家族的脅迫表達(dá)情況，將有助于在豆科植物中解析膜聯(lián)蛋白在非生物脅迫下發(fā)揮的潛在調(diào)節(jié)作用，為該家族的基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 苜蓿培養(yǎng)與樣品處理

用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培苜蓿4周。培養(yǎng)條件：光周期14/10 h（日/夜），溫度22～24 ℃，光合有效輻射200 μmol/（m2·s）。分別進(jìn)行干旱處理（將小苗置于濾紙），鹽處理（300 mmol/L NaCl溶液）和冷處理（4 ℃）0、2、6、12 h。TRIzol法提取樣品總RNA，送公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2 苜蓿膜聯(lián)蛋白家族基因鑒定

在PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥pfam.xfam.org） 獲得蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白基因家族的結(jié)構(gòu)域模型（PF00191），利用Hmmer 3.0程序（http：∥hmmer.janelia.org/）進(jìn)行比對(duì)、篩選。將篩選得到的候選基因到PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)最終的膜聯(lián)蛋白。

1.3 苜蓿膜聯(lián)蛋白基本信息和結(jié)構(gòu)域分析

在蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss-Prot（http：∥www.uniprot.org/uniprot/？query=reviewed%3Ayes） 中獲得膜聯(lián)蛋白家族基因的基本信息，包括等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量等。從PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得這20個(gè)基因的結(jié)構(gòu)域圖譜。

1.4 構(gòu)建進(jìn)化樹和基因芯片圖譜

首先，用ClustalW程序?qū)δぢ?lián)蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，然后通過(guò)MEGA7程序，用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹，步長(zhǎng)設(shè)為1 000。從苜蓿芯片網(wǎng)站（https：∥mtgea.noble.org/v2/index.php）獲得已知芯片信息，用MeV4.0做成熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白的基本信息

通過(guò)HMMER軟件在苜蓿蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)搜索，然后通過(guò)PFAM網(wǎng)站確定，共發(fā)現(xiàn)了20個(gè)膜聯(lián)蛋白。蛋白的氨基酸數(shù)分布在96～320，其中，MtANX14氨基酸數(shù)最少，只有96個(gè);MtANX10最多有320個(gè)。蛋白的分子量分布在10.86～36.83 kD，而等電點(diǎn)分布在4.67～9.43，大部分等電點(diǎn)偏中性，等電點(diǎn)最大的是MtANX20，最小的是MtANX1（表1）。通過(guò)PFAM搜索發(fā)現(xiàn)，這20個(gè)蛋白質(zhì)都含有ANX結(jié)構(gòu)域，而不含其他結(jié)構(gòu)域。

2.2 膜聯(lián)蛋白的進(jìn)化樹分析

對(duì)蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白的20個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)分析。用ClustalW程序校對(duì)得到膜聯(lián)蛋白的氨基酸序列，使用MEGA7.0用Neighbor-Joining格式構(gòu)建進(jìn)化樹（圖1）。從圖中可以看出，MtANX5和MtANX17，MtANX18和MtANX19，MtANX1和MtANX9，MtANX3和MtANX11，MtANX12和MtANX13，這5對(duì)蛋白質(zhì)之間的親緣關(guān)系很近。

2.3 膜聯(lián)蛋白家族基因在非生物脅迫下的差異性表達(dá)

為了探明膜聯(lián)蛋白基因在非生物脅迫下的表達(dá)，分別對(duì)幼苗進(jìn)行干旱處理，鹽處理和冷處理0、2、6、12 h，提取總RNA，進(jìn)行高通量測(cè)序。將脅迫處理與非處理的樣品進(jìn)行比較，如果不同脅迫處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化一致，并且至少有一個(gè)滿足條件|log2N|>1，就把它定義為差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示：MtANX4、MtANX9、MtANX15和MtANX16在鹽脅迫中上調(diào)（表3）;MtANX3、MtANX5和MtANX10在干旱脅迫中下調(diào)（表2）;MtANX1、MtANX3、MtANX5、MtANX13和MtANX18在鹽脅迫中下調(diào)（表3）; MtANX3、MtANX7和MtANX19在低溫脅迫中下調(diào)（表4）。

2.4 膜聯(lián)蛋白基因組織表達(dá)分析 為了分析苜蓿中膜聯(lián)蛋白基因組織表達(dá)，從已知芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中下載數(shù)據(jù)，利用Mev4.0構(gòu)建熱圖。結(jié)果顯示：MtANX14和MtANX17在植物體各部分的表達(dá)都較低，MtANX5 、MtANX18、MtANX19和 MtANX20在植物的根和種子中表達(dá)較高，MtANX9在各組織中表達(dá)都較高。MtANX6、MtANX7、MtANX18、MtANX19和 MtANX20在根瘤中表達(dá)較高，而MtANX14和MtANX17在根瘤中表達(dá)很低（圖2）。

3 討論與展望

通過(guò)生物信息分析，首次鑒定了20個(gè)蒺藜苜蓿膜聯(lián)蛋白。這20個(gè)蛋白的基本信息顯示大部分蛋白的氨基酸數(shù)為300多個(gè)，并且等電點(diǎn)偏中性。這些特征可能與膜聯(lián)蛋白發(fā)揮的細(xì)胞分泌、胞吐作用、與Ca2+形成離子通道等功能相關(guān)。通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)這個(gè)家族蛋白的結(jié)構(gòu)域非常單一，只有ANX結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)果說(shuō)明該家族蛋白可能在功能上比較保守。通過(guò)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)這20個(gè)膜聯(lián)蛋白有5組親緣關(guān)系非常相近，這說(shuō)明可能膜聯(lián)蛋白存在著功能的冗余。

進(jìn)一步通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)這些蛋白基因中有很多受到非生物脅迫的調(diào)控。在干旱脅迫下，3個(gè)基因表達(dá)下調(diào);在鹽脅迫下，5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，4個(gè)基因表達(dá)上調(diào);在冷脅迫下，3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中，MtANX3在各脅迫下均發(fā)生了下調(diào)。說(shuō)明非生物脅迫對(duì)膜聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)有影響。

首次在豆科模式植物苜蓿膜中鑒定了膜聯(lián)蛋白家族基因。這一研究將有助于進(jìn)一步在豆科植物中闡明膜聯(lián)蛋白在非生物脅迫下發(fā)揮的潛在的調(diào)節(jié)功能。

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