葡萄NAC轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學分析

劉佳鑫　侯和勝

摘 要：NAC基因家族是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物生長發(fā)育、逆境脅迫應答等反應。通過對71種葡萄NAC蛋白與22種其他物種NAC蛋白的生物信息學分析，對與非生物逆境脅迫相關的12種NAC蛋白的染色體定位、理化性質(zhì)、親/疏水性、二級結構及亞細胞定位等進行了分析和預測。結果顯示，葡萄NAC蛋白共分為5大類，與非生物逆境相關的NAC蛋白聚集在第Ⅲ類。分析顯示不同NAC蛋白間氨基酸、疏水性及穩(wěn)定性之間存在一定差異，二級結構主要為隨機卷曲等。分析結果可為進一步研究通過葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機制提供參考。

關鍵詞：葡萄；非生物脅迫；NAC轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學

中圖分類號： 5663.1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.008

提高葡萄對非生物脅迫的耐受性對提高葡萄的產(chǎn)量具有重要作用。很多轉(zhuǎn)錄因子在改進植物脅迫耐受性方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類蛋白家族，諸多研究顯示[3-5]，NAC家族成員能夠激活非生物脅迫相應基因，提高植物對非生物脅迫的耐受性[6-7]。Fang等[8]系統(tǒng)地分析了水稻中的140個NAC或NAC類基因，并將其劃分為5大組，逆境脅迫相關的NAC聚在第3組。本研究利用生物信息學的方法從葡萄基因組水平上對NAC基因家族進行分類，并對與非生物脅迫相關的NAC基因進行了分析，為進一步研究葡萄NAC類轉(zhuǎn)錄因子提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

通過北京大學植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（TFDB， http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）獲得其中收錄的71條葡萄NAC基因，依次命名為VvNAC1-71。通過美國生物信息技術中心（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索相應資料。獲得已發(fā)表的其它物種的NAC蛋白作為參考標準，包括16種逆境脅迫基因（ATAF1， CsNAC， GmNAC2， RD26， ANAC055， ANAC019， AhNAC2， AhNAC3， AmNAC1， SsNAC23， SNAC1， SNAC2， TaNAC3， ZmNAC1， OsNAC6， StNAC）和6種生長發(fā)育相關基因（OsNAC7， NAC1， CUC3 NAM， GRAB2， NAC2）。

1.2 方 法

1.2.1 NAC蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹構建 利用clustal軟件進行氨基酸多重序列比對，利用MEGA4中遺傳距離建樹法的相鄰鏈接法（NJ）進行建樹，對生成的進化樹進行Bootstrap（自引導）校正，生成系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.2 NAC基因結構分析及染色體定位 通過葡萄基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/grape）進行染色體定位，在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）中搜索保守結構域。

1.2.3 NAC基因一級結構及理化性質(zhì)分析 利用ExPaSy提供的ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）進行理化性質(zhì)分析。利用ProtScale程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）對翻譯后的氨基酸序列做疏水性分析。磷酸化和去磷酸化是細胞內(nèi)信號傳導的重要方式，利用NetPhos2.0 Server程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）做磷酸化位點分析，對蛋白序列中的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種氨基酸殘基可能形成的磷酸化位點作出預測。

1.2.4 二級結構分析及亞細胞定位 運用PBIL LYON-GERLAND信息庫（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl page=/NPSA/npsa_hnn.html）對蛋白質(zhì)序列進行二級結構預測（Secondary structure prediction）。通過WoLF PSORT工具（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）基于其氨基酸序列預測蛋白質(zhì)亞細胞定位點。

2 結果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)生樹

通過系統(tǒng)進化分析，葡萄NAC轉(zhuǎn)錄因子家族共分5個大類（圖1），每大類也各有不同。第Ⅰ大類包含17個葡萄NAC基因，在6種發(fā)育相關的NAC基因中，除擬南芥NAC2[9]基因位于第Ⅵ大類外全部位于第Ⅰ大類，推斷第Ⅰ大類NAC基因與葡萄的生長發(fā)育相關。非生物逆境脅迫相關NAC基因全部位于第Ⅲ大類，位于此類的葡萄NAC基因共有12個，其中VvNAC45與VvNAC56兩個基因同源性相對較低。其余NAC基因位于第Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ大類。其中第Ⅳ大類NAC基因數(shù)量最多。推測擬南芥NAC2基因位于第Ⅳ大類的原因可能是其序列特異性不強或參與逆境與發(fā)育兩種生命活動。

2.2 基因結構分析及染色體定位

葡萄71個NAC基因在染色體上數(shù)量分布不均勻，其中第5、第9號染色體未找到NAC基因。位于第19號染色體上的NAC基因數(shù)量最多（19個）。非生物脅迫相關NAC基因散亂分布在1、4、6、7、8、12、18、19共8條染色體上，未表現(xiàn)出集中性，VvNAC3基因未能定位到染色體上。葡萄的NAC基因N端都具有NAC保守結構域。

2.3 一級結構及理化性質(zhì)分析

磷酸化位點分析顯示，葡萄非生物逆境脅迫相關NAC蛋白中絲氨酸磷酸化位點最多，酪氨酸磷酸化位點次之。通過ProtParam程序進行理化性質(zhì)分析，結果顯示非逆境脅迫相關NAC蛋白既有酸性氨基酸，又有堿性氨基酸。從蛋白質(zhì)穩(wěn)定性上看，VvNAC26，VvNAC 42，VvNAC45為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白（表1）。

2.4 二級結構分析及亞細胞定位

在線二級結構預測結果顯示，非生物逆境脅迫NAC蛋白中隨機卷曲的比例很高（58.59%～70.35%），它起著鏈接其他二級結構原件的作用。此外，主要的二級結構原件為α螺旋（14.07%～30.81%）和延伸鏈（9.89%～20.83%），主要位于α螺旋和隨機卷曲之間。在線WOLF PSORT對蛋白亞細胞定位預測顯示，非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。

3 結論與討論

對葡萄71種NAC蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)生樹構建，染色體定位、理化性質(zhì)分析，二級結構預測及亞細胞定位等方面的分析。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，所有的非生物逆境脅迫相關NAC蛋白都聚為一類，這與其他NAC類蛋白的研究結果相符合[10-11]，也暗示在NAC家族成員中，脅迫相應NAC類轉(zhuǎn)錄因子之間具有密切聯(lián)系。非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。由此推斷，具有相近生物學功能的NAC蛋白更可能定位于相同的亞細胞結構，這與其發(fā)揮特定生物學功能密切相關。非生物逆境脅迫類NAC蛋白既有其共同點也有不同點，這些分析與研究結果，有助于對葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機制開展進一步研究。

參考文獻：

[1] Haake V， Cook D， Riechmannjl， et al.Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis [J]. Plant Physiology，2002，130（2）：639.

[2] Abeh， Yamaguchi-shinozaki K， Urao T， et al. Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs in drought and abscisic acid—regulated gene expression [J]. The Plant Cell Online， 1997，9（10）：1859.

[3] Nuruzzaman M， Manimekalai R， Sharoni A M， et al. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J]. Gene，2010， 465：30-44.

[4] Kazuo N， Hironori T， Junya M， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1 819：97-103.

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[7] Tranlsp， Nakashima K. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter [J]. The Plant Cell Online， 2004，16（9）：2 481.

[8] Fang Y， You J， Xie K， et al. Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice[J]. Molecular Genetics and Genomics，2008， 280（6）：547-563.

[9] He X J， Mu R L， Cao W H， et al. AtNAC2， a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways， is involved in salt stress response and lateral root development[J]. The Plant Journal ，2005， 44： 903-916.

[10] Ooka H，Satoh K，Dol K， et al.Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana [J]. DNA Research， 2003，10（6）：239.

[11] Nuruzzaman M， Manimekalai R， Sharoni A M， et al.Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J]. Gene，2010， 465（1/2）：30-44.

2.4 二級結構分析及亞細胞定位

在線二級結構預測結果顯示，非生物逆境脅迫NAC蛋白中隨機卷曲的比例很高（58.59%～70.35%），它起著鏈接其他二級結構原件的作用。此外，主要的二級結構原件為α螺旋（14.07%～30.81%）和延伸鏈（9.89%～20.83%），主要位于α螺旋和隨機卷曲之間。在線WOLF PSORT對蛋白亞細胞定位預測顯示，非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。

3 結論與討論

對葡萄71種NAC蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)生樹構建，染色體定位、理化性質(zhì)分析，二級結構預測及亞細胞定位等方面的分析。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，所有的非生物逆境脅迫相關NAC蛋白都聚為一類，這與其他NAC類蛋白的研究結果相符合[10-11]，也暗示在NAC家族成員中，脅迫相應NAC類轉(zhuǎn)錄因子之間具有密切聯(lián)系。非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。由此推斷，具有相近生物學功能的NAC蛋白更可能定位于相同的亞細胞結構，這與其發(fā)揮特定生物學功能密切相關。非生物逆境脅迫類NAC蛋白既有其共同點也有不同點，這些分析與研究結果，有助于對葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機制開展進一步研究。

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2.4 二級結構分析及亞細胞定位

在線二級結構預測結果顯示，非生物逆境脅迫NAC蛋白中隨機卷曲的比例很高（58.59%～70.35%），它起著鏈接其他二級結構原件的作用。此外，主要的二級結構原件為α螺旋（14.07%～30.81%）和延伸鏈（9.89%～20.83%），主要位于α螺旋和隨機卷曲之間。在線WOLF PSORT對蛋白亞細胞定位預測顯示，非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。

3 結論與討論

對葡萄71種NAC蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)生樹構建，染色體定位、理化性質(zhì)分析，二級結構預測及亞細胞定位等方面的分析。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，所有的非生物逆境脅迫相關NAC蛋白都聚為一類，這與其他NAC類蛋白的研究結果相符合[10-11]，也暗示在NAC家族成員中，脅迫相應NAC類轉(zhuǎn)錄因子之間具有密切聯(lián)系。非生物脅迫相關NAC蛋白全部定位于細胞核。由此推斷，具有相近生物學功能的NAC蛋白更可能定位于相同的亞細胞結構，這與其發(fā)揮特定生物學功能密切相關。非生物逆境脅迫類NAC蛋白既有其共同點也有不同點，這些分析與研究結果，有助于對葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機制開展進一步研究。

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