雜交構(gòu)樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)的研究

顏慧萍， 高正龍， 陳譚星， 曹力凡， 王品勝

（河南省高新技術(shù)實業(yè)有限公司，鄭州 450000）

構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）屬于蕁麻目［1］?？茦?gòu)樹屬植物，常見于多年生落葉喬木或灌木［2-3］. 全世界范圍內(nèi)查明該屬有5種，主要分布于亞洲東部的及太平洋島嶼溫帶和熱帶地區(qū)，目前我國發(fā)現(xiàn)有4種，即構(gòu)樹、小構(gòu)樹、藤構(gòu)和落葉花桑［4］. 構(gòu)樹對不同環(huán)境適應(yīng)能力好，是一種速生喬木，10～20年即可成材［5-6］. 雜交構(gòu)樹葉片表面平滑，與傳統(tǒng)意義上的老構(gòu)樹有所不同，以其枝干、葉片、樹汁為原料用來制成茶葉、藥品、服裝以及營養(yǎng)品和護膚品等，構(gòu)樹食品還被發(fā)現(xiàn)有奇特的功效［7］. 種植雜交構(gòu)樹投資相對較少，企業(yè)大多可在短期內(nèi)收獲較高效益，因此具有良好的市場需求. 構(gòu)樹種子苗量化生產(chǎn)是其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的目標，構(gòu)樹的繁殖方法主要有種子繁殖、扦插繁殖和快速繁殖［8］. 構(gòu)樹樹葉富含大量粗蛋白和類黃酮素，是優(yōu)質(zhì)植物蛋白飼料，可用于各種動物的養(yǎng)殖，以構(gòu)樹制飼料是未來飼料市場發(fā)展的一大趨勢，其綜合營養(yǎng)成分超過豆類植物，還可代替發(fā)酵大豆粕、魚粉等動植物蛋白質(zhì)，因此構(gòu)樹被專家稱為神奇的養(yǎng)殖之星［9］.

為了能保持雜交構(gòu)樹的優(yōu)良性狀，同時滿足大量繁殖的種苗要求，因此需要大力尋找一種低成本并且高效快速的繁殖方式. 目前我國雜交構(gòu)樹繁殖技術(shù)依然比較落后，以扦插為主，這些方法限制了雜交構(gòu)樹繁殖的速度，不能滿足市場需求. 雜交構(gòu)樹組培快繁技術(shù)是最簡單、便捷、快速的方法，能有效縮短雜交構(gòu)樹的生長發(fā)育周期. 萬文等［10］研究了雜交構(gòu)樹莖段組培快速繁殖體系，但目前以莖段組培繁殖的系數(shù)不高，魏會琴等［11］側(cè)重研究構(gòu)樹葉片組培體系激素配比，本文從構(gòu)樹葉片組培光照條件、消毒方式及不同激素配比的培養(yǎng)基方面入手，篩選出雜交構(gòu)樹葉片愈傷誘導(dǎo)的最佳條件，以期為雜交構(gòu)樹快繁體系的建立及良種性狀的保存和遺傳轉(zhuǎn)化提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

2019年10月中下旬，在河南省蘭考構(gòu)樹基地采集10～15 cm帶有腋芽的1年生雜交構(gòu)樹（科構(gòu)101）枝條，用濕毛巾包裹帶回實驗室，保存在4 ℃冰箱內(nèi)，每日早晚噴水2次，以保持枝條濕潤. 低溫處理3 d后把修剪枝條成8 cm長左右的樹枝，插入瓶中水培，放置在25 ℃、12 h/d光照條件下催芽，2 d換水1次，約15 d后枝條開始長葉.

1.2 儀器及耗材

儀器：超凈臺（YJ-VS-2型雙人垂直超凈工作臺）、電磁爐、玻璃棒、鑷子、手術(shù)刀.

耗材：MS培養(yǎng)基（合肥巴斯夫生物科技有限公司）、瓊脂（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、蔗糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、鹽酸、75%乙醇、去離子水、6-BA和NAA（合肥巴斯夫生物科技有限公司）. 植物激素6-BA和NAA分別用0.1 mol/L NaOH溶解后配制成0.1 g/L母液備用.

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度（25±2）℃；相對濕度約50%；暗培養(yǎng).

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013整理數(shù)據(jù).

愈傷組織誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%.

褐化率=（褐化數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對雜交構(gòu)樹葉片愈傷誘導(dǎo)的影響

待新生枝條長至1 cm 左右時，取葉片（保留葉柄）在加洗滌劑的無菌水中浸泡約20 min，用軟毛刷輕輕刷洗葉片表面，將刷洗后的葉片放在塑料量杯內(nèi)，紗布封杯口在流水下沖洗40 min 后，浸泡在蒸餾水中備用.

將處理好的構(gòu)樹葉片轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)進行外植體的表面滅菌和接種.

1）滅菌. 采用4 種不同類型組合的消毒處理方法：①70%酒精浸泡20 s，無菌水沖洗5～6 次，0.5%次氯酸鈉（加吐溫80）消毒15 min，無菌水沖洗5～6次［12］. ②70%酒精浸泡20 s，無菌水沖洗3次，0.1%升汞（加吐溫80）消毒8 min，無菌水沖洗5～6 次. ③70%酒精中浸泡20 s，無菌水沖洗3 次，用0.1%升汞（加吐溫80）消毒3 min，無菌水沖洗3次，再用0.5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗5～6次. ④70%酒精蘸洗1次，無菌水沖洗3 次，0.5%次氯酸鈉（加吐溫80）消毒5 min，無菌水沖洗3 次，0.1%升汞（加吐溫80）消毒4 min，無菌水沖洗6次.

2）接種. 將葉片切成7 mm×7 mm的方塊，再每個葉片上用手術(shù)刀片劃1～2條劃痕，直接接種于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上. 每個消毒處理設(shè)置15個重復(fù)，每個重復(fù)4片葉子，分別裝入瓶內(nèi)，放置黑暗處30 d，統(tǒng)計污染率和褐化率.

從實驗結(jié)果看出（表1）：第1種消毒方式污染率較低，褐化較嚴重；第2種消毒方式污染率最高，褐化情況最嚴重，且葉片大多失去活性；第3 種和第4 種消毒方式未發(fā)現(xiàn)污染，相比之下，第4 種處理褐化率最低.由此看出，消毒時間的長短對雜交構(gòu)樹愈傷誘導(dǎo)及葉片成活有重要影響，如果消毒劑使用單一，會造成污染率高，時間太短會造成葉片消毒不徹底，而消毒時間太長，酒精和升汞會對葉片細胞造成不同程度的損傷.綜合比較，第4種方案的消毒時間和消毒方式最佳.

表1 不同消毒方式結(jié)果統(tǒng)計Tab.1 Results statistics of different disinfection methods

2.2 不同光照時長對雜交構(gòu)樹葉片愈傷誘導(dǎo)的影響

為研究光照時間對構(gòu)樹葉片愈傷誘導(dǎo)的影響，將無菌苗（蘭考中科華構(gòu)培育）葉片切成5 mm×5 mm接種到表2中的6種培養(yǎng)基上. 每個培養(yǎng)基均使用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加不同激素配比，分別設(shè)置12 h/d、16 h/d光照時間和全黑暗處理，30 d后統(tǒng)計結(jié)果.

表2 雜交構(gòu)樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)的不同光照條件設(shè)計Tab.2 Design of different light conditions for callus induction of hybrid Broussonetia papyrifera leaves

觀察實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光照12 h/d處理中的葉片培養(yǎng)到第3天有的就開始發(fā)褐，到第10天已經(jīng)有3/5 的葉片邊緣出現(xiàn)淺褐色，部分葉片周圍的培養(yǎng)基變也為褐色. 光照16 h/d處理的葉片第7天時有4/5的葉片邊緣發(fā)生黑褐色且葉片卷縮成團. 第30天光照12 h/d處理和16 h/d處理的葉片已全部褐化，葉片卷縮失去活性，周圍培養(yǎng)基也呈淺褐色. 黑暗處理的葉片在第30后，4、5、6處理的葉片愈傷大多長出，呈白色疏松質(zhì)地.

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對雜交構(gòu)樹葉片愈傷誘導(dǎo)的影響

選擇MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量配比的6-BA和NAA、蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，調(diào)節(jié)pH至5.8，制成雜交構(gòu)樹葉片愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表3），培養(yǎng)溫度（25±2）℃，黑暗處理30 d，葉片大小約7 mm×7 mm，每片葉片均經(jīng)劃痕處理. 在無菌條件下，每組接10瓶，每瓶4片葉子，連續(xù)培養(yǎng)30 d. 接種30 d后觀察不同激素配比的培養(yǎng)基對雜交構(gòu)樹愈傷組織的影響，統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)情況，并設(shè)定愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率、愈傷生長狀態(tài)這3個參數(shù)用于評估試驗效果.

觀察實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)至第7天，接至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上葉柄的劃痕部位首先開始出現(xiàn)淡綠色顆粒狀愈傷組織，之后帶有劃痕的葉片開始出現(xiàn)淺黃色愈傷顆粒；第15天左右，葉片周圍開始密集出現(xiàn)大量黃綠色或半透明色的愈傷組織顆粒. 處理5、12、14、16的愈傷誘導(dǎo)率均可達到100%，按照愈傷褐化情況比較，處理16 褐化率過高；按照愈傷生長狀態(tài)比較，處理5 和14 愈傷生長狀態(tài)不佳，僅處理12 愈傷狀態(tài)達到“最好”（表4）. 由此可得：MS+6-BA2.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L的激素配比最適合雜交構(gòu)樹葉片愈傷誘導(dǎo).

表3 雜交構(gòu)樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基Tab.3 Different media for callus induction of hybrid Broussonetia papyrifera leaves

表4 不同濃度激素組合對雜交構(gòu)樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of hormone combinations on callus induction of hybrid Broussonetia papyrifera leaves

3 討論與結(jié)論

在進行植物組織培養(yǎng)過程中，器械、植物組織、培養(yǎng)基操作環(huán)境等消毒是否徹底都關(guān)系到實驗的成功與否. 其中最不可控的是植物組織，具體的消毒方式需要根據(jù)植物類型設(shè)計具體的消毒方式. 因此，如何減少污染、最大程度提高成活率、減少實驗誤差是組培過程中的難點與重點.

從以上實驗的結(jié)果也可以看出，影響雜交構(gòu)樹愈傷組織誘導(dǎo)的一個重要因素是消毒方式. 從野外帶回來的雜交構(gòu)樹莖段附著大量的細菌，實驗中既需要去除植物上的細菌，又不能傷害到葉片，還要保證植物葉片表皮細胞健康有活性，就需要選擇合適的消毒劑. 經(jīng)前人學(xué)者的大量研究［13-14］，升汞和次氯酸鈉是組織培養(yǎng)中經(jīng)常使用的消毒劑，殺菌效果較好. 本實驗褐化率隨消毒時間增加與張付遠等［15］的實驗結(jié)論一致，因此組織培養(yǎng)實驗中愈傷誘導(dǎo)的難點重點是掌握好消毒劑的類型、濃度以及消毒的時間.

光照時間對雜交構(gòu)樹愈傷組織的誘導(dǎo)至關(guān)重要. 經(jīng)實驗，雜交構(gòu)樹葉片在黑暗處理下產(chǎn)生愈傷的能力大于光照處理下愈傷產(chǎn)生的能力. 有研究認為，光照處理下矮鳳梨愈傷組織的增殖率顯著高于其在黑暗處理下的增殖率［16］，這與本試驗研究結(jié)果相反；而在暗培養(yǎng)條件下，南方紅豆杉可獲得大量愈傷組織［17］，杉木在暗培養(yǎng)和低強度光照條件下愈傷組織生長狀況均良好［18］，這些結(jié)論與本試驗結(jié)果相一致. 可見不同類型的植物愈傷組織對光照條件的選擇和適應(yīng)性存在明顯的物種差異. 植物對光照條件的反應(yīng)及要求存在復(fù)雜性和多變性，具體的影響機理有待進一步學(xué)習(xí)研究，本試驗僅給未來雜交構(gòu)樹葉片愈傷組織的誘導(dǎo)提供一定參考.

在植物細胞培養(yǎng)過程中，植物細胞生長素和植物細胞分裂素之間的配比，直接影響到植物愈傷生長狀態(tài). 本試驗以MS為基本培養(yǎng)基，通過調(diào)節(jié)其與6-BA和NAA的配比誘導(dǎo)雜交構(gòu)樹葉片愈傷生長，高濃度的6-BA有利于誘導(dǎo)雜交構(gòu)樹葉片愈傷，這與前人研究發(fā)現(xiàn)6-BA和NAA可有效誘導(dǎo)愈傷增殖［19-20］且6-BA在愈傷組織誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用結(jié)論［21］相一致. 本研究運用NAA及6-BA兩種激素進行不同濃度配比，篩選出雜交構(gòu)樹愈傷誘導(dǎo)效果最好的激素濃度和配比，可以為今后的雜交構(gòu)樹葉片乃至莖段、根部愈傷組織培養(yǎng)提供一定的技術(shù)支持.