TLR4-/- 抑制小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管生成的作用機(jī)制

孫玉瑩, 肖歐, 黃春雨

中山大學(xué)腫瘤防治中心 1防癌體檢中心、 3內(nèi)鏡科(廣東廣州 510060)； 2中山大學(xué)中山眼科中心眼底內(nèi)科(廣東廣州 510060)

視網(wǎng)膜新生血管形成是多種視網(wǎng)膜血管病變?nèi)缫暰W(wǎng)膜靜脈阻塞、增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等共有的病理改變，是導(dǎo)致視力損害的主要原因之一[1]。新生血管形成涉及到多種機(jī)制, 其中免疫炎癥反應(yīng)是當(dāng)前備受關(guān)注的研究領(lǐng)域。Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)是一類參與免疫炎癥反應(yīng)的模式識(shí)別受體，它也參與血管增生反應(yīng)，有研究報(bào)道TLR2和TLR4可能通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)介導(dǎo)血管增生反應(yīng)[2-3]。TLR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在視網(wǎng)膜新生血管的生成過(guò)程中起到一定作用[4]。TLR4可以通過(guò)MyD88激活核因子-κB(NF-κB)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)NF-κB也參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。因此有必要研究TLR4通過(guò)NF-κB信號(hào)通路參與視網(wǎng)膜新生血管生成的作用機(jī)制，2018年1月至2019年6月，本研究通過(guò)視網(wǎng)膜熒光灌注鋪片方法觀察TLR4基因敲除小鼠和正常小鼠在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)模型中的視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)變化，免疫熒光檢測(cè)TLR4在視網(wǎng)膜中的表達(dá)情況，PCR檢測(cè)NF-κB、VEGF及其相關(guān)炎性因子的表達(dá)情況，探討TLR4在視網(wǎng)膜新生血管生成過(guò)程中的信號(hào)通路及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)買新生SPF級(jí)C57BL/6J小鼠100只和新生SPF級(jí)TLR4基因敲除C57BL/6J小鼠80只，飼養(yǎng)在溫度為(25±1)℃的環(huán)境中，每天光照與黑暗時(shí)間各12 h，由專人負(fù)責(zé)飼養(yǎng)及管理。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 OIR模型的建立 將80只新生TLR4基因敲除C57BL/6J小鼠，90只新生健康的野生型C57BL/6J小鼠,氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管病變模型。OIR模型的制備參照Smith等[5]報(bào)道的方法，將出生后7 d(P7)的C57BL/ 6J幼鼠和TLR4基因敲除幼鼠與母鼠同時(shí)置于濃度為(75±2)%的高氧氧箱中飼養(yǎng)5 d，然后放回到正常的氧環(huán)境(氧濃度一般為21%)中飼養(yǎng)。這時(shí)從高氧環(huán)境中轉(zhuǎn)到正常氧環(huán)境中，造成乳鼠的視網(wǎng)膜處于相對(duì)缺氧的狀態(tài)中。

1.3 OIR小鼠高分子右旋糖苷(FITC-Dextran)視網(wǎng)膜熒光灌注鋪片 選取兩組OIR小鼠于第12天(P12)、17天(P17)和21天(P21)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10只，用4.3%的水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉小鼠，將麻醉好的小鼠四肢固定在操作臺(tái)上。用眼科剪剪開小鼠胸腹壁，完整暴露出心臟，在肝上緣用止血鉗夾住腹主動(dòng)脈，然后用角膜剪剪開右心耳，使回流的靜脈血液流走，同時(shí)用1 mL的注射器和25G針頭經(jīng)左心室將1 mL稀釋過(guò)的熒光素標(biāo)記的高分子右旋糖苷(FITC-Dxtran，用PBS稀釋濃度為50 mg/mL)緩慢注入。灌注完畢后等待2～3 min,盡量使FITC-Dxtran熒光素能夠完全循環(huán)，如果觀察到小鼠心臟變大和舌尖及上肢變黃，說(shuō)明心臟灌注成功。灌注成功后用無(wú)齒鑷迅速取出小鼠眼球放入4%多聚甲醛中，室溫下固定45 min,然后將固定好的小鼠眼球轉(zhuǎn)移至PBS中，在解剖顯微鏡下分離去除視網(wǎng)膜外面的鞏膜、角膜、虹膜和晶狀體，完整地剝出視網(wǎng)膜，將其放在載玻片上，用穿刺刀分別從視網(wǎng)膜的鋸齒緣到赤道部做4個(gè)放射狀切開，使其均勻地分成4個(gè)象限，使內(nèi)側(cè)向上平鋪在載玻片上，然后用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下觀察平鋪的視網(wǎng)膜并照相保存。觀察新生血管形態(tài)和分布，用Image-Pro Plus軟件分析測(cè)量視網(wǎng)膜新生血管的面積。

1.4 小鼠視網(wǎng)膜組織冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色 選取正常OIR小鼠P12、P17時(shí)取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取10只，將未經(jīng)過(guò)OIR造模處理的正常小鼠P12、P17每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10只作為對(duì)照。麻醉過(guò)量處死小鼠后，用鑷子迅速取出小鼠眼球放入OCT包埋劑中包埋，-20℃冷凍固定，用冰凍切片機(jī)調(diào)整切片厚度為5～8 μm，從接近視神經(jīng)的部位切片，平行于眼球角膜至視乳頭的矢狀位方向進(jìn)行均勻連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本至少10張片。將干燥后的切片用丙酮在室溫下固定10 min，1×PBS漂洗3次，5 min/次。用免疫組化筆將組織圈起來(lái)，用0.1%的滲透劑(Triton X-100，PBS稀釋)50 μL透化30 min(室溫)。1% BSA(牛血清白蛋白) 50 μL(PBS稀釋)室溫下封閉1 h；用1%BSA稀釋的一抗50 μL，置于濕盒(防止液體蒸發(fā))4℃過(guò)夜。滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的小鼠-TLR4單克隆抗體，室溫下避光孵育1 h。1×PBST漂洗3次，5 min/次； 0.1 μg/mL DAPI 50 μL染核，室溫下孵育4～5 min；1×PBST漂洗3次，5 min/次；抗熒光淬滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡下以合適波長(zhǎng)觀察并拍照保存。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR(Real-Time PCR) 檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中的NF-κB、VEGF和促炎因子、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的mRNA的表達(dá)水平 分別在兩組OIR小鼠P12、P17時(shí)取材，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取10只，麻醉過(guò)量處死小鼠后，用RNA提取試劑盒提取視網(wǎng)膜組織的RNA，嚴(yán)格按照Takara公司的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加好樣的PCR板經(jīng)過(guò)短暫離心后，放入熒光定量PCR擴(kuò)增儀上按照以上的反應(yīng)條件擴(kuò)增，并進(jìn)行融解曲線分析。用軟件ABI-7000打開保存結(jié)果，并用比較CT值的方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)的變化差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管區(qū)面積差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管形態(tài)和分布的改變 視網(wǎng)膜FITC熒光灌注鋪片結(jié)果顯示正常OIR小鼠和TLR-/-OIR小鼠的 P12日齡幼鼠均在視網(wǎng)膜中央部分出現(xiàn)大片的無(wú)灌注區(qū)，視網(wǎng)膜血管從視盤中央發(fā)出的血管比較細(xì)，分支非常少，新生血管簇尚未形成，從P12開始新生血管出現(xiàn)并逐漸增多，在P17時(shí)達(dá)到高峰,之后開始緩慢消退。兩組OIR P17日齡的幼鼠在視網(wǎng)膜中周部出現(xiàn)大片無(wú)灌注區(qū)，視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張、迂曲，形成團(tuán)簇狀的新生血管，視網(wǎng)膜中周部及靠近無(wú)灌注區(qū)附近的血管密度明顯增高，血管分布紊亂。從圖1中我們可以看出，P12 時(shí)，TLR4-/-OIR小鼠比正常OIR小鼠視網(wǎng)膜血管無(wú)灌注區(qū)范圍?。籔12、P17、P21時(shí)TLR4-/-OIR小鼠比正常OIR小鼠的新生血管簇明顯減少。通過(guò)軟件統(tǒng)計(jì)分析視網(wǎng)膜新生血管面積發(fā)現(xiàn)P12、P17、P21時(shí)TLR4-/-OIR組較正常OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積明顯減少[在P12、P17和P21這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與WT-OIR小鼠相比， P12(0.123±0.039vs0.053±0.025，n=10)、P17(2.120±0.013vs1.405±0.095，n=10)和P21(0.776±0.048vs0.027 2±0.047，n=10)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)見圖2。

注：在正常OIR(WT-OIR)小鼠和TLR4-/- OIR(TLR4-OIR)小鼠中，P12和P17時(shí)， TLR4-/- OIR比正常OIR小鼠的視網(wǎng)膜無(wú)灌注范圍小。小鼠視網(wǎng)膜新生血管簇在氧誘導(dǎo)后P17達(dá)到最高水平，P12、P17和P21時(shí)，與正常OIR小鼠相比，TLR4-/- OIR小鼠的新生血管簇均較正常小鼠明顯減少。(WT表示健康野生型C57BL/6J小鼠)

2.2 TLR4在OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)情況 P17時(shí)，通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)TLR4在正常OIR小鼠和正常非OIR小鼠視網(wǎng)膜組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與未受任何高氧干預(yù)的正常C57BL/6J幼鼠相比，TLR4在OIR幼鼠的視網(wǎng)膜組織中表達(dá)出現(xiàn)顯著增高(圖3)。大量的TLR4陽(yáng)性細(xì)胞分布在視網(wǎng)膜的多個(gè)組織層中，包括神經(jīng)細(xì)胞層(GCL)-內(nèi)核層(INL)、感光細(xì)胞層和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層(RPE)中。

2.3 缺氧損傷視網(wǎng)膜中，TLR4-/-抑制NF-κB信號(hào)通路活性下調(diào)促血管生成因子和促炎癥因子的表達(dá) 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在P12和P17時(shí)，TLR4-/-OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中NF-κB、VEGF和IL-6的mRNA表達(dá)水平比正常OIR小鼠明顯降低。在P17時(shí)的表達(dá)差異比較明顯，VEGF的表達(dá)降低了2倍，NF-κB及IL-6均出現(xiàn)明顯降低[每個(gè)樣品的平均值以GAPDH的量為參考。倍數(shù)變化：VEGF-P12：3.008±0.038vs0.752±0.032；VEGF-P17：4.162±0.084vs2.037±0.029，n=10。NF-κB-P12：1.054±0.076vs0.756±0.051；NF-κB-P17：1.232±0.031vs0.715±0.045，n=10。IL6-P12：1.264±0.019vs0.905±0.015；IL6-P17：2.647±0.023vs1.695±0.025，n=10]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注： *與正常OIR(WT)小鼠比較 P<0.05

注： P17時(shí)，免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示TLR4在正常OIR小鼠(WT-OIR)及正常非OIR小鼠(WT-非OIR)視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。小鼠缺血視網(wǎng)膜有明顯的TLR4表達(dá)，而非OIR小鼠視網(wǎng)膜TLR4表達(dá)水平較低。氧誘導(dǎo)損傷視網(wǎng)膜后，視網(wǎng)膜各層(包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)-內(nèi)核層(INL)、感光細(xì)胞層和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)均可見大量TLR4陽(yáng)性細(xì)胞。綠色表示TLR4染色；藍(lán)色表示細(xì)胞核染色

3 討論

視網(wǎng)膜新生血管引起的失明已成為眼科目前亟待解決的問(wèn)題，新生血管的生成機(jī)制是公認(rèn)的研究重點(diǎn)。許多研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥反應(yīng)與新生血管形成存在密切聯(lián)系，包括肝病、肺病、大腦、心臟病和腎臟缺血再灌注損傷[6-7]。Toll樣受體在多種疾病中都有重要的作用，它主要參與免疫炎癥反應(yīng)，與腫瘤細(xì)胞的血管供應(yīng)有密切的聯(lián)系，在動(dòng)脈粥樣硬化中也起到重要作用。TLRs能夠通過(guò)MyD88激活NF-κB通路，促進(jìn)炎癥因子的釋放。有報(bào)道指出TLR4在血管結(jié)構(gòu)改變中也起到一定的作用，主要是視網(wǎng)膜新生血管與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[8-9]。研究還發(fā)現(xiàn)Toll樣受體可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，而VEGF是促進(jìn)血管生成的經(jīng)典因子。其中Toll樣受體2、4、7、9能夠調(diào)控VEGF的表達(dá)，主要是通過(guò)與腺苷A2A受體協(xié)同作用誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)VEGF的表達(dá)上調(diào)[10-11]。TLRs通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF參與調(diào)控新生血管的形成。研究發(fā)現(xiàn)TLR4作為促進(jìn)炎癥反應(yīng)的重要因子，參與和血管損傷相關(guān)的炎癥反應(yīng)過(guò)程[12]。有研究結(jié)果表明HMGB1通過(guò)活化TLR4信號(hào)通路，增強(qiáng)VEGF及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，參與新生血管生成[13]。

注：*與正常OIR(WT)小鼠比較P<0.05

在眼組織中，TLRs主要表達(dá)于角膜、結(jié)膜、虹膜、葡萄膜和視網(wǎng)膜等組織[14]。TLR4與眼科疾病關(guān)系最為密切，Lin等[15]發(fā)現(xiàn)HMGB1-TLR4通路參與堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管的形成，TLR4在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中起到重要作用[16]。在小鼠角膜化學(xué)燒傷模型中，發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)缺失并不能完全抑制血管生成，但與正常小鼠相比確實(shí)有減少新生血管的作用[17]。在人的角膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)氫化可的松能夠通過(guò)抑制TLR2和TLR4的活性，降低VEGF的表達(dá)[18]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在很多損傷組織的血管增生反應(yīng)過(guò)程中，TLR4通過(guò)MyD88活化NF-κB進(jìn)而調(diào)控VEGF的表達(dá)[19]。諸多研究都表明TLR4能上調(diào)VEGF的表達(dá)，參與血管生成過(guò)程。因此本文主要研究在視網(wǎng)膜組織中TLR4通過(guò)活化NF-κB進(jìn)而調(diào)控VEGF表達(dá)參與新生血管形成的作用機(jī)制。

OIR小鼠模型能很好地模擬早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)病過(guò)程，與多種視網(wǎng)膜新生血管相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制存在相似之處，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞和老年性黃斑變性等疾病，因此廣泛應(yīng)用在視網(wǎng)膜新生血管形成機(jī)制的科學(xué)研究中，而且此模型具有制備簡(jiǎn)單、周期短、動(dòng)物來(lái)源方便、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，所以本文選用TLR4基因敲除小鼠和野生型正常小鼠建立OIR模型進(jìn)行研究TLR4在視網(wǎng)膜新生血管中的作用機(jī)制。

通過(guò)視網(wǎng)膜血管熒光灌注鋪片，我們發(fā)現(xiàn)在OIR小鼠中，P12視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量無(wú)灌注區(qū)，P17視網(wǎng)膜新生血管達(dá)到高峰，P21視網(wǎng)膜新生血管逐漸消退，無(wú)灌注區(qū)明顯縮小，慢慢恢復(fù)正常。TLR4-/-OIR小鼠的視網(wǎng)膜新生血管面積比正常OIR小鼠明顯減少。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TLR4廣泛表達(dá)在視網(wǎng)膜上，對(duì)比未進(jìn)行OIR造模的正常小鼠，正常OIR小鼠中TLR4的表達(dá)明顯升高，這表明TLR4在缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管中起到重要作用。通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在TLR4-/-OIR模型中NF-κB、VEGF和IL-6的表達(dá)水平明顯降低。研究結(jié)果證明TLR4基因敲除后，NF-κB的活化作用減弱，VEGF和炎癥因子分泌減少，這與 Liu等[19]的研究結(jié)果一致。

我們的研究結(jié)果表明TLR4基因缺失對(duì)OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成有明顯的抑制作用。TLR4-/-是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路活化，減少促血管生成因子和炎性因子的分泌，參與缺氧誘導(dǎo)的免疫炎癥相關(guān)新生血管形成的調(diào)控。這個(gè)結(jié)果表明視網(wǎng)膜新生血管形成在某種程度上依賴與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的TLR4基因的表達(dá)。因此，我們的研究為與血管增生相關(guān)的疾病提供新的治療靶點(diǎn)，即阻斷TLR4—NF-κB—VEGF信號(hào)通路。這將為視網(wǎng)膜新生血管性疾病的防治方面提供新的策略。以此為基礎(chǔ)，未來(lái)我們會(huì)進(jìn)一步探討TLR4及其上游調(diào)控因子在視網(wǎng)膜新生血管相關(guān)疾病中的臨床應(yīng)用前景。