一種利用反相高效液相色譜法測定乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的方法及其評價

張 雯,林毅侃,謝佳雨,歐 杰,3,4,*,李柏林

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院/國家食品質量監(jiān)督檢驗中心(上海),上海 200233;3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;4.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室,上海 201306)

苯乳酸(Phenyllactic Acid,PLA)是一種小分子化合物,抑菌譜廣,溶解性好,易在食物系統(tǒng)中擴散,在較寬pH范圍內能夠保持穩(wěn)定[1]。苯乳酸能夠存在于新西蘭麥盧卡蜂蜜[2-3]、泡菜[4]和發(fā)酵面團[5],對人體無毒無害。因此,苯乳酸有望開發(fā)成為一種新型食品抑菌劑。

苯乳酸能抑制某些革蘭氏陰性菌[6]、革蘭氏陽性菌[7-8]、真菌[9]和真菌毒素[10]。苯乳酸能夠通過影響微生物細胞膜從而抑制微生物的生長繁殖[11-12],有研究表明在超高溫瞬時滅菌乳中添加1 mg/mL的苯乳酸可以顯著抑制單增李斯特菌的生長[2]。乳酸菌由于一般公認安全(Generally Recognized as Safe,GRAS),其合成苯乳酸的能力已被廣泛研究[13-14]。有研究在中式泡菜[4]和韓國泡菜[15]中分離到能夠合成苯乳酸的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。有研究報道利用重組大腸桿菌合成苯乳酸[16],但乳酸菌合成苯乳酸更具有安全性,更能節(jié)省食品工業(yè)成本。

目前乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的檢測方法主要有HPLC法[17-18]、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[15](Ultra-High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)、HPLC-MS/M法[3]、薄層層析法[19]和氣相色譜法[20]。氣相色譜法檢測準確能夠滿足檢測需要,但發(fā)酵液需凍干后酯化,前處理復雜,樣品數量較大時,檢測效率不高;UPLC-MS/MS法和HPLC-MS/MS法設備昂貴,成本較高,檢測時間長;HPLC法由于前處理簡單,準確度高,應用較為廣泛。有研究對比了HPLC法檢測乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸0.22 μm微濾后進樣和微濾后過SPE柱對苯乳酸檢測的影響,發(fā)現(xiàn)微濾后直接進樣回收率更好[17]。

目前對可以用于HPLC法測定乳酸菌中的苯乳酸流動相和固定相各不相同,針對使用的流動相和固定相進行的討論較少。選擇合適的流動相和固定相可以提高檢測效率,對檢測方法進行方法學和不確定度評價,能夠衡量檢測結果的可信度。本實驗旨在選擇較為合適的固定相和流動相的組合,并對方法進行評價、計算不確定度,為乳酸菌合成苯乳酸的相關研究及檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短乳桿菌P3(LactobacillusbrevisP3) 分離自泡菜,由實驗室-80 ℃保存;植物乳桿菌ATCC014(L.plantarumATCC8014)中國普通微生物菌種保藏管理中心;苯乳酸標準品 純度≥98%,上海子起生物科技有限公司;乙腈、甲醇、TFA 色譜級,美國Fisher公司;MRS液體培養(yǎng)基 美國BD公司。

Agilent-1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司;超聲波水浴鍋 江蘇盛藍儀器制造有限公司;雷磁PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液制備 準確稱取苯乳酸0.01 g定容于10 mL容量瓶中,得到濃度為100 mg/L標準儲備液,4 ℃避光存放。

取適量儲備液,用基質空白液稀釋成濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mg/L的標準工作液進行HPLC分析。

1.2.2 發(fā)酵液樣品前處理 將L.brevisP3和L.plantarumATCC8014以1%接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基,35 ℃下分別培養(yǎng)120 h。分別取兩種菌株的發(fā)酵液10000 r/min下離心2～5 min,取上清液0.22 μm微濾后進樣。

1.2.3 高效液相色譜測定條件的優(yōu)化

1.2.3.1 不同固定相對苯乳酸高效液相色譜的影響 本實驗測試了三種固定相,分別是:I:AgilentZorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),無封端色譜柱;II:AgilentEclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),雙封端色譜柱;III:Agilent Zorbax SB-C8色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

流動相為0.05%TFA-乙腈,體積比為75∶25,流速1 mL/min,檢測波長210 nm,進樣量10 μL,柱溫30 ℃。

1.2.3.2 不同流動相對苯乳酸高效液相色譜的影響 以0.05% TFA為水相,1.2.3.1中得出的較優(yōu)色譜柱為固定相,考察乙腈和甲醇對苯乳酸HPLC檢測的影響,平衡30 min后,進樣3次。

以乙腈為有機相,考察0.05% TFA水溶液、0.10%甲酸水溶液、0.10%磷酸水溶液、0.02 mol/L乙酸銨溶液、0.05 mol/L乙酸銨溶液、0.02 mol/L KH2PO4溶液和0.02 mol/L K2HPO4溶液為水相對苯乳酸的HPLC檢測的影響,測試不同的水相對苯乳酸的保留能力和對峰型的影響。每種流動相組合試驗3種體積比:15∶85、20∶80和25∶75,每種流動相比例下,平衡30 min后,進樣3次。

1.2.4 方法學評價

1.2.4.1 線性關系、檢出限和定量限的測定 通過HPLC分析6種濃度(0.2、0.4、0.8、1.0、2.0和5.0 mg/L)的標準品溶液,繪制苯乳酸的校準曲線,使用Aglient1260離線軟件計算線性回歸,以標準品濃度為x軸,以峰面積為y軸,計算回歸方程和系數。

檢出限定義為信噪比(Signal-Noise Ratio,RSN)為3時對應的質量濃度,定量限定義為RSN為10時對應的質量濃度。在1.2.3得到的色譜條件下,儀器平衡1 h后,儀器的基線噪聲為0.27 mAu。

1.2.4.2 精密度和準確性的測定 精密度試驗取2.0 mg/L標準溶液,在1.2.3得到的色譜條件下,在1和30 d分別連續(xù)進樣6次,測定并計算峰面積平均值和RSD。

重復性試驗制備6份2.0 mg/L標準溶液,在1和30 d分別進樣,測定并計算峰面積平均值和RSD。

1.2.4.3 回收率實驗 取L.brevisP3發(fā)酵液適當稀釋后10000 r/min離心2 min,取上清液經過適當稀釋后得到供試品,0.22 μm微濾后進樣,得到發(fā)酵液中苯乳酸含量。

向供試品中分別加入低、中、高3個不同水平的的標準品(即加入折合質量為0.2、0.4和1.0 mg/L的苯乳酸標準品),按照1.2.3得到的色譜條件進行HPLC分析考察方法的回收率。

1.2.4.4 穩(wěn)定性的測定 分別于1、10、20和30 d測定2.0 mg/L標準溶液的峰面積,并計算平均值和RSD。

1.2.5 方法的不確定度 由于樣品為直接測定,不確定度的來源有配制標準溶液引入的不確定度、標準曲線引入的不確定度、重復性引入的不確定度,加標回收引入的不確定度,根據以上不確定度來源計算擴展不確定度。

1.2.5.1 配制標準溶液引入的不確定度(ustandard) 配制標準溶液的不確定度主要來自標準品(ustock)和標準溶液的配制(upreparation)。儀器的膨脹系數為2.1×10-4,溫度變化范圍為±4 ℃,10 mL容量瓶檢定證書偏差為10±0.02 mL,近似于矩陣分布,由定容體積引起的不確定度ur(V1)=0.00125。1 mL移液管檢定證書偏差為1±0.01 mL,近似于矩陣分布,由移液引起的不確定度ur(V2)=0.00579[21-22]。

式(1)

式(2)

式(3)

式中,p%:標準品純度。

1.2.5.2 標準曲線引入的不確定度(ucalibration) 標準曲線為y=ax+b,a為斜率,b為截距。

式(4)

式(5)

1.2.5.3 重復性引入的不確定度(urep)

式(6)

式中,Srep-重復性實驗標準差,x0-重復性實驗中所用標準溶液濃度,n-標準溶液測定重復數。

1.2.5.4 回收率引入的不確定度(urecovery)

式(7)

通過顯著性確定平均回收率是否與1有顯著性差異。檢測統(tǒng)計數據t通過下式計算:

式(8)

t與95%置信度,n-1自由度的雙邊臨界值tcrit比較(其中n是用來評估回收率平均值的測試結果的數目),假如t大于或等于tcrit值,則ˉrec與1有顯著性差異,urecovery不計入合成不確定度,反之則計入合成不確定度,tcrit≈2.306。

1.2.5.5 相對合成不確定高度和擴展不確定度 根據不確定度的傳播定律,相對合成不確定度為:

式(9)

當置信水平P=95%(k=2),相對擴展不確定度:

U=kc×urel

式(10)

1.3 數據處理

實驗中每組平行重復6次,用Origin 2018作圖,Agilent 1260離線軟件和Microsoft Excel 365進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 不同固定相對苯乳酸高效液相色譜的影響 本實驗采用RP-HPLC法,分別測試了三種色譜柱對苯乳酸的分離效果,分別是未封端C18色譜柱(Ⅰ)、封端C18色譜柱(Ⅱ)和C8色譜柱(Ⅲ)。色譜條件參照1.2.3.1。

色譜柱Ⅰ(圖1a)和色譜柱Ⅱ(圖1b)均能夠在5.9 min平穩(wěn)出峰,色譜柱I有輕微拖尾現(xiàn)象,色譜柱Ⅲ(圖1c)拖尾現(xiàn)象嚴重,色譜柱Ⅱ相比色譜柱Ⅰ和Ⅲ峰型較好。根據色譜柱使用說明,C18和C8色譜柱適用pH范圍為2.0～9.0。經測定,乳酸菌發(fā)酵液的最低pH為3.7,能夠滿足色譜柱的適用pH范圍。色譜柱II出峰平穩(wěn),無拖尾,峰型對稱,更適宜苯乳酸的HPLC檢測。

圖1 不同固定相對苯乳酸HPLC分析的影響

2.1.2 不同流動相對苯乳酸高效液相色譜的影響 流動相的優(yōu)化以雙封端C18色譜柱為固定相,首先以0.05% TFA為水相,考察了甲醇作為有機相在雙封端的C18柱上對苯乳酸的洗脫能力。如圖2a所示,以甲醇為有機相,在峰后出現(xiàn)了輕微拖尾現(xiàn)象。乙腈比甲醇具有更強的洗脫能力,以乙腈作為流動相峰型較好,有機相使用的比例小。因此,使用乙腈(圖1b)作為有機相洗脫苯乳酸較好。

圖2 不同溶劑系統(tǒng)對苯乳酸HPLC分析的影響

其次考察了不同水相對苯乳酸HPLC檢測的影響。圖2b表明,0.10%磷酸水溶液-乙腈為流動相,對苯乳酸的保留能力差。以0.02 mol/L乙酸銨溶液-乙腈為流動相時(圖2c),峰前出現(xiàn)小峰,且峰形不佳。流動相為0.05 mol/L乙酸銨溶液-乙腈時,保留能力弱,出現(xiàn)了峰型分裂(圖2d)。在以0.10%甲酸溶液-乙腈為流動相的條件下,在85∶15 (v/v)和80∶20 (v/v)(圖2e,f),不同流動相比例下,峰形存在分裂和小峰的現(xiàn)象和前尾峰的現(xiàn)象,在75∶25 (v/v)下有輕微拖尾現(xiàn)象(圖2g)。0.02 mol/L KH2PO4溶液-乙腈(圖2h)和0.02 mol/L K2HPO4溶液-乙腈(圖2i)峰型有拖尾現(xiàn)象。綜上,0.05%TFA水溶液-乙腈為流動相時峰型更佳(圖1b)。

表1 線性回歸方程、檢出限和定量限

表2 儀器精密度和重復性實驗

2.2 方法學評價

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量限 以2.1得出的色譜條件進行方法學評價,線性范圍、檢出限及定量限結果見表1,回歸方程y=32.5x+1.04且r>0.990,該方法在0.2～5.0 mg/L內有良好的線性。使用0.2 mg/L的標準溶液測定檢出限和定量限,分別為0.1400和0.4600 mg/L,表明該方法靈敏度高,能夠滿足檢測需要。

2.2.2 儀器精密度和重復性實驗 表2為儀器精密度和重復性,苯乳酸標準溶液在1 d精密度和重復性測試RSD分別為0.30%和0.64%,在30 d精密度和重復性測試RSD分別為0.59%和0.79%。結果表明,儀器精密度良好,方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.2.3 回收率實驗 表3為回收率實驗結果,L.brevisP3發(fā)酵液稀釋后中苯乳酸濃度為0.14 mg/L,加標回收率在99.88%～101.08%,在80%～110%之間[23],回收率較好,能夠滿足檢測需要。

表3 回收率實驗

2.2.4 穩(wěn)定性實驗 對30 d內該苯乳酸標準儲備液穩(wěn)定性進行了測試,如表4所示,在30 d內峰面積為69.73 mAu,且RSD為2.45%,4次穩(wěn)定性測試結果差異不顯著(P>0.05),峰面積測定結果穩(wěn)定,結果表明,標準儲備液在30 d內4 ℃保存下性質穩(wěn)定。

表4 苯乳酸標準儲備液穩(wěn)定性

2.3 不確定度評價

實驗操作中不可避免的產生不確定度,不確定度能夠反映結果的可靠性,本實驗計算了L.brevisP3發(fā)酵液中苯乳酸測定的擴展不確定度,其中包括標準溶液的配制,標準曲線、重復性和回收率。回收率不確定度為0.0014,t大于tcrit值,回收率不計入相對不確定度。

標準溶液配制的不確定度為0.013,標準曲線的不確定度為0.0098,重復性的不確定度為0.0015,擴展不確定度為0.0046。在不確定度來源中,標準溶液稀釋和校準的不確定度是整體不確定度中重要的來源。重復性引入的不確定度最小,因此在配制標準溶液和建立標準曲線時應引起重視。L.brevisP3發(fā)酵液中苯乳酸測定結果為(0.1400±0.0046) mg/L。

2.4 乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的測定

本實驗取L.brevisP3和L.plantarumATCC8014發(fā)酵液檢測其中苯乳酸的含量。取滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基測定空白樣品,檢測發(fā)現(xiàn)MRS液體培養(yǎng)基含有苯乳酸,含量為5.58 mg/L。乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸含量為測定值減空白樣品中苯乳酸含量。

如圖3所示,L.plantarumATCC8014和L.brevisP3均能夠合成苯乳酸,在培養(yǎng)120 h后苯乳酸合成量分別為77.58和62.60 mg/L。利用本方法,苯乳酸在6.00 min出峰,目標峰與雜質峰分離徹底,出峰時間適宜,檢測成本低,有機相使用比例小,環(huán)境友好。本方法可根據待測物質中苯乳酸的含量調整標準曲線的線性范圍。

圖3 乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸HPLC圖譜

3 討論

C18和C8表示通過固定相鍵合至二氧化硅的烷烴分別為18或8個碳。碳鏈的增加也增加了鍵合相的非極性區(qū)域,能夠影響保留和選擇性[24]。C18的碳鏈比C8長,因此具有更好的保留性能。C8色譜柱適用于大分子的分離,而苯乳酸是小分子物質,C18色譜柱可以更好地滿足檢測需求[24]。色譜柱封端主要用于反相色譜中。封端色譜柱由于覆蓋了更多的硅烷醇基,可以消除或減少可能發(fā)生的副反應,減少拖尾并延長色譜柱的壽命。由于發(fā)酵液和水相流動相為酸性,使用色譜柱II可以減少色譜柱堵塞的可能性,從而延長色譜柱的使用壽命。故選擇封端C18色譜柱為佳。

采用酸性的水相流動相能夠改善峰型,苯乳酸為小分子有機酸,采用酸性的流動相也能夠抑制待測物質解離[25-27]。水相流動相使用前測定pH,保證pH>2,防止酸性過大時容易對色譜柱造成損傷。TFA的最大吸收波長小于200 nm,苯乳酸的檢測波長為210 nm,檢測干擾小。由于苯乳酸RP-HPLC中的保留值較小,測定時一般采用極性大的流動相,當酸性流動相比例高時,酸性物質容易被電離,導致出現(xiàn)小峰,故苯乳酸在0.1%甲酸-乙腈和乙酸銨-乙腈下出現(xiàn)小峰和峰型分裂[26]。0.1%甲酸水溶液、0.02 mol/L KH2PO4溶液和0.02 mol/L K2HPO4和乙腈在75∶25 (v/v)下輕微拖尾,峰高一致,不影響定性定量,但當樣品中雜質過多時,容易造成苯乳酸目標峰和雜質峰分離不開,檢測結果誤差大,故選擇0.05%TFA-乙腈為流動相,峰型對稱,半峰寬小,定性定量更加準確。

目前苯乳酸的HPLC檢測多采用梯度洗脫,梯度洗脫可用于一次分離多種物質,當分離物質只有一種時,梯度洗脫容易造成基線不穩(wěn),影響定型和定量,且梯度洗脫所需要的平衡時間長,采用等度洗脫的方法,平衡所需的時間短,也就縮短了測定所需時間,隨著色譜柱平衡時間的減少和有機試劑的使用減少,節(jié)省了檢測成本,對環(huán)境友好,不僅能夠應用于實驗室內苯乳酸含量的測定,還能夠用于大批量樣品的測定。利用本方法檢測乳酸菌發(fā)酵液中的苯乳酸,出峰穩(wěn)定,目標峰與雜質峰分離程度好,操作簡單,定性定量準確。

李興峰等[28-29]從家庭中式泡菜中分離出能夠合成苯乳酸的L.plantarum和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei),市售泡菜中沒有分離到乳酸菌。L.brevisP3分離自市售中式泡菜,具有吸附重金屬Cr3+的能力[30]。L.brevisP3不僅能夠吸附重金屬,還具有合成苯乳酸的能力,對重金屬吸附和苯乳酸合成的綜合性研究,具有一定的參考性價值,L.plantarumATCC8014能夠在120 h內合成77.58 mg/L苯乳酸,可在后續(xù)的研究中對其苯乳酸合成能力進行優(yōu)化。

4 結論

本實驗對一種RP-HPLC檢測乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的方法從流動相和固定相進行了優(yōu)化,對能夠用于苯乳酸檢測的流動相和固定相進行了測試和評價,確定了使用封端C18色譜柱,0.05%TFA:乙腈,體積比為75∶25的等度洗脫的洗脫系統(tǒng),檢出限和定量限分別為0.1400和0.4600 mg/L,儀器精密度良好,回收率(99.88%～101.08%)較高,方法重復性能夠滿足檢測需要,操作簡單,結果準確,可以用于檢測發(fā)酵液中苯乳酸,發(fā)現(xiàn)了兩株能夠合成苯乳酸的乳酸菌,L.plantarumATCC8014和L.brevisP3均能夠合成苯乳酸,在培養(yǎng)120 h后苯乳酸合成量分別為77.58和62.60 mg/L,為乳酸菌合成苯乳酸的相關研究提供參考,后續(xù)研究中可對兩株乳酸菌菌合成苯乳酸能力進一步考察和優(yōu)化。