十字花科根腫病菌染色及藥劑致死效果測定研究

施竹鳳，裴衛(wèi)華，王 會，張 慶，楊佩文，吳貴宏，李向東，彭榮珍，畢云青，楊明英*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.丘北縣溫瀏鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務中心，云南 丘北 663208；3.瑞麗海關(guān)綜合技術(shù)中心，云南 瑞麗 678600)

【研究意義】十字花科蔬菜根腫病是由根腫菌屬(Plasmodiophora)蕓薹根腫菌(P.brassicaeWoron)侵染引起的土傳病害[1]，俗稱“根癌”。該病寄主范圍很廣，可危害大白菜、小白菜、甘藍、蘿卜等100多種栽培的和野生的十字花科植物[2]。該病在國內(nèi)外各蔬菜產(chǎn)區(qū)均有分布[3-4]，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，十字花科蔬菜種植面積不斷擴大，根腫病的發(fā)生危害也有加重趨勢。根腫病菌為專性寄生菌，作物的苗期與成株期均可感病。根腫病菌通過侵染植物根系，使根部膨大，形成大小不一、形態(tài)各異的根瘤[5]，影響植株正常的生理生化功能，影響植株對水分及養(yǎng)分的吸收，從而引起植株地上部分發(fā)育不良，嚴重時導致整個植株枯萎死亡[6]，造成嚴重經(jīng)濟損失。根腫病菌是一種低等微生物，在土壤中以休眠孢子的形式長期存活[7]，因此植株一旦被該菌侵染，會增加土壤中新的菌含量，且由于農(nóng)事操作不當，會導致感病田塊中根腫病菌在全田擴散，從而該病發(fā)生不斷加重。感染了根腫病菌后，一般用土壤塘施進行常規(guī)處理，但該方法無法徹底消滅根腫病菌，只能減少菌量，且根腫病菌一旦發(fā)生，土壤就難以清除干凈，除非與其它科作物多年輪作，或者采用土壤消毒劑全田消毒處理。【前人研究進展】藥劑防控是根腫病持續(xù)防控中的關(guān)鍵控病技術(shù)之一[8]，但大多數(shù)殺菌劑對根腫病的防控效果如何，必須進行田間試驗。由于田間病田土壤中根腫病菌含量不均勻，病害發(fā)生受多種因素影響，試驗結(jié)果往往不穩(wěn)定；加之田間試驗需投入較大人力物力財力，試驗成本較高。加上根腫病菌尚未獲得離體培養(yǎng)，病原菌以休眠孢子存活于土壤或植物組織，且病原菌體積小、難分離檢測，從而給該病害的早期診斷帶來很大挑戰(zhàn)[9]。MacFarlane最早進行了根腫病菌休眠孢子的分離[10]，其它人采用的分離方法都是在此基礎上優(yōu)化改進的。Kenji Takahashi利用螢光染色技術(shù)對土壤中的休眠孢子進行檢測與定量分析[11]；Arie則用螢光抗體技術(shù)對分離自土壤或植物根腫組織的休眠孢子進行檢測[12]；Lange，Wakeham和White成功地對分離自土壤及根腫組織中的根腫病菌進行了血清學及掃描電鏡檢測[13-14]。以上這幾種方法比較費時，且需要一定的實驗技能和專用設備，因而應用上受到一定限制。作者團隊通過多年試驗研究及應用，針對十字花科蔬菜根腫病的防控，堅持在選用抗病品種條件下，以農(nóng)業(yè)措施、生物調(diào)控為主，化學防控為輔的綜合防控技術(shù)。以減少田間土壤菌源，改變根腫病菌適生環(huán)境，保護蔬菜生長前期的根系不受根腫病菌侵染等相應措施，即輪作、無菌土育苗移栽、土壤酸堿度或微生態(tài)調(diào)控、關(guān)鍵化學防控為主線的模式，減輕病害發(fā)生危害，達到控病增產(chǎn)目的。【本研究切入點】本研究擬對采集的十字花科蔬菜根腫病菌，通過孢子懸浮液進行藥劑抑制效果測定，可快速及低成本大量篩選不同藥劑致死效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過孢子染色比較試驗，篩選出檢測孢子活性的染色劑及染色方法，測定不同殺菌劑控制根腫病菌的效果，為大田試驗或示范提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

十字花科蔬菜根腫病菌來自嵩明縣蔬菜基地的白菜根腫病病根。實驗所用主要試劑：4 %臺盼藍母液、碘化丙啶(PI)、Hoechest33342 染液。供試藥劑：搜集市場上殺菌劑19種，進行室內(nèi)抑制效果試驗，藥劑種類及廠家詳見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 根腫病菌孢子懸浮液的制備 將病樣組織洗凈，取10 g切碎，加入到50 mL滅菌水中，進行研磨；研磨后用4層紗布過濾，濾液移至50 mL離心管3100 r/min離心15 min，然后棄上清液；沉淀重溶于50 mL滅菌水3100 r/min離心10 min，此步驟重復2～3次，然后棄上清液；沉淀中加入50 %蔗糖溶液5 mL，混勻后3100 r/min離心10 min；取上清液到干凈離心管內(nèi)，加入30 mL滅菌水，3100 r/min離心10 min后棄上清液；沉淀重溶于30 mL滅菌水，3100 r/min離心10 min，此步驟重復2次；沉淀重溶于5 mL滅菌水[2]，最后將其濃度調(diào)節(jié)到1.0×108個孢子/mL，放置陰暗處備用。

1.2.2 試驗處理 將19種不同種類藥劑，采用說明書用量的最低劑量，計算出10 mL用藥量，然后分別加入上述備好的孢子懸浮液中，搖勻，放置室溫(13～24 ℃)條件下，每個藥劑處理3次重復。設置2組對照：加無菌水的孢子懸浮液、在90 ℃水浴煮沸5 h的孢子懸浮液。定期震蕩混勻。

1.2.3 觀察時間及方法 將1.2.2的孢子懸浮液，在分別處理7、10、14 d后取10 μl溶液，加入500 μl無菌水，采用3000 r/min離心10 min，再加100 μl無菌水或100 μl(0.05 %硫代硫酸鈉+10 %吐溫80)進行重懸，鏡檢鑒定根腫病菌孢子活力，并統(tǒng)計死孢子與活孢子數(shù)。

1.3 根腫病菌孢子染色

1.3.1 染色液的配制 碘化丙啶(PI)：用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)將碘化丙啶配制成終濃度為100 μg/mL的PI儲存液，4 ℃避光保存。Hoechest33342 染液：用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)將Hochest33342配制成終濃度為100 μg/mL的Hoechest33342儲存液，4 ℃避光保存[1]。4 %臺盼藍母液：稱取4 g臺盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100 mL，用濾紙過濾，4 ℃保存。使用時，用PBS稀釋至0.4 %。

表1 不同藥劑種類及用量

1.3.2 不同染色方法 PI單染：取新鮮的根腫病菌孢子懸浮液和水浴處理致死的孢子沉淀，用 PI 溶液重懸，4 ℃避光處理15 min，后用移液槍取10 μl反應液滴在載玻片上，制片，在顯微鏡下觀察死、活孢子特征[1]。Hoechest33342單染：分別取新鮮的根腫病菌孢子懸浮液和水浴處理致死的孢子懸浮液、Hochest33342染液950、50 μl，37 ℃處理10 min，置于冷凍離心機1000 g/min 離心，去上清，用滅菌水1 mL洗滌，離心，去上清，在沉淀中加入950 μl 的滅菌水重懸，取10 μl制片，在顯微鏡下觀察死、活孢子特征[1]。臺盼藍染色：孢子懸液與0.4 %臺盼藍溶液以9∶1體積比混合均勻，處理15 min，后取 10 μl制片，在熒光顯微鏡下觀察死、活孢子特征[1]。

1.3.3 染色測定方法 將藥劑處理過的根腫病菌孢子懸浮液稀釋重懸后，采用臺盼藍染色測定根腫病菌休眠孢子活力，統(tǒng)計死孢子與活孢子數(shù)。所有孢子懸浮液染色處理前先檢查新鮮休眠孢子自然死亡率。再用臺盼藍染料進行不同處理孢子懸浮液染色，著色后為藍色即死亡，無色即存活，計算孢子死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個樣本均用血球計數(shù)板(25×16)觀察，然后采用下面公式計算死亡率。

孢子死亡率(%)=[視野中著深藍色的孢子數(shù)目/(視野中著深藍色的孢子數(shù)目+視野中呈透亮狀的孢子數(shù)目)]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染色劑染色效果篩選

2.1.1 根腫病菌孢子的分離富集及水浴處理 分離富集：利用50 %蔗糖溶液制備得高純度的根腫病孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察，可見孢子大部分是單個存在的，且相互沒有富集或堆積現(xiàn)象(圖1-A)，便于后續(xù)實驗的開展。孢子懸浮液熱處理：將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)為1.0×108個孢子/mL，90 ℃下水浴加熱5 h，保證孢子全部死亡。在顯微鏡下觀察，可見孢子呈團狀集聚、重疊嚴重，且孢子顏色變深(圖1-B)。

A：新鮮根腫病菌休眠孢子；B：90 ℃水浴處死根腫病菌孢子A: Dormant spores of Plasmodiophora brassicae; B: Execution of Plasmodiophora brassicae spores by water bath at 90 ℃圖1 根腫病菌孢子Fig.1 Spores of Plasmodiophora brassicae

2.1.2 根腫病菌孢子自發(fā)熒光觀察 通過鏡檢觀察，新鮮孢子與90 ℃水浴處死孢子在不加任何熒光染料的情況下，有明顯自發(fā)熒光現(xiàn)象。新鮮孢子自發(fā)熒光為藍色(圖2-A)，而90 ℃水浴處死孢子自發(fā)熒光除了藍色，還有綠色和紅色(圖2-B～D)。

A：新鮮休眠孢子自發(fā)熒光；B～D：90 ℃水浴處死孢子自發(fā)熒光A: Spontaneous fluorescence of fresh dormant spores of Plasmodiophora brassicae; B-D: Spontaneous fluorescence of spores killed by water bath at 90 ℃.圖2 根腫病菌孢子自發(fā)熒光Fig.2 Spores spontaneous fluorescence of Plasmodiophora brassicae

2.1.3 根腫病菌孢PI染色效果 新鮮休眠孢子懸浮液經(jīng) PI 染色后，在熒光顯微鏡下觀察，視野中孢子僅有藍色熒光(圖3-A)；通過90 ℃水浴處理致死的孢子，可觀察到既有藍色也有紅色熒光，且孢子堆積成團，無法統(tǒng)計視野中孢子數(shù)目(圖3-B～C)。

A：新鮮休眠孢子染色后為藍光；B～C：90 ℃水浴處理孢子染色后為藍光、紅光A: Blue light after staining of fresh dormant spores ; B-C: After dyeing in water bath at 90 ℃, it is blue and red圖3 根腫病菌孢子PI染色效果Fig.3 Effect of PI staining on spores of Plasmodiophora brassicae

2.1.4 根腫病菌孢子Hoechest33342染色效果 新鮮孢子懸浮液經(jīng)Hoechest33342染色后，在熒光顯微鏡下絕大多數(shù)的孢子有藍色熒光(圖4-A)，而少數(shù)孢子有紅色熒光(圖4-B)；經(jīng) 90 ℃水浴處理致死的孢子，有藍色和紅色熒光，且聚集成團，細胞界限不清晰，無法進行計數(shù)(圖4-C～D)。

A～B：新鮮孢子染色后多數(shù)藍光(A)和少數(shù)紅光(B)；C～D：90 ℃水浴處理孢子染色后孢子有藍光(C)和紅光(D)A-B: Most blue light (A) and a few red light (B) were stained with fresh spores; C-D: The dyed spores treated by water bath at 90 ℃ have blue and red light圖4 根腫病菌孢子Hoechest33342染色效果Fig.4 Spore dyeing effect by Hoechest33342 of Plasmodiophora brassicae

2.1.5 根腫病菌孢子臺盼藍染色效果 在0.4 %臺盼藍染色后，新鮮孢子懸浮液中死、活孢子呈現(xiàn)不同著色效果?；畹逆咦訄A潤透亮、不著色或著色極淺，細胞界限清晰可見(圖5-A)；90 ℃水浴處死的孢子全部著深藍色，染料呈點狀或塊狀沉積在孢子上，且細胞界限清晰可辨(圖5-B)；新鮮休眠孢子與90 ℃水浴處死孢子混合后臺盼藍染色，能在同一視野中同時觀察到死、活孢子的不同著色效果(圖5-C)。

A：新鮮休眠孢子臺盼藍染色呈透亮圓潤；B：90 ℃水浴處理染色后深藍色；C：新鮮休眠孢子和90°水浴處理孢子混合后染色呈現(xiàn)無色+藍色A: Fresh dormant spores stained with trypan blue were bright and round; B: Dark blue after dyeing in water bath at 90 ℃;C: Fresh dormant spores and spores treated with 90 ℃ water bath were dyed colorless and blue圖5 根腫病菌孢子臺盼藍染色效果Fig.5 Effect of trypan blue staining on spores of Plasmodiophora brassicae

2.2 不同藥劑對根腫病菌休眠孢子的致死效果

2.2.1 藥劑不同處理時間對根腫病菌孢子致死效果 利用臺盼藍對藥劑處理后的孢子進行染色，結(jié)果顯示，不同藥劑對根腫病菌孢子處理時間長短其致死率有一定差異。藥劑處理7、10、14 d后，隨著處理時間延長，孢子死亡率會逐漸增加，致死率高低順序14 d>10 d>7 d。其中明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈處理7～10 d，致死率增加幅度比10～14 d大，其它藥劑處理7、10、14 d后，致死率差異不大。

藥劑處理7 d后，19種藥劑對根腫病菌孢子致死率在12.46～31.18 %，不同藥劑間差異不大；處理10 d后，明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈致死率明顯上升，致死率為41.69 %～56.37 %，其它藥劑致死率為13.07 %～33.21 %，與處理7 d的效果比較差異不明顯；處理14 d后，19種藥劑致死效果與處理10 d的致死率差異不大。通過藥劑對根腫病菌孢子不同處理時間效果比較，表明處理時間需在10 d以上才能檢測和體現(xiàn)藥劑對根腫病菌休眠孢子的致死效果(圖6)。

圖6 不同處理時間對根腫病菌孢子的致死效果差異Fig.6 The difference of lethal effect of different treatment time on spores of Plasmodiophora brassicae

2.2.2 不同藥劑處理根腫病菌致死效果 不同藥劑處理后，采用臺盼藍染色法染色，在熒光顯微鏡下計數(shù)，統(tǒng)計藥劑對病菌孢子的致死率。藥劑處理14 d測定結(jié)果顯示，不同藥劑種類之間對根腫病菌孢子致死效果有明顯差異，明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈的致死率為55.99 %～62.49 %，致死效果較好；咪鮮胺、明安、烯酰嗎啉、甲霜靈錳鋅的致死率為31.66 %～33.89 %，有一定抑制效果；多抗霉素、克菌康、明彩、明登、代森錳鋅、甲基硫菌靈、腐霉利的致死率為20.79 %～25.49 %；而春雷霉素、明潤豐和明農(nóng)心致死率較低，為17.89 %～19.49 %(圖7)。

圖7 不同藥劑處理對根腫病菌的致死效果Fig.7 Lethal effect of different agents on Plasmodiophora brassicae

3 討 論

3.1 根腫病菌孢子染色效果比較

采用熒光顯微鏡觀察根腫病菌孢子，由于孢子在熒光顯微鏡下自帶熒光，給實驗帶來一定困難。通過根腫病菌孢子不同染色方法比較實驗，顯示臺盼藍染色后可以在同一視野中，明顯區(qū)分根腫病菌休眠孢子是死的還是活的：有活力的休眠孢子透亮、不著色，死的休眠孢子著深藍色，二者顏色反差強烈，且死的休眠孢子無聚集現(xiàn)象。與其他染色方法相比，臺盼藍染色為根腫病菌休眠孢子活力檢測的最佳方法。因此該實驗以下染色測定均用臺盼藍染色。臺盼藍染液染色為根腫病菌休眠孢子活力檢測的最佳方法。根據(jù)多次的實驗確定染色的最佳比例為處理液∶臺盼藍(9∶1)，最佳染色時間為3～5 min。該實驗結(jié)果對根腫病菌孢子的相關(guān)研究奠定了基礎。

3.2 不同藥劑及處理時間對根腫病菌孢子致死效果

19種藥劑及不同處理時間對根腫菌孢子的抑制率測定，結(jié)果顯示，隨處理時間延長，致死效果逐漸增高，部分藥劑致死率在處理第7 ～10天，變化幅度較大，所有藥劑在處理10～14 d時，致死效果變化不大。其中明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈等對孢子致死效果較好，均高于55 %。多抗霉素、克菌康、春雷霉素、明潤豐、明登、明農(nóng)心、代森錳鋅和甲基硫菌靈等致死效果較差，藥劑致死效果與大田藥劑防控效果基本相吻合。

4 結(jié) 論

通過實驗表明殺菌劑在防治根腫病菌時具有一定的時間性和滯后性，所以生產(chǎn)實際中防治十字花科根腫病要提前施藥或采取預防措施，才能達到最佳防控效果。在田間根腫病的藥效試驗比室內(nèi)復雜，影響因素較多，在不同地理條件下，同樣的防控方法、防控藥劑產(chǎn)生的效果會差異。同時對根腫病的防控僅用單一藥劑防控措施遠遠達不到持續(xù)控制目標，長期單一使用核心藥劑會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此必須采用綜合的防控措施，以利用抗病品種為基礎，加強栽培管理，清理病根降低菌源量，健康種苗及土壤處理、關(guān)鍵藥劑防治等持續(xù)控制，才能逐漸減輕根腫病的發(fā)生危害。