• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lmo2672對(duì)LM環(huán)境適應(yīng)性和應(yīng)激的調(diào)控作用

    2020-12-10 10:48:58張星星孟慶玲王曉婷才學(xué)鵬
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激家族試劑盒

    李 杰,張星星,孟慶玲,喬 軍*,李 妍,王曉婷,李 靜,才學(xué)鵬

    (1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅 蘭州 730046)

    【研究意義】單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一種重要的食源性病原菌之一,廣泛分布于自然界,能在外界環(huán)境中長(zhǎng)期存活[1]。人類通過食用被感染的食物經(jīng)消化道感染機(jī)體,引起感染者發(fā)生敗血癥、腦膜炎、胃腸炎、流產(chǎn)等嚴(yán)重疾??;免疫能力低下者感染后死亡率較高[2-3]。LM能在0.4 ~ 45 ℃、pH值2.5、滲透壓高、20 % NaCl和0.025 %過氧化氫等極端環(huán)境中生長(zhǎng)和生存[1,4-5],是動(dòng)物源性食品生產(chǎn)加工過程中的常見污染菌,對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了適應(yīng)不同環(huán)境,LM轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)從而改變其環(huán)境適應(yīng)能力[8-9]。目前,已在LM中鑒定出多種環(huán)境調(diào)控因子,其中prfA和sigB在環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中扮演重要角色,它們通過調(diào)節(jié)抗性基因的轉(zhuǎn)錄使LM適應(yīng)各種不利環(huán)境[6-9]。此外,HrcA和CtsR也參與應(yīng)激反應(yīng)基因的調(diào)控[10-12];SOS作為修復(fù)受損DNA的一種機(jī)制,而RecA和LexA分別控制SOS反應(yīng)的激活和抑制,也參與了對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性[16-17],有研究發(fā)現(xiàn),AraC家族是存在于革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌中的一種轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)細(xì)菌一些基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用,參與細(xì)菌毒力的調(diào)控及抵抗不良應(yīng)激環(huán)境[6,15]。該家族中的螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋(HTH) DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與基因的啟動(dòng)子結(jié)合,激活基因轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮調(diào)控作用[16-17]。前期的生物信息學(xué)分析表明,lmo2672屬于AraC家族成員,然而目前LMlmo2672具體的生物學(xué)功能尚不清楚。【本研究切入點(diǎn)】本研究利用構(gòu)建的lmo2672基因缺失株,比較LM EGD-e與LM-Δlmo2672在不同應(yīng)激環(huán)境中環(huán)境適應(yīng)能力,通過qRT-PCR分析了應(yīng)激調(diào)節(jié)因子(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和氧化應(yīng)激相關(guān)基因(fri、kat、perR、sod)轉(zhuǎn)錄水平的變化,探討了lmo2672對(duì)LM氧化環(huán)境中的調(diào)控作用?!緮M解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步揭示AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Lmo2672在LM中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與試劑

    LM EGD-e菌株由德國(guó)伍茲堡大學(xué)W. Goebel惠贈(zèng);pKSV7由本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD19-T載體、T4連接酶、限制性酶切酶KpnI和PstI購(gòu)自TaKaRa公司,基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自TIANGEN生物有限公司,氯霉素、膽汁酸鹽購(gòu)自Sigma公司,氯化鈉購(gòu)自天津盛奧生物試劑公司,腦心浸出液(BHI)購(gòu)自青島海博生物科技有限公司。

    1.2 引物

    根據(jù)GenBank發(fā)表的LM標(biāo)準(zhǔn)株(LM EGD-e)基因組序列(登錄號(hào):AL591824.1),應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)LM缺失株的構(gòu)建、鑒定及qRT-PCR相關(guān)引物,其中R1和R4引物的5’端分別引入酶切位點(diǎn)KpnI和PstI (斜體下劃線部分),引物均由北京華大基因公司合成 (表1)。

    表1 本研究中所用引物

    續(xù)表1 Continued table 1

    1.3 LM-Δlmo2672缺失株的構(gòu)建與鑒定

    采用基因組DNA提取試劑盒提取LM EGD-e菌株的基因組DNA,以DNA為模板,利用引物R1/R2、R3/R4分別擴(kuò)增lmo2672基因的上、下游同源臂,將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,根據(jù)膠回收試劑盒的操作步驟進(jìn)行回收,將上、下游臂的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行融合,獲得缺失目的基因的融合片段。將其與溫控質(zhì)粒pKSV7進(jìn)行16 ℃過夜連接,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlmo2672。將pKSV7-Δlmo2672電轉(zhuǎn)至LM感受態(tài)細(xì)胞中,在氯霉素和42 ℃雙重抗性下進(jìn)行同源重組獲得缺失株,對(duì)獲得的LM-Δlmo2672缺失株用旁外側(cè)引物R5/R6檢測(cè)并測(cè)序進(jìn)行鑒定。同時(shí)將LM-Δlmo2672缺失株在無氯霉素抗性,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20代并用R5/R6進(jìn)行PCR檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。

    1.4 lmo2672基因缺失對(duì)LM在不同應(yīng)激環(huán)境中適應(yīng)能力的影響

    分別挑取LM EGD-e和LM-Δlmo2672單菌落過夜培養(yǎng),調(diào)整菌液OD600約為0.4,分別接種于新鮮BHI培養(yǎng)基放置于不同溫度(37、42 ℃),或者分別在37 ℃接種于含5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2、1 % Triton X-100的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每株菌設(shè)置3個(gè)平行,每2 h測(cè)定其OD600 nm以代表菌株生長(zhǎng)情況,繪制生長(zhǎng)曲線比較LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長(zhǎng)曲線。

    1.5 RNA的提取及cDNA的合成

    將待測(cè)菌株在37 ℃,180 r/min過夜振蕩培養(yǎng),離心收集菌體,用含5 mM H2O2BHI調(diào)整菌液OD600至0.6,并放置37 ℃暴露于H2O2環(huán)境中30 min;離心收集菌體,用液氮研磨至粉狀;根據(jù)Trizol法的操作分別提取LM EGD-e和LM-Δlmo2672細(xì)菌總RNA;使用Nanodrop 2000測(cè)量RNA濃度,并通過260/280和230/260 nm的比值以評(píng)估RNA是否被蛋白質(zhì)和有機(jī)物污染。同時(shí)利用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到終體積為20 μl的cDNA;并用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定cDNA濃度。

    1.6 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR分析

    以統(tǒng)一濃度的cDNA為模板,以管家基因rpoB作為內(nèi)參,在LightCycler 480儀器上進(jìn)行qRT-PCR,反應(yīng)采用SYBR Green Ⅰ Master mix和1.0 μM濃度的引物進(jìn)行。測(cè)定6個(gè)環(huán)境應(yīng)激調(diào)控相關(guān)基因(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和4個(gè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因(perR、kat、sod、fri)的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT的方法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。本試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行組間差異顯著性分析,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。P<0.05被認(rèn)為差異顯著,P<0.01被認(rèn)為差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LM-Δlmo2672的構(gòu)建、鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析

    利用R5/R6引物篩選擴(kuò)增出1502 bp條帶的重組菌株(圖1);同時(shí)進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明成功構(gòu)建LM-Δlmo2672缺失株。在37 ℃、無氯霉素抗性的培養(yǎng)基中繼續(xù)傳20代,R5/R6引物檢測(cè)均可擴(kuò)增出1502 bp單一片段(圖2),表明LM-Δlmo2672具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

    2.2 lmo2672基因缺失對(duì)LM環(huán)境適應(yīng)能力的影響

    在37和42 ℃條件下,在37 ℃更適應(yīng)LM菌生長(zhǎng),且2株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相同,在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中, LM-Δlmo2672的生長(zhǎng)顯著慢于LM EGD-e(P< 0.05,圖3-A、圖3-B);在含5 % NaCl培養(yǎng)基中,0~6 h LM EGD-e和LM-Δlmo2672幾乎不生長(zhǎng),在6 h之后LM-Δlmo2672生長(zhǎng)速度顯著低于LM EGD-e(P<0.05,圖3-C)。在1 % Triton X-100 BHI中, 與LM EGD-e相比,LM-Δlmo2672在6~12 h內(nèi)生長(zhǎng)差異顯著(P<0.05,圖3-D);在含0.3 %的膽酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h以后,2株菌生長(zhǎng)情況差異顯著(P<0.01,圖3-E);在含5 mM H2O2BHI培養(yǎng)基中LM-Δlmo2672不生長(zhǎng),極顯著低于親本株LM EGD-e(P<0.01,圖3-F),表明lmo2672缺失降低了LM的環(huán)境適應(yīng)能力。

    M:DNA Marker DL-2000;1:LM EGD-e;2~3:LM-Δlmo2672重組菌;4:陰性對(duì)照;5.LM EGD-e圖1 LM-Δlmo2672重組菌的鑒定Fig.1 Identification of recombinant LM-Δlmo2672

    2.3 環(huán)境應(yīng)激調(diào)控基因及氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

    在H2O2環(huán)境中暴露30 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與LM EGD-e相比,LM-Δlmo2672中recA和fri基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05),表明在氧化環(huán)境中l(wèi)mo2672缺失能誘導(dǎo)recA和fri基因的轉(zhuǎn)錄水平;除recA和fri基因外,其余基因的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的降低,其中prfA,lexA,fri,perR,kat,sod差異顯著(P<0.05,圖4),表明lmo2672對(duì)LM環(huán)境應(yīng)激和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平有影響。

    M:DNA Marker DL-2000;1~3:LM-Δlmo2672重組菌;4:陰性對(duì)照;5:LM EGD-e圖2 LM-Δlmo2672重組菌遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)Fig.2 Analysis of genetic stability of LM-Δlmo2672

    3 討 論

    LM具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,能夠在食品加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激環(huán)境條件生存[18-19]。為了適應(yīng)不同的應(yīng)激環(huán)境,LM依靠眾多的調(diào)控因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在大腸桿菌中研究發(fā)現(xiàn),AraC家族蛋白在細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了調(diào)控作用。AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rob通過上調(diào)micF使大腸桿菌對(duì)膽汁酸產(chǎn)生耐受[20-21];Pletzer等人發(fā)現(xiàn)AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OpiA過表達(dá)時(shí)對(duì)大腸桿菌在pH和高滲透壓環(huán)境的耐受性顯著增加[17]。然而,目前LMAraC家族成員Lmo2672的生物學(xué)作用至今尚不清楚。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建LM-Δlmo2672缺失株,測(cè)定在不同應(yīng)激環(huán)境中LM EGD-e和LM-Δlmo2672的生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LM-Δlmo2672在37 ℃、42 ℃、5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2及1 % Triton X-100的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)顯著低于LM EGD-e,提示AraC家族Lmo2672在LM環(huán)境適應(yīng)和應(yīng)激過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。

    A~F:分別為42 ℃,37 ℃,5% NaCl,1 % TrionX-100,0.3 %膽酸鹽,5 mM H2O2環(huán)境中的生長(zhǎng)情況圖3 不同應(yīng)激環(huán)境對(duì)LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Growth curves of LM EGD-e and the LM-Δlmo2672 deletion mutant strains at different environmental stresses

    圖4 氧化應(yīng)激環(huán)境下LM EGD-e和LM-Δlmo2672壓力調(diào)控相關(guān)基因及氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Relative transcriptional levels of the genes related to stress regulator and oxidative stress response in the LM EGD-e and LM-Δlmo2672 under the oxidative stress

    在外界環(huán)境中,LM常暴露于氧化應(yīng)激中,為了防止氧化應(yīng)激引起的損傷,細(xì)菌自身的防御系統(tǒng)可通過啟動(dòng)相關(guān)的抗氧化機(jī)制來抵御ROS[22-23]。清除活性氧組分的超氧化物歧化酶(sod)將高活性的超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫,過氧化氫又被過氧化氫酶(kat)轉(zhuǎn)化為水和氧[24];fri編碼類鐵蛋白Dps,據(jù)報(bào)道Dps在保護(hù)細(xì)胞抵御ROS時(shí)有雙重作用,它可以直接與DNA結(jié)合調(diào)控應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá),以保護(hù)細(xì)菌免受H2O2的傷害[25]。研究表明,在不同的環(huán)境應(yīng)激(例如熱應(yīng)激、冷應(yīng)激、膽酸鹽應(yīng)激)中均可誘導(dǎo)fri基因的表達(dá)[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn),在氧化應(yīng)激作用下,fri基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯改變,表明該基因參與了抵御氧脅迫的作用。有研究表明,外源性ROS造成的DNA損傷會(huì)誘導(dǎo)recA基因的表達(dá)啟動(dòng)SOS反應(yīng)機(jī)制以適應(yīng)氧脅迫環(huán)境[26-28]。本研究中發(fā)現(xiàn),lmo2672基因缺失后,recA基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng),推測(cè)可能是通過recA基因的高表達(dá)來啟動(dòng)SOS反應(yīng),從而維持其生存,提示lmo2672可通過調(diào)控recA基因的表達(dá)以抵抗環(huán)境應(yīng)激。

    4 結(jié) 論

    總之,本研究通過構(gòu)建LM AraC家族lmo2672基因缺失株,證實(shí)了LM-Δlmo2672缺失株通過調(diào)控環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá),顯著降低抵抗環(huán)境應(yīng)激的能力,尤其在氧化應(yīng)激環(huán)境中,LM-Δlmo2672缺失株fri及recA基因被誘導(dǎo)高表達(dá),表明lmo2672基因在適應(yīng)氧化應(yīng)激環(huán)境中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,為進(jìn)一步探究LMlmo2672調(diào)控應(yīng)激環(huán)境的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    氧化應(yīng)激家族試劑盒
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對(duì)新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    HK家族崛起
    《小偷家族》
    電影(2019年3期)2019-04-04 11:57:18
    皿字家族
    家族中的十大至尊寶
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證
    氧化應(yīng)激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    日韩av在线大香蕉| bbb黄色大片| 美女 人体艺术 gogo| 性欧美人与动物交配| 国产单亲对白刺激| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美色视频一区免费| 1024视频免费在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av电影中文网址| 一二三四在线观看免费中文在| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 自线自在国产av| 美女免费视频网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲久久久国产精品| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久人妻av系列| 色播在线永久视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 激情视频va一区二区三区| 韩国精品一区二区三区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一区二区三区国产精品乱码| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲伊人色综图| 又黄又粗又硬又大视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品久久视频播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 99精品在免费线老司机午夜| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久伊人香网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久国产精品影院| 久久国产乱子伦精品免费另类| 啦啦啦免费观看视频1| www.999成人在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久精品成人免费网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩欧美国产在线观看| 咕卡用的链子| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久人人精品亚洲av| 亚洲第一青青草原| 亚洲 国产 在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av有码第一页| 视频在线观看一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久人人精品亚洲av| 91精品三级在线观看| 69av精品久久久久久| 男人操女人黄网站| 精品日产1卡2卡| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 高潮久久久久久久久久久不卡| 成人欧美大片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久精品国产综合久久久| 欧美日韩黄片免| 国产成人系列免费观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲午夜理论影院| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲 国产 在线| av视频免费观看在线观看| 长腿黑丝高跟| 露出奶头的视频| 99精品久久久久人妻精品| 日本在线视频免费播放| 欧美精品啪啪一区二区三区| 最好的美女福利视频网| 久久久久久国产a免费观看| 日本 欧美在线| 午夜老司机福利片| 高清在线国产一区| 亚洲电影在线观看av| 美女大奶头视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 日韩欧美三级三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 91老司机精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 村上凉子中文字幕在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲五月天丁香| 国产人伦9x9x在线观看| 手机成人av网站| 亚洲伊人色综图| 免费在线观看完整版高清| 久久九九热精品免费| 校园春色视频在线观看| 国产免费男女视频| 婷婷六月久久综合丁香| 国产成人精品久久二区二区91| 午夜精品久久久久久毛片777| 丝袜美足系列| 国产高清视频在线播放一区| 变态另类丝袜制服| 欧美激情高清一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美黄色片欧美黄色片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 天堂影院成人在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线观看免费视频网站a站| 香蕉丝袜av| 99香蕉大伊视频| 99久久精品国产亚洲精品| www.精华液| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| svipshipincom国产片| 性欧美人与动物交配| 色av中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜老司机福利片| 久久这里只有精品19| 无人区码免费观看不卡| 国产成人影院久久av| 午夜福利视频1000在线观看 | a级毛片在线看网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日韩精品青青久久久久久| 久久狼人影院| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久久久久精品吃奶| 欧美中文综合在线视频| 成人永久免费在线观看视频| 午夜视频精品福利| av有码第一页| 无人区码免费观看不卡| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲中文字幕日韩| 精品人妻在线不人妻| 久久久国产精品麻豆| 桃色一区二区三区在线观看| 一级毛片精品| 亚洲中文字幕日韩| 午夜免费观看网址| 日本vs欧美在线观看视频| 最新在线观看一区二区三区| 久热爱精品视频在线9| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线观看免费日韩欧美大片| 色精品久久人妻99蜜桃| 伦理电影免费视频| 亚洲自拍偷在线| 中亚洲国语对白在线视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 大型黄色视频在线免费观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 99香蕉大伊视频| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲片人在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| √禁漫天堂资源中文www| 757午夜福利合集在线观看| 午夜激情av网站| 亚洲av成人av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美日韩精品网址| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 精品久久久久久,| 99riav亚洲国产免费| 日本三级黄在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美成人午夜精品| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品久久久久久精品电影 | 99在线人妻在线中文字幕| www.www免费av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲最大成人中文| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 97人妻天天添夜夜摸| avwww免费| 黑丝袜美女国产一区| 99riav亚洲国产免费| 99久久国产精品久久久| 久久青草综合色| 身体一侧抽搐| 久久精品国产清高在天天线| 桃红色精品国产亚洲av| 99精品在免费线老司机午夜| 18禁观看日本| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国内精品久久久久精免费| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 视频在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品一区av在线观看| 天天添夜夜摸| 欧美成人免费av一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 又大又爽又粗| 最近最新中文字幕大全电影3 | 午夜日韩欧美国产| 久久久国产欧美日韩av| 久久久久久久久久久久大奶| av片东京热男人的天堂| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美乱妇无乱码| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品一区av在线观看| 精品人妻在线不人妻| 免费不卡黄色视频| 国产精品亚洲美女久久久| 大型黄色视频在线免费观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品亚洲美女久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产麻豆69| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 中文字幕色久视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久热在线av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品久久久精品久久久| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品91蜜桃| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人系列免费观看| 亚洲av美国av| 国产高清有码在线观看视频 | 久久久久久国产a免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 正在播放国产对白刺激| 久久久久久人人人人人| 欧美在线一区亚洲| 久久青草综合色| 亚洲少妇的诱惑av| 久久久久九九精品影院| netflix在线观看网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 黄色视频,在线免费观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔女人的私密视频| 天天添夜夜摸| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲在线自拍视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人影院久久av| 一级毛片精品| 欧美黑人精品巨大| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲精品久久国产高清桃花| 88av欧美| 制服人妻中文乱码| 麻豆一二三区av精品| 国产午夜福利久久久久久| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品一品国产午夜福利视频| 88av欧美| 久99久视频精品免费| 黑人操中国人逼视频| 免费少妇av软件| 在线观看免费日韩欧美大片| 99国产精品99久久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成人亚洲精品av一区二区| 黄色 视频免费看| 91成年电影在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 一本综合久久免费| 乱人伦中国视频| 极品教师在线免费播放| 老司机福利观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产成人影院久久av| 欧美性长视频在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线观看www视频免费| 高清黄色对白视频在线免费看| xxx96com| 亚洲自拍偷在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产一区二区激情短视频| 国产精品永久免费网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 大香蕉久久成人网| 91九色精品人成在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜免费激情av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美午夜高清在线| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日韩乱码在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品永久免费网站| 日韩大尺度精品在线看网址 | 国产亚洲av高清不卡| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 真人做人爱边吃奶动态| 精品人妻1区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品影院久久| 动漫黄色视频在线观看| 国产三级在线视频| 日本五十路高清| 国产亚洲欧美在线一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产免费av片在线观看野外av| 黄频高清免费视频| 亚洲五月天丁香| 国产单亲对白刺激| 亚洲专区字幕在线| 免费少妇av软件| 长腿黑丝高跟| 一二三四社区在线视频社区8| 大香蕉久久成人网| 久久久久国产一级毛片高清牌| 又黄又粗又硬又大视频| 少妇粗大呻吟视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 桃色一区二区三区在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产亚洲精品av在线| 不卡一级毛片| 国产成人系列免费观看| 国产精品精品国产色婷婷| 人人妻人人澡人人看| 国产99久久九九免费精品| 国产99白浆流出| 色综合亚洲欧美另类图片| 免费观看人在逋| 国产av精品麻豆| 美女扒开内裤让男人捅视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 一二三四社区在线视频社区8| aaaaa片日本免费| 国产97色在线日韩免费| e午夜精品久久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 久久人人精品亚洲av| 夜夜爽天天搞| 国产成人免费无遮挡视频| 色在线成人网| 黄色片一级片一级黄色片| 久久 成人 亚洲| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91麻豆精品激情在线观看国产| www.www免费av| 国产精品 欧美亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 97人妻天天添夜夜摸| 一进一出好大好爽视频| 欧美在线一区亚洲| 黑人欧美特级aaaaaa片| 在线观看舔阴道视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲专区字幕在线| 国产成人欧美| 一夜夜www| 中文字幕色久视频| 热re99久久国产66热| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成在线人永久免费视频| 精品第一国产精品| 国产成人欧美| 国产国语露脸激情在线看| 妹子高潮喷水视频| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 曰老女人黄片| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 国产99久久九九免费精品| 一a级毛片在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品久久视频播放| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品国产美女av久久久久小说| 国产成人av激情在线播放| 午夜福利一区二区在线看| av视频在线观看入口| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 长腿黑丝高跟| av天堂久久9| 亚洲av成人av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品人妻在线不人妻| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 热99re8久久精品国产| 亚洲第一av免费看| 久久久国产成人精品二区| avwww免费| 色av中文字幕| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲avbb在线观看| 99re在线观看精品视频| 久久影院123| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产人伦9x9x在线观看| avwww免费| xxx96com| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黄色丝袜av网址大全| 十八禁网站免费在线| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲 国产 在线| 女警被强在线播放| 不卡av一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 色老头精品视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 波多野结衣av一区二区av| 免费在线观看黄色视频的| 老熟妇仑乱视频hdxx| 这个男人来自地球电影免费观看| 男人舔女人的私密视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 国产精品影院久久| 免费在线观看亚洲国产| 999精品在线视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲一区二区三区不卡视频| cao死你这个sao货| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲五月婷婷丁香| 成人av一区二区三区在线看| 91国产中文字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久这里只有精品19| 国产99白浆流出| 国产精华一区二区三区| 在线观看www视频免费| 两人在一起打扑克的视频| 男人舔女人的私密视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 中文字幕最新亚洲高清| 国产一区二区在线av高清观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 两性夫妻黄色片| 色在线成人网| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本免费a在线| 精品国产亚洲在线| 国产单亲对白刺激| 91精品三级在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精华一区二区三区| 亚洲自拍偷在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 嫩草影院精品99| 国产精品免费视频内射| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲视频免费观看视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 人妻久久中文字幕网| 午夜a级毛片| 国产精品 欧美亚洲| 免费在线观看完整版高清| 久久香蕉国产精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜影院日韩av| 99国产精品免费福利视频| 国产97色在线日韩免费| 悠悠久久av| 十八禁人妻一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久中文看片网| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品 欧美亚洲| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本vs欧美在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 男人的好看免费观看在线视频 | 成人国产综合亚洲| 99热只有精品国产| 国产99久久九九免费精品| 国产精品,欧美在线| www国产在线视频色| 国产免费av片在线观看野外av| 多毛熟女@视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 俄罗斯特黄特色一大片| 多毛熟女@视频| 69av精品久久久久久| 国产精品一区二区免费欧美| av在线播放免费不卡| 国产av一区在线观看免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99香蕉大伊视频| 国产亚洲av高清不卡| 后天国语完整版免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本 欧美在线| 波多野结衣巨乳人妻| 久久中文字幕一级| 国产99久久九九免费精品| 久久精品国产清高在天天线| 黄色片一级片一级黄色片| 国产av一区二区精品久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 一二三四社区在线视频社区8| 久久 成人 亚洲| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 麻豆一二三区av精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲 欧美一区二区三区| 天天添夜夜摸| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 很黄的视频免费| 精品人妻1区二区| 久久青草综合色| 国产精品精品国产色婷婷| 黄色 视频免费看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 十八禁网站免费在线| 黑人操中国人逼视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| 国产成人av激情在线播放|