電針對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角PI3k/Akt信號通路的作用

薛 夢，孫亞蘭，黃 誠

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2017級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；3.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.贛南醫(yī)學(xué)院疼痛醫(yī)學(xué)研究所，江西 贛州 341000）

神經(jīng)病理性疼痛是困擾全球患者的一種慢性疾病，其發(fā)病機制主要源由外周以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變。大量研究表明，神經(jīng)病理性疼痛患者伴有多種并發(fā)癥，最常見的有焦慮、抑郁和睡眠障礙等，且這些病癥具有復(fù)雜的雙向關(guān)系［1-4］，對患者日?；顒雍徒】禒顩r均造成了重大的影響。據(jù)報道，神經(jīng)病理性疼痛患者的生存質(zhì)量明顯低于普通人群以及未患有神經(jīng)病理性疼痛者［2，5-7］，而且造成了社會負擔(dān)加重和醫(yī)療保健成本增加［5-6，8］。在臨床上也一直未找到治療神經(jīng)病理性疼痛的有效手段。電針在治療神經(jīng)病理性疼痛上具有不良反應(yīng)少和療效顯著的特點，但其作用機制有待進一步闡明。研究發(fā)現(xiàn)，PI3k/Akt 信號通路對在背根神經(jīng)節(jié)和脊髓的神經(jīng)炎癥的發(fā)生與神經(jīng)可塑性的形成有著重要的作用［9-11］，而電針能夠通過干預(yù)疼痛相關(guān)信號通路來抑制神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展［12］。因此，電針是否能夠通過影響PI3k/Akt信號通路來緩解神經(jīng)病理性疼痛是本實驗要探究的一個科學(xué)問題，這將為進一步尋找電針鎮(zhèn)痛機制的潛在靶點打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本實驗選用的SPF 級成年雄性SD大鼠，體重約180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供［動物中心許可證號：SCXK（湘）：2016-0002］，所有動物嚴格遵守贛南醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的要求。大鼠適應(yīng)環(huán)境5 天后，按隨機數(shù)字法將大鼠分為3組：Sham 組、SNI組和SNI+EA 組。Sham 組進行假手術(shù)操作，SNI 組對大鼠左下肢坐骨神經(jīng)分支脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)結(jié)扎剪斷，保留腓腸神經(jīng)。SNI+EA 組在SNI 手術(shù)后1 天對大鼠進行2 Hz電針治療。飼養(yǎng)環(huán)境室溫維持20 ℃～24 ℃左右，晝夜交替，水食自由，在大鼠電針治療21天后取材。

1.2 主要儀器和試劑小型垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)AI600（美國GE），兔抗p-Akt IgG（1∶500，Cell Signaling Technology，#4060），兔抗AktIgG（1∶1 000，CellSignalingTechnology，#9272），兔抗p-PI3k IgG（1∶800，affinity，#3241），兔抗PI3k IgG（1∶1 000，Abcam，ab191606），小鼠抗Tubulin（1∶1 000，索萊寶，M1000140）。

1.3 神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的制備用2%～3%濃度的異氟烷吸入麻醉大鼠后，在左下肢行脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)行結(jié)扎剪斷手術(shù)，保留腓腸神經(jīng)。隨后關(guān)閉手術(shù)切口，待大鼠完全蘇醒后放回籠中，單籠飼養(yǎng)。而Sham組大鼠只暴露坐骨神經(jīng)，不進行結(jié)扎剪斷手術(shù)。

1.4 電針刺激將大鼠置于特制的大鼠固定籠中，使其后腿和尾巴裸露。在大鼠雙下肢的足三里（ST36，脛骨前結(jié)節(jié)外側(cè)5 mm）和三陰交（SP6，足內(nèi)踝尖上3 mm）兩個穴位插入不銹鋼針（長4 mm，直徑0.4 mm）。電針刺激參數(shù)為2 Hz，脈沖寬度為0.6 ms，刺激強度以1～2～3 mA 逐步增加，每個強度持續(xù)10 分鐘。每隔一天對大鼠進行2 Hz EA 刺激，持續(xù)21 天。在2 Hz 電針刺激過程中，所有大鼠始終保持清醒狀態(tài)。

1.5 Western blot檢測在21天后，取大鼠左側(cè)脊髓腰膨大（L4～L6）部分組織并－80 ℃冰凍保存，用RIPA 裂解液裂解脊髓組織，BCA 法測定蛋白濃度，把每個樣品定量為30μg，然后加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液混勻，煮蛋白5分鐘，進行蛋白變性。變性后的蛋白樣品通過10%SDS-PAGE 膠電泳分離，電泳條件從40 V～100 V，并在PVDF 膜上進行恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 小時，4 ℃過夜孵育一抗。第2 天，TBST 洗膜3 次，每次10 分鐘，室溫下孵育二抗2 小時，TBST 洗膜3 次，每次5 分鐘，ECL 顯色液以1∶50 配置，曝光，觀察結(jié)果，對灰度值進行統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析應(yīng)用Graphpad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，Western blot 結(jié)果采用單因素方差分析并隨后進行Newman-Keuls post-hoc 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 Hz電針對SNI模型大鼠脊髓p-PI3k和PI3k蛋白表達的影響為了觀察電針對SNI 大鼠脊髓PI3k的蛋白表達的作用，我們將大鼠分為3個組（每組n=3），實驗結(jié)果如圖1 所示，與Sham 組相比，SNI組大鼠脊髓中p-PI3k 和PI3k 的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與SNI組相比，經(jīng)過21 天2 Hz 電針治療后，SNI+EA 組大鼠脊髓中p-PI3k 和PI3k 的蛋白表達明顯下降（P＜0.05）。

2.2 2 Hz 電針對SNI 模型大鼠脊髓p-Akt 蛋白表達的影響為了觀察電針對SNI 大鼠脊髓Akt 的蛋白表達的影響，我們將大鼠分為3 個組（每組n=4～6），實驗結(jié)果如圖2 所示，與Sham 組相比，造模后，SNI大鼠脊髓的p-Akt蛋白水平顯著升高（P＜0.05），2 Hz 電針治療后，SNI+EA 組大鼠脊髓的p-Akt 蛋白表達出現(xiàn)了明顯下降（P＜0.05），而Akt蛋白表達無顯著變化。

圖1 2 Hz 電針對SNI模型大鼠脊髓PI3k蛋白表達的影響（n=3，±s）

圖2 2 Hz 電針對SNI模型大鼠脊髓Akt蛋白表達的影響（n=4～6，±s）

3 討論

文獻報道，外周神經(jīng)受到的傷害性刺激傳遞到脊髓，在脊髓背角整合后上傳到腦部高級中樞引起疼痛行為的產(chǎn)生［13-14］。疼痛研究一直是國際學(xué)術(shù)界的熱點問題，其中慢性疼痛對患者造成的生存負擔(dān)引起了研究者的廣泛關(guān)注，而神經(jīng)病理性疼痛作為慢性疼痛類型之一，目前的治療方法一直存在不良反應(yīng)大的缺陷，因此急需尋找更有效的治療手段。在中國，電針是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種傳統(tǒng)手段，該技術(shù)是將針灸穴位與現(xiàn)代科技有機相結(jié)合。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)電針能夠緩解SNI大鼠的機械性痛敏，可通過干預(yù)背根神經(jīng)節(jié)和脊髓小膠質(zhì)細胞的激活，阻礙細胞炎癥因子的釋放以及一些相關(guān)痛信號通路分子的表達［15-19］。基于PI3k/Akt 信號通路參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，這提示電針鎮(zhèn)痛機制有可能是通過干預(yù)PI3k/Akt信號通路來發(fā)揮作用的，但有關(guān)電針鎮(zhèn)痛的具體機制還需進一步探索。

實驗表明，PI3k/Akt信號通路是構(gòu)成細胞存活、增殖、凋亡以及自噬行為的重要生存通路［20-21］。在腫瘤細胞中，PI3k/Akt 信號通路的過度激活是引起其發(fā)生的重要途徑，而PI3k 抑制劑可以阻止這種行為的發(fā)生，起到抗腫瘤的作用［22］。目前對于PI3k/Akt 信號通路在各種癌癥（例如：胃癌、肝癌、乳腺癌等）的研究已被大量報道［23-25］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PI3k/Akt信號通路參與了神經(jīng)病理性疼痛的脊髓中樞機制［11］。在CCI 模型大鼠中，PI3k/Akt 信號通路明顯激活，機械痛閾值顯著下降，而給予PI3k 抑制劑后能夠控制這種變化的發(fā)生［11，26-27］。同時，PI3k/Akt 信號通路也參與了脊髓中樞敏化的形成，可影響突觸可塑性的變化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3k/Akt信號通路的激活可誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細胞的激活和炎癥因子的釋放增多，更大程度地促進疼痛行為的產(chǎn)生［11，27-30］。在背根神經(jīng)節(jié)水平，調(diào)控PI3k/Akt信號通路能夠影響神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展進程［31］。

電針是在傳統(tǒng)針灸針上增加電刺激脈沖，再通過施加到穴位的脈沖式電流來增強感覺輸入。這樣可以激活神經(jīng)末梢并將產(chǎn)生的刺激信號傳輸?shù)郊顾韬痛竽X，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生特定的化學(xué)介質(zhì)，以誘導(dǎo)其相關(guān)的生理作用［32］。在神經(jīng)病理性疼痛臨床治療中，不同頻率電針誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛途徑也不同，比如，低頻電針主要通過調(diào)控腦內(nèi)的內(nèi)啡肽和腦啡肽而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果，而高頻電針主要通過影響腦內(nèi)的強啡肽來調(diào)控疼痛通路［33-34］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，低頻電針對神經(jīng)病理性疼痛有著良好的治療效果［35］。本實驗選用2 Hz 電針對神經(jīng)病理性疼痛進行研究也進一步佐證了其他相關(guān)實驗結(jié)果。而且電針在脊髓水平可影響神經(jīng)可塑性的形成和干擾中樞敏化的進展，這些也進一步得到實驗證實［17，36］。在電針治療神經(jīng)病理性疼痛中，對神經(jīng)炎癥的調(diào)控也是影響其效果的重要因素。有實驗表明，電針對一些炎癥信號通路和細胞因子，例如HMGB1/TLR4、NF-κB 和JAK2/STAT3 信號通路以及IL-6、TNFα 和IL-1β 等均能起到抑制作用，致使炎性介質(zhì)釋放減弱，進而緩解疼痛［37-41］。而在對與疼痛密切相關(guān)的小膠質(zhì)細胞激活狀態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，電針能夠抑制背根神經(jīng)節(jié)和脊髓小膠質(zhì)細胞的激活［42-43］。這進一步說明電針可從多方面干預(yù)疼痛相關(guān)通路的信息傳遞以達到治療神經(jīng)病理性疼痛的效果。

綜上所述，神經(jīng)病理性疼痛的復(fù)雜病理生理學(xué)機制是其治療難度大的重要原因。目前臨床治療神經(jīng)病理性疼痛主要集中在阿片類藥物、非甾體類抗炎藥以及三環(huán)類抗抑郁藥的應(yīng)用，但這些藥物存在諸多不良反應(yīng)，如，鎮(zhèn)靜、惡心、嘔吐、白細胞以及血小板減少等［13，44-46］。臨床上也有聯(lián)合應(yīng)用輔助鎮(zhèn)痛藥與治療藥物，以求減少不良反應(yīng)的產(chǎn)生。因此，尋求一種不良反應(yīng)少且能對疼痛有著良好治療效果的手段顯得愈發(fā)重要。已有證據(jù)表明電針在神經(jīng)病理性疼痛治療方面有著良好的效果，而且電針也能明顯緩解這些治療藥物所引起的不良反應(yīng)。在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中，PI3k/Akt 信號通路是一條參與了脊髓中樞可塑性、膠質(zhì)細胞激活以及炎癥因子釋放的重要通路。本實驗也進一步證實，SNI 模型大鼠的PI3k 和Akt 蛋白分子的磷酸化水平明顯上升，而給予2 Hz電針治療后，PI3k和Akt蛋白分子的磷酸化水平顯著下降。這說明2 Hz 電針緩解神經(jīng)病理性疼痛可能是通過抑制PI3k/Akt信號通路來實現(xiàn)的。但是還需進一步應(yīng)用抑制劑和激動劑來佐證電針的鎮(zhèn)痛作用機制。