馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)體系優(yōu)化

王 杰，楊模華，鄭力尉，李朋樂(lè)，陳國(guó)敏，王舒祺，單易婷

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

馬尾松Pinus massoniana為松科Pinaceae 松屬Pinus常綠喬木，具有耐干旱瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)，廣泛分布于我國(guó)亞熱帶地區(qū)17 個(gè)?。▍^(qū)、市），是我國(guó)南方主要的造林樹(shù)種之一，兼有用材、采脂、松花粉藥用等多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值，又是綠化荒山的先鋒造林樹(shù)種，在我國(guó)南方林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮著重要作用[1]。馬尾松高效林業(yè)的發(fā)展急需大量的良種壯苗，可馬尾松種子園種子產(chǎn)量低、無(wú)性繁殖困難，扦插繁殖又具有年齡效應(yīng)，這些嚴(yán)重地制約著馬尾松良種的擴(kuò)繁應(yīng)用。林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Somatic embryogenesis SE）被認(rèn)為是當(dāng)前國(guó)際上林木良種基因型高效快繁的最佳途徑，其利用植物細(xì)胞全能性進(jìn)行植株再生，對(duì)優(yōu)良材料進(jìn)行擴(kuò)繁利用，可不受季節(jié)和場(chǎng)地的限制，在短期內(nèi)獲得大量再生植株。針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生良種快繁在高效人工林培育中已得到普遍地關(guān)注[2]。自1985年國(guó)際上首次在挪威云杉Picea abies中獲得體細(xì)胞胚胎發(fā)生（體胚發(fā)生）植株再生成功以來(lái)[3]，林木體胚發(fā)生已在冷杉屬、云杉屬、松屬、落葉松屬、櫟屬等20 多個(gè)屬中獲得再生植株，并已應(yīng)用于北美喬松P.strobus、輻射松P.radiata、濕地松P.ellittii等無(wú)性系林業(yè)種苗生產(chǎn)和造林實(shí)踐，促進(jìn)了國(guó)際上高效無(wú)性系林業(yè)的發(fā)展[2]。

自1995年黃健秋等[4]首次開(kāi)展馬尾松體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究并得到再生植株以來(lái)，馬尾松體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究取得了可喜的進(jìn)展，如，楊模華等[5]于2011年建立了馬尾松幼胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系；2019年陳婷婷等[6]以抗松材線(xiàn)蟲(chóng)病馬尾松幼胚為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化構(gòu)建了馬尾松體胚發(fā)生再生體系。但胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率低一直是限制馬尾松體胚發(fā)生體系實(shí)踐應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題[5-7]。類(lèi)似的問(wèn)題也是其他針葉樹(shù)種體胚發(fā)生商業(yè)化應(yīng)用的瓶頸，如何提高胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率也正是當(dāng)前針葉樹(shù)種體胚發(fā)生研究所重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題[2,8]。

研究表明，植物體細(xì)胞胚胎發(fā)育是在體外培養(yǎng)環(huán)境條件下誘導(dǎo)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)化并重演類(lèi)似合子胚發(fā)育的進(jìn)程[9]。因此，參照合子胚發(fā)育所需的雌配子體營(yíng)養(yǎng)環(huán)境特征，并在體外培養(yǎng)體系中提供類(lèi)似的培養(yǎng)環(huán)境，是優(yōu)化針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的首選[10-11]。Pullman 等[12]對(duì)火炬松Pinus taeda合子胚不同發(fā)育階段幼胚及其雌配子體中的營(yíng)養(yǎng)元素、激素類(lèi)型及含量、有機(jī)酸、糖類(lèi)等成分組成進(jìn)行了系列研究，把研究成果用于指導(dǎo)火炬松體胚發(fā)生體系的優(yōu)化，取得了顯著的效果。松屬樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究表明，未成熟幼胚最易于誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)，且只有處于特定發(fā)育階段（合子胚發(fā)育階段的2～4 階段[9]）的幼胚才能誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)，即幼胚的胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)存在誘導(dǎo)敏感的“窗口期”[13-14]；同時(shí)，胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的難易還受較強(qiáng)地母樹(shù)基因型遺傳控制[10-14]。Pullman 等[10]對(duì)32 個(gè)火炬松家系胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，不同家系誘導(dǎo)率變動(dòng)在0～53.4%之間，有些屬于誘導(dǎo)敏感型家系，而另一些則屬于誘導(dǎo)頑拗型家系；類(lèi)似的受家系基因型遺傳控制的誘導(dǎo)差異效應(yīng)也在班克松P.banksiana、北美喬松、海岸松P.pinaster和歐洲赤松P.sylvestris的胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)中發(fā)生，且這種受家系基因型遺傳控制的差異誘導(dǎo)效應(yīng)在不同年份中也表現(xiàn)一致[13]。外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也是針葉樹(shù)體胚發(fā)生誘導(dǎo)的關(guān)鍵影響因子，最常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度水平組合通常是2,4-D（1.0～2.0 mg/L）和6-BA（0.5～1.0 mg/L）[12-14]。此外，培養(yǎng)基中的碳源、氮源類(lèi)型及其濃度水平，不僅為培養(yǎng)基提供C、N 大量元素營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，也調(diào)控體胚發(fā)生的環(huán)境，對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)產(chǎn)生重要的影響。不斷積累的研究數(shù)據(jù)表明，培養(yǎng)基中的糖類(lèi)不僅僅是組培體系中重要的碳源及能量來(lái)源，同時(shí)還在組培體系中發(fā)揮著培養(yǎng)基滲透壓調(diào)節(jié)、環(huán)境脅迫因子和信號(hào)分子等多種作用[15-18]。針葉樹(shù)體胚發(fā)生中，采用1%～3%的蔗糖均得到了較好的誘導(dǎo)效果[8,14]，也有研究在培養(yǎng)基中采用葡萄糖或麥芽糖為碳源，如Salajova 等[19]在黑松Pinus nigra胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，添加2%的麥芽糖處理優(yōu)于添加2%蔗糖處理的效果。培養(yǎng)基中多種形式的氮素營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)平衡，對(duì)針葉樹(shù)胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)極其有利。Bozhkov 等[20]在挪威云杉體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，在含有機(jī)氮谷氨酰胺的培養(yǎng)基中調(diào)整無(wú)機(jī)氮中的氨硝比（離子濃度比值）在0.2 左右，有助于挪威云杉體胚發(fā)生的順利進(jìn)行；Laukkanen 等[21]的研究也表明，氨態(tài)氮（NH4+）與硝態(tài)氮（）兩種離子形式之間的平衡極大地影響著歐洲赤松愈傷組織細(xì)胞的生理代謝水平和組織細(xì)胞活力。因此，調(diào)整松屬樹(shù)種體胚發(fā)生培養(yǎng)基中的和的用量及其氨硝比、氮素平衡對(duì)優(yōu)化松屬樹(shù)種胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)具有重要作用。

馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率一直較低，這嚴(yán)重地限制了馬尾松體胚發(fā)生的實(shí)踐應(yīng)用。為提高馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率，優(yōu)化胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)體系，本研究以馬尾松未成熟合子胚為外植體材料，探討母樹(shù)基因型、激素組合、碳源類(lèi)型（麥芽糖、蔗糖、葡萄糖）與質(zhì)量濃度（10、20、30 g/L）、氮源（濃度、濃度，及其氨硝比離子濃度比值）對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響，以期獲得一套成熟穩(wěn)定的胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)體系，提高胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率，為馬尾松體胚發(fā)生植株再生體系的商業(yè)化應(yīng)用提供研究參考和關(guān)鍵技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料來(lái)源及其滅菌方法

供試材料馬尾松未成熟球果于2018年7月12日采于湖南省桂陽(yáng)縣林業(yè)局苗圃馬尾松種子園，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。接種前，將馬尾松球果從冰箱內(nèi)取出，使用軟毛刷蘸洗滌劑把球果表面刷洗干凈，流水下沖洗2 h，然后將球果快速放入已滅菌的燒杯中，置于超凈工作臺(tái)上，75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3 次；再用0.1% HgCl2溶液滅菌20 min，無(wú)菌水沖洗3 次；隨后用經(jīng)75%酒精浸泡消毒過(guò)的枝剪將球果剝開(kāi)，用無(wú)菌鑷子取出種子，置于帶濕潤(rùn)滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用滅菌解剖針剝除種子的外種皮和內(nèi)種皮，取出完整雌配子體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23 ℃暗培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)以L(fǎng)P 為基本培養(yǎng)基，除碳源實(shí)驗(yàn)中需改變培養(yǎng)基中的碳源外，其它培養(yǎng)基均添加10.0 g/L 蔗糖，8.5 g/L 瓊脂粉，0.1 g/L 肌醇，0.45 g/L谷氨酰胺（待培養(yǎng)基高壓滅菌完成后，以過(guò)濾滅菌方式滅菌后加入），0.5 g/L 水解酪蛋白。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入，配制的培養(yǎng)基在高壓滅菌前調(diào)節(jié)pH 值為5.8 左右。

1.2 家系基因型對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

本試驗(yàn)分別對(duì)10 株母樹(shù)自由授粉家系未成熟合子胚（10 個(gè)家系基因型）進(jìn)行不同誘導(dǎo)處理試驗(yàn)，每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)3～6 皿，每皿接種8～10顆，23 ℃暗培養(yǎng)，45 d 后統(tǒng)計(jì)不同家系各處理下獲得胚性細(xì)胞團(tuán)個(gè)數(shù)，計(jì)算胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率及褐化率。

1.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平組合對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

基于前期誘導(dǎo)試驗(yàn)研究結(jié)果篩選出最適宜的3組植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合（表1），配制3 個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，探討不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響；3 個(gè)處理隨機(jī)接種4 個(gè)家系，每皿接種8～10 顆，每處理3～5 皿，23 ℃暗培養(yǎng)，45 d 后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，觀察拍照、記錄胚性細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)狀況。

表1 3 組植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合類(lèi)型Table 1 Three types of plant growth regulator combination

1.4 碳源種類(lèi)及濃度對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

本試驗(yàn)選取2018年7月采集的4 個(gè)家系（k1、k2、k3、k4）未成熟合子胚為材料，探討碳源類(lèi)型及濃度對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響。以L(fǎng)P 為基本培養(yǎng)基，附加1.0 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，碳源包括3 種類(lèi)型（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖），分別設(shè)置3 種質(zhì)量濃度水平（10.0、20.0、30.0 g/L），4 個(gè)家系分別接種9組碳源處理，每處理6～8皿，每皿5～6個(gè)幼胚；23 ℃暗培養(yǎng)，45 d 后統(tǒng)計(jì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率，觀察拍照、記錄胚性細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)狀況。

1.5 氮源對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

本實(shí)驗(yàn)以L(fǎng)P 培養(yǎng)基中原有的氮素濃度為對(duì)照組，使用不同用量的NH4NO3和KNO3調(diào)整各自的濃度，在實(shí)驗(yàn)1.5.1 與1.5.2 的基礎(chǔ)上，將氨硝比（）劃分為5 個(gè)水平（0、0.2～0.4、0.4～0.6、0.6～0.8、1.0），探討誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同的氨硝比（）對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響。

1.6 數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)處理的誘導(dǎo)情況均定期觀察、拍照記錄，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析、制圖，SPSS 2018 軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，LSD 多重比較。并隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，使用照相機(jī)和體式顯微鏡觀察、拍照記錄幼胚胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)過(guò)程中的反應(yīng)和表現(xiàn)，典型樣品取樣壓片，光學(xué)顯微鏡觀察拍照，保存胚性細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)育圖像。

胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出的胚性細(xì)胞團(tuán)/接種幼胚總數(shù)×100%。

褐化率(%)=種子褐化個(gè)數(shù)/ 接種幼胚總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)過(guò)程觀察

將包含未成熟胚的雌配子外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)處理的1～7 周內(nèi)定期觀察培養(yǎng)物的誘導(dǎo)表現(xiàn)和反應(yīng)狀況、形態(tài)變化。定期觀察記錄的結(jié)果表明，胚性培養(yǎng)物呈擠出狀從幼胚珠孔端吐出或噴出，并隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，誘導(dǎo)出的細(xì)胞團(tuán)增殖其體積逐漸增大形成團(tuán)簇狀，其發(fā)生過(guò)程如圖1A-D 和圖1a-d 所示。將外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基初期（圖1a），23 ℃暗培養(yǎng)7～14 d 后，部分外植體開(kāi)始出現(xiàn)反應(yīng)，外觀顏色變微黃，體積略微膨大，有的外植體可見(jiàn)胚性細(xì)胞團(tuán)從珠孔吐出，呈透明氣泡狀或絲狀（圖1b），隨后粘性半透明的胚性細(xì)胞團(tuán)于珠孔處吐絲成團(tuán)狀物并分裂增生（圖1c）或聚集狀增殖（圖1d），21～28 d后，胚性細(xì)胞團(tuán)增殖生長(zhǎng)，體積不斷增大，外觀表現(xiàn)為白色，蓬松，有粘性，結(jié)構(gòu)松軟，表面有絲狀突起且透明發(fā)亮（圖1e），細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)至直徑約為1.0 cm 后，挑取誘導(dǎo)出的細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

在誘導(dǎo)過(guò)程中能觀察到呈現(xiàn)不同誘導(dǎo)反應(yīng)的外植體，誘導(dǎo)處理30 d 后，對(duì)其進(jìn)行內(nèi)外形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，依內(nèi)外形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，大體上可分為以下3 種類(lèi)型（圖2）。第Ⅰ類(lèi)為無(wú)反應(yīng)的外植體，該類(lèi)雌配子體外觀表現(xiàn)為胚乳透明、不飽滿(mǎn)（圖2A），沿脊線(xiàn)剖開(kāi)在其內(nèi)部解剖面上觀察不到成形可辨的合子胚，只有一道淺溝槽發(fā)育（圖2A1）；第Ⅱ類(lèi)為可誘導(dǎo)出正常胚性細(xì)胞團(tuán)的外植體（圖2），該類(lèi)雌配子體外部顏色略發(fā)黃，胚乳不透明，沿脊線(xiàn)剖開(kāi)在其內(nèi)部可觀察到未成熟合子胚雛形，具有區(qū)別明顯可辨識(shí)的胚頭細(xì)胞團(tuán)和胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)兩級(jí)結(jié)構(gòu)。遠(yuǎn)離珠孔的一端是呈“子彈頭”狀排列較規(guī)則的胚頭細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形，其核質(zhì)濃厚，排列緊密；而近珠孔端則為稀薄松散的長(zhǎng)條形液泡明顯的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)狀物，從胚頭一端一直向珠孔外部延伸，突出珠孔后表現(xiàn)為胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)成功。該胚性細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)具有明顯的極性結(jié)構(gòu)，由聚在一起的圓形細(xì)胞組成胚頭狀細(xì)胞，連接著以一定松散狀有序、富含液泡的長(zhǎng)條形細(xì)胞，整體上形成具有極性結(jié)構(gòu)的胚性細(xì)胞團(tuán)。對(duì)照針葉樹(shù)種合子胚發(fā)育階段的劃分[9]，處于此狀態(tài)的合子胚應(yīng)處于合子胚發(fā)育的多胚卵裂后期至子葉前期（圖2B1），該時(shí)期是胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)最適宜的合子胚發(fā)育時(shí)期，稱(chēng)其為誘導(dǎo)的“窗口期”階段；第Ⅲ類(lèi)外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上未成熟合子胚胚軸直接伸長(zhǎng)突出珠孔，無(wú)胚性細(xì)胞團(tuán)發(fā)生（圖2C），該類(lèi)雌配子體外觀呈黃綠色，內(nèi)部解剖觀察發(fā)現(xiàn)，其合子胚已發(fā)育成完整的子葉胚，胚根末端缺乏胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)類(lèi)結(jié)構(gòu)（圖2C1）。對(duì)以上胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)不同反應(yīng)的外植體解剖觀察的結(jié)果表明，幼胚合子胚的不同發(fā)育狀態(tài)對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)有重要影響，當(dāng)雌配子體內(nèi)的合子胚尚未成形或已發(fā)育成子葉胚時(shí)，均未能誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)，而可誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)的外植體，內(nèi)部解剖后發(fā)現(xiàn)，雌配子體內(nèi)可見(jiàn)呈子彈頭狀的合子胚頭，并有一定量的透明長(zhǎng)條狀的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)與其相連，此階段的合子胚，是易于誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)的合子胚發(fā)育階段，且誘導(dǎo)出的胚性細(xì)胞團(tuán)，與雌配子體內(nèi)的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)性同源。因此，做胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)及時(shí)檢測(cè)未成熟球果內(nèi)合子胚的發(fā)育狀態(tài)，挑選已發(fā)育到有適量胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的合子胚發(fā)育階段進(jìn)行采種誘導(dǎo)，對(duì)提升馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)反應(yīng)具有重要作用。

圖1 馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)過(guò)程Fig.1 Initiation of embryogenic masses of Pinus massoniana

圖2 不同誘導(dǎo)反應(yīng)的外植體內(nèi)外部狀態(tài)Fig.2 The performance of outer and inside structure on the different initiation responses of induced explant

2.2 家系基因型對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

表2是10 個(gè)馬尾松家系胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，家系基因型對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)有顯著影響（P＜0.05）。所采集的10 個(gè)自由授粉家系中，家系內(nèi)平均誘導(dǎo)率最高可達(dá)17.5%，最低為0。其中3 號(hào)家系與7 號(hào)家系胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)狀態(tài)最好，誘導(dǎo)率較高，分別為17.50%、15.83%，在誘導(dǎo)前期（＜30 d）與后期（30～60 d）均陸續(xù)產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，其褐化率顯著低于其它組，僅分別為13.36%、35.36%，所產(chǎn)生的胚性細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)蓬松，增殖生長(zhǎng)較快，細(xì)胞團(tuán)表面有突起，能穩(wěn)定增殖，鑒定為正常的胚性細(xì)胞團(tuán)，是后期增殖培養(yǎng)的良好胚性細(xì)胞團(tuán)材料。而其它家系胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率均低于10.00%，且褐化率高，褐化率幅度分布在44.85%～89.92%之間，同時(shí)，這些胚性細(xì)胞團(tuán)在后期的增殖培養(yǎng)中也容易水滯化或發(fā)生發(fā)黃、發(fā)黑，直至死亡消失的現(xiàn)象，僅有少數(shù)細(xì)胞系能夠正常增殖。本實(shí)驗(yàn)中成功篩選到2 個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)敏感型母樹(shù)基因型，誘導(dǎo)率超過(guò)15%。

表2 不同家系基因型對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響?Table 2 Effects of different family genotypes on the initiation of EM on Pinus massoniana

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平組合對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素廣泛地參與植物細(xì)胞分裂與分化。在植物體胚發(fā)生過(guò)程中，選擇適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平組合有利于胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)。基于前期研究結(jié)果已篩選到3 組較佳的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這3 組植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率在這3 組處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在3 號(hào)處理上，使用1.5 mg/L 2.4-D+1.0 mg/L 6-BA）的培養(yǎng)基上其誘導(dǎo)率稍高，達(dá)到14.85%，且誘導(dǎo)出來(lái)的胚性細(xì)胞團(tuán)白色蓬松，表面有絲狀突起，胚性細(xì)胞團(tuán)的極性結(jié)構(gòu)發(fā)育，是良好的增殖培養(yǎng)材料。故3 號(hào)處理組合可作為今后馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)推薦使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合（表3）。

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平組合對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Table 3 Effect of plant growth regulator combinations on the initiation of EM on Pinus massoniana

2.4 碳源類(lèi)型及濃度對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

圖3為4 個(gè)家系在不同碳源類(lèi)型及濃度處理下的研究結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，調(diào)整碳源及其濃度水平可以在一定程度上提高胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率，但家系基因型與碳源類(lèi)型及濃度水平之間存在交互作用，不同家系對(duì)碳源處理的反應(yīng)具有家系的特異性，綜合評(píng)價(jià)后，推薦較適宜的碳源為30.0 g/L的蔗糖。由圖3可知，3 種碳源（麥芽糖、蔗糖、葡萄糖）下均可以誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)，但不同家系其最適合的碳源類(lèi)型及濃度水平各不相同。k1家系在30.0 g/L 的蔗糖處理中，獲得最高誘導(dǎo)率，為40.0%，顯著高于其它處理組，而同樣地k1 家系在其他處理中誘導(dǎo)率有差異，最低的僅為5.0%；k2 家系在20.0 g/L 的麥芽糖處理中，獲得最高誘導(dǎo)率，為22.86%，其與同家系的其它處理組之間有差異但差異不顯著，k2 家系中甚至有誘導(dǎo)率為0 的現(xiàn)象；k3 家系在30.0 g/L 的葡萄糖處理下，獲得最高誘導(dǎo)率，為23.33%，該家系的其他處理中也出現(xiàn)了0 誘導(dǎo)率；在k4 家系中，方差分析顯示碳源對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響差異不顯著（P＞0.05），但30.0 g/L 葡萄糖處理下獲得最高誘導(dǎo)率（15.74%），在10.0 g/L 蔗糖處理下其胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率為0。

圖3 碳源對(duì)4 個(gè)馬尾松家系胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Fig.3 Effect of different sugar sources on the initiation of EM on four Pinus massoniana families

對(duì)以上4 個(gè)家系在不同碳源水平處理下的誘導(dǎo)數(shù)據(jù)混合，僅按不同類(lèi)型碳源及其濃度水平做統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)各類(lèi)碳源水平下的誘導(dǎo)率隨碳源濃度的增加而升高（圖4），使用30 g/L 蔗糖的處理其平均誘導(dǎo)率最高，達(dá)到18.51%，因此，30 g/L的蔗糖為今后推薦使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的糖源。如在不同碳源的低（10.0 g/L）、中（20.0 g/L）、高（30.0 g/L）3 種濃度水平處理下，蔗糖各水平得到的平均誘導(dǎo)率分別為9.77%、11.51%、18.51%，葡萄糖各水平得到的平均誘導(dǎo)率分別為7.76%、9.58%、16.01%，而麥芽糖各水平下的平均誘導(dǎo)率分別為3.12%、9.88%、12.78%。由此可見(jiàn)，高濃度30.0 g/L 的蔗糖是誘導(dǎo)培養(yǎng)基的首選碳源，獲得最高平均誘導(dǎo)率（18.51%），且在同一濃度水平下，蔗糖處理的誘導(dǎo)率均高于葡萄糖、麥芽糖處理的誘導(dǎo)率；隨碳源濃度水平增加其誘導(dǎo)率升高的現(xiàn)象，還值得進(jìn)一步探討。

在實(shí)驗(yàn)觀察中還發(fā)現(xiàn)，不同類(lèi)型碳源下誘導(dǎo)出的胚性細(xì)胞團(tuán)在外觀形態(tài)表現(xiàn)上有差異。當(dāng)碳源為蔗糖時(shí)，胚性細(xì)胞團(tuán)整體上表現(xiàn)為白色或淡黃色，顆粒狀，半透明，表面突起多，在后期的增殖培養(yǎng)基中仍可正常增殖；在葡萄糖處理組中，外植體誘導(dǎo)反應(yīng)的響應(yīng)較快，胚性細(xì)胞團(tuán)與蔗糖組上的表現(xiàn)類(lèi)似，但后期轉(zhuǎn)入以蔗糖為碳源的增殖培養(yǎng)基后，細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始發(fā)黃、變黑，最后失去增殖潛能；而在麥芽糖處理組中產(chǎn)生的胚性細(xì)胞團(tuán)則為白色，結(jié)構(gòu)緊致，不透明，突起較少，后期的增殖狀態(tài)不佳，難以建立穩(wěn)定的增殖體系。

圖4 碳源對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Fig.4 Effect of carbon source on induction of embryogenic masses

2.5 氮源對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

表4 濃度對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Table 4 Effectofconcentrations onthe initiation of EM onPinus massoniana

表4 濃度對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Table 4 Effectofconcentrations onthe initiation of EM onPinus massoniana

NH4NO3 濃度Concentration of NH4NO3平均誘導(dǎo)率Average induction rate of EM /%0 78 4 5.13±0.08 b 1/2 LP 84 15 17.86±0.166 a LP 89 15 16.85±0.154 a 3/2 LP 70 9 12.85±0.145 ab 2 LP 78 4 5.13±0.08 b外植體個(gè)數(shù)Explant number胚性細(xì)胞團(tuán)數(shù)Embryonal masses

通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中KNO3的用量來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基離子的濃度水平，研究培養(yǎng)基中不同離子濃度對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響，對(duì)照處理為原LP 培養(yǎng)基中的原離子濃度，結(jié)果如表5所示。由表5可知不同的離子濃度水平對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但在原處理（LP）上適當(dāng)提高離子濃度（3/2 LP）有利于胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率達(dá)到15.48%；在這5 個(gè)處理中，最低的誘導(dǎo)率出現(xiàn)在極低處理組（0）處理中（7.14%），當(dāng)提高離子濃度達(dá)到2 LP 水平時(shí)，誘導(dǎo)率降至8.97%，低于適量提升離子濃度的處理組（3/2 LP）的誘導(dǎo)率，這說(shuō)明適量調(diào)整提升培養(yǎng)基中的離子濃度，如3/2 LP 水平，能提升胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率，而培養(yǎng)基中過(guò)高（2 LP）和過(guò)低（0）不添加濃度不利于胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)。在0 處理中雖然仍可誘導(dǎo)出少量胚性細(xì)胞團(tuán)，但在此（0）處理下得到的胚性細(xì)胞團(tuán)，其后期增殖培養(yǎng)中出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞團(tuán)外觀顏色發(fā)生變黑變黃的現(xiàn)象，最后失去增殖潛能。這說(shuō)明，離子濃度太低，對(duì)細(xì)胞團(tuán)后期的增殖生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。

表5 濃度對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Table 5 Effect ofconcentrations on the initiation of EMonPinus massoniana

表5 濃度對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Table 5 Effect ofconcentrations on the initiation of EMonPinus massoniana

KNO3 濃度Concentration of KNO3外植體個(gè)數(shù)Explant number胚性細(xì)胞團(tuán)數(shù)Embryonal masses平均誘導(dǎo)率Average induction rate of EM /%0 84 6 7.14±0.085 a 1/2 LP 75 8 10.67±0.146 a LP 87 8 9.19±0.107 a 3/2 LP 84 13 15.48±0.122 a 2 LP 78 7 8.97±0.11 a

表6 氨硝比對(duì)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響Table 6 Effect of the ammonium / nitrate molar ratio on the initiation of EM on Pinus massoniana

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本研究針對(duì)馬尾松幼胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系不穩(wěn)定、胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率低的問(wèn)題，從家系基因型、誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、C、N 類(lèi)型及其濃度水平等方面開(kāi)展了馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)體系優(yōu)化探討，獲得的主要結(jié)論是：不同家系基因型對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)有顯著差異，受較強(qiáng)的遺傳控制，因此，以L(fǎng)P 基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選用誘導(dǎo)敏感型基因型，并在其幼嫩合子胚發(fā)育的多胚卵裂后期至子葉前期進(jìn)行誘導(dǎo)處理，能提高胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率；培養(yǎng)基中應(yīng)用30 g/L 的蔗糖，調(diào)控培養(yǎng)基中氨硝比（NH4+/NO3-）離子濃度比值在0.2～0.4 的范圍內(nèi)，并選用1.5 mg/L 2.4-D+1.0 mg/L 6-BA 的激素配比，經(jīng)4～8 周誘導(dǎo)期的暗培養(yǎng)，保持培養(yǎng)溫度23 ℃，馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率最高可達(dá)40%，平均誘導(dǎo)率也可提高至17%以上，這為建立穩(wěn)定的馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)體系提供了研究參考和關(guān)鍵技術(shù)支撐。

3.2 討 論

3.2.1 母樹(shù)基因型對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

不同母樹(shù)基因型誘導(dǎo)馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)的研究結(jié)果表明，不同家系胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)存在顯著地差異，這與在針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生中已發(fā)現(xiàn)的家系基因型差異誘導(dǎo)遺傳控制效應(yīng)的表現(xiàn)一致[8,12-13]，然而，這種受遺傳控制的家系差異誘導(dǎo)效應(yīng)已成為阻礙針葉樹(shù)體胚發(fā)生實(shí)踐應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題之一，并得到人們地普遍關(guān)注[2,14]。如若僅能在某些誘導(dǎo)敏感型的基因型上獲得林木體胚發(fā)育的成功，這將極大地限制所能造林應(yīng)用的無(wú)性系數(shù)量，特別是對(duì)一些性狀表現(xiàn)優(yōu)異的良種可能因體胚發(fā)生困難而導(dǎo)致優(yōu)良基因型在無(wú)性系林營(yíng)建中的流失，這將進(jìn)一步限制優(yōu)良材料遺傳增益的持續(xù)獲得；無(wú)性系基因型數(shù)量有限，林分群體遺傳多樣性便會(huì)不足，其結(jié)果會(huì)表現(xiàn)出無(wú)性系林分對(duì)不良環(huán)境抗性弱，進(jìn)而嚴(yán)重影響林分健康和穩(wěn)定性[8,13]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)期采集的不同家系，其各自合子胚發(fā)育階段的成熟度存在著一定差異，因針葉樹(shù)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)存在誘導(dǎo)敏感的“窗口期”[2,13]，那么，這些當(dāng)前表現(xiàn)為誘導(dǎo)困難的頑拗型家系，是否因其沒(méi)處于合子胚發(fā)育誘導(dǎo)敏感“窗口期”而導(dǎo)致誘導(dǎo)率低，這個(gè)問(wèn)題還值得進(jìn)一步研究。這也提醒我們，預(yù)先實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各家系合子胚的發(fā)育狀態(tài)，挑選家系合子胚誘導(dǎo)敏感的“窗口期”進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)獲得更穩(wěn)定可靠的胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)體系更有保障。而對(duì)那些確實(shí)誘導(dǎo)困難但又表型表現(xiàn)優(yōu)良的家系，可考慮利用雜交育種方式，把誘導(dǎo)“頑拗型”家系與誘導(dǎo)“敏感型”家系控制雜交，通過(guò)基因型遺傳重組獲得雜交后代幼胚，然后再用于胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)及體胚發(fā)生植株再生，以發(fā)揮優(yōu)良基因型無(wú)性快繁的遺傳增益[22]。此外，盡可能借鑒合子胚發(fā)育的環(huán)境需求（不同發(fā)育階段雌配子體各個(gè)營(yíng)養(yǎng)組分特征）來(lái)提供幼胚胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)、增殖所需要的培養(yǎng)基環(huán)境條件，也是今后對(duì)“頑拗型”家系優(yōu)化誘導(dǎo)體系、提高其胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率的可選途徑[10-11]。

3.2.2 碳源對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

在本研究中，提高誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的碳源濃度水平，即用較高濃度的蔗糖、麥芽糖等（濃度水平達(dá)30.0 g/L），均可不同程度地提高胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)率，且家系誘導(dǎo)率與碳源類(lèi)型及水平間存在交互效應(yīng)，如k1 家系在30.0 g/L 的蔗糖處理下，最高誘導(dǎo)率達(dá)到了40.0%。而Fuentes 等[23]在咖啡胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)中已發(fā)現(xiàn)，不同的家系其最高誘導(dǎo)率也具有碳源類(lèi)型及濃度水平的差異性，本研究中家系基因型與糖源交互處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Fuentes 等[23]的研究結(jié)果類(lèi)似。原因可能是，各個(gè)母樹(shù)樹(shù)體內(nèi)生理特性的異質(zhì)性使得各自幼胚在胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)中所需要的環(huán)境條件也出現(xiàn)差異化需求，似乎有必要推行不同家系誘導(dǎo)的差異化誘導(dǎo)環(huán)境策略。然而，針對(duì)各個(gè)家系幼胚的特殊生理環(huán)境需求，差異化準(zhǔn)備培養(yǎng)基做誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，實(shí)踐上卻不具有可行性。綜合各家系在不同碳源水平下的反應(yīng)，在30.0 g/L 的蔗糖上獲得了最高的平均誘導(dǎo)率，兼顧誘導(dǎo)體系經(jīng)濟(jì)、方便和高效的要求，推薦采用30.0 g/L 蔗糖做誘導(dǎo)培養(yǎng)基的糖源，以取得相對(duì)較高的誘導(dǎo)率。

提高糖濃度可在一定程度上提高了馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率，這可能與高濃度糖源在培養(yǎng)基中對(duì)外植體（包含未成熟合子胚的雌配子體）形成一種高滲透壓的脅迫環(huán)境有關(guān)。近年來(lái)，受益于分子生物學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)制機(jī)理的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究也得到了長(zhǎng)足地發(fā)展，F(xiàn)ehér[24]和Zavattieri 等[25]綜述已有的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究結(jié)果后認(rèn)為，體細(xì)胞胚胎發(fā)生是受到脅迫的植物細(xì)胞應(yīng)對(duì)極端環(huán)境脅迫情形下基因差異表達(dá)重編程的結(jié)果，胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)發(fā)生是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的典型應(yīng)激反應(yīng)，因此，提高培養(yǎng)基中的環(huán)境脅迫壓力有利于發(fā)生細(xì)胞命運(yùn)改變的決定性事件[24]。仔細(xì)觀察馬尾松胚性細(xì)胞誘導(dǎo)成功的外觀表現(xiàn)和解剖圖片，注意到最初馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)絕大部分均從雌配子體珠孔一端擠出、或呈噴射狀突出珠孔，切開(kāi)珠孔，挑出內(nèi)外相聯(lián)系的胚性細(xì)胞團(tuán)，從解剖圖上可見(jiàn)，從珠孔端擠出的胚性細(xì)胞團(tuán)，是一團(tuán)與雌配子內(nèi)所包含的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞結(jié)構(gòu)同源的培養(yǎng)物，且隨蔗糖濃度的增加，胚性細(xì)胞團(tuán)的擠出率升高。這也能一定程度上解釋?zhuān)瑸槭裁刺幱诙嗯呗蚜哑谥磷尤~前期階段的針葉樹(shù)幼胚，是胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的敏感“窗口期”，這與當(dāng)前其雌配子體內(nèi)現(xiàn)存有較多胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)有關(guān)[9]，隨著合子胚的繼續(xù)成熟，這些胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)因發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)逐漸消失殆盡[26]，其幼胚誘導(dǎo)胚性細(xì)胞團(tuán)的潛力也逐漸喪失；而過(guò)于幼嫩的合子胚（此期因還未有成形可辨識(shí)的合子胚雛形與胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)的極性結(jié)構(gòu)），可能因其還沒(méi)有發(fā)育出足量的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)，故也難于誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)。

蔗糖在植物組織培養(yǎng)中作為培養(yǎng)基的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)和脅迫環(huán)境因子，已得到人們的廣泛關(guān)注[15]。已有多個(gè)研究表明，碳源在植物組織培養(yǎng)中，除了供給外植體碳素營(yíng)養(yǎng)外，還是培養(yǎng)基中滲透壓調(diào)節(jié)、環(huán)境脅迫的因子，此外，蔗糖還可作為信號(hào)分子，參與細(xì)胞團(tuán)的增殖生長(zhǎng)代謝過(guò)程[15-16]。不斷積累的研究數(shù)據(jù)，正更新著人們對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生細(xì)胞分化方向決定的認(rèn)識(shí)。一般認(rèn)為，體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物細(xì)胞在內(nèi)源和外源信號(hào)作用下，應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)細(xì)胞命運(yùn)重編程的應(yīng)激反應(yīng)和自適應(yīng)調(diào)節(jié)結(jié)果[24-26]。本研究觀察到，誘導(dǎo)出的馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)，實(shí)際上是一團(tuán)從雌配子體珠孔端擠出的、與雌配子內(nèi)所包含的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞結(jié)構(gòu)同源的培養(yǎng)物，且隨蔗糖濃度的增加，胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率升高。與低糖濃度處理相比，高糖濃度處理的培養(yǎng)基上具有更高的滲透壓水平[10]，故而，這將對(duì)其上放置的外植體（包含未成形合子胚的雌配子體）造成更高的培養(yǎng)環(huán)境脅迫壓力，而這種高滲透壓脅迫可能會(huì)干擾雌配子體內(nèi)現(xiàn)存的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞胞間連絲的連接，促使這些胚性細(xì)胞在生理上發(fā)生分離[27]，并在培養(yǎng)基外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（2,4-D,6-BA）的作用下，使得原本應(yīng)在雌配子體內(nèi)經(jīng)歷程序性死亡的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)向細(xì)胞分裂增殖方向轉(zhuǎn)變[26]，從而發(fā)生胚性細(xì)胞團(tuán)在雌配子體內(nèi)的增殖，最終胚性培養(yǎng)物從珠孔端擠出，表現(xiàn)為成功誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞團(tuán)。而本研究中通過(guò)增加培養(yǎng)基中碳源濃度提升胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)反應(yīng)的分子機(jī)制，還值得進(jìn)一步研究。

3.2.3 氮源對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基中的氮素水平是影響植物細(xì)胞生命活動(dòng)的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的氨硝比（）調(diào)整在0.2～0.4 之間時(shí)，得到了較高的誘導(dǎo)率（14.0%左右）。Bozhkov等[20]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的N 素平衡（有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮）顯著地影響挪威云杉胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)，在含有機(jī)氮3.0 nM 谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，氨硝比（）控制在0.2 左右，挪威云杉胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的效率最高；而在本馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的研究中，也得到了與以上研究類(lèi)似的結(jié)果，這為今后通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基組成氮素成分提升針葉樹(shù)種胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率提供了一種可借鑒的途徑。

Kaul 等[28]研究表明，培養(yǎng)基中不同無(wú)機(jī)氮供應(yīng)形式（、或兩者兼用）對(duì)北美喬松愈傷組織生長(zhǎng)有顯著地影響，若培養(yǎng)基中只使用銨態(tài)氮（NH4Cl）則對(duì)北美喬松愈傷組織的生長(zhǎng)不利，但這種不利影響可隨同時(shí)添加硝態(tài)氮（NH4NO3）而得到改善。Amancio 等[29]研究了不同無(wú)機(jī)氮形式對(duì)玉米愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)在不同無(wú)機(jī)氮形式的處理下，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)合成和生理代謝均發(fā)生了較大的差異，具體表現(xiàn)是在不同處理下，細(xì)胞內(nèi)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的pH 值以及氨基酸類(lèi)物質(zhì)的合成等均有不同程度地差異表現(xiàn)。另外，Laukkanen 等[21]研究歐洲赤松愈傷組織在不同無(wú)機(jī)氮供給培養(yǎng)基處理上的反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中不同無(wú)機(jī)氮供給利用形式，明顯地影響細(xì)胞代謝和細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)的活力水平。因此，調(diào)整培養(yǎng)基中的氨硝比（）可能是優(yōu)化細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控措施。Grimes 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，改變培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的比例，可增加水稻幼胚對(duì)生長(zhǎng)素的敏感程度；而通過(guò)增加或降低、的用量，對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)及細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)，均出現(xiàn)了與其上研究類(lèi)似的研究結(jié)果。因此，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系優(yōu)化中，考慮培養(yǎng)基中氮素利用形式及其平衡是今后胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)中重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，尤其是氨硝比（）的合理取值范圍，是培養(yǎng)基優(yōu)化探討的一個(gè)方向。

在本研究中分別從篩選誘導(dǎo)敏感基因型和優(yōu)化培養(yǎng)基成分兩個(gè)方面著手，成功提高了馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)率；然而，同期采種的不同家系其誘導(dǎo)率有顯著地差異，既可能是基因型的影響，也有可能是合子胚發(fā)育階段不同步而導(dǎo)致。因此，在今后的馬尾松胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)中，應(yīng)著重考慮以下3 個(gè)方面：1）擴(kuò)大母樹(shù)基因型篩選范圍，選出更多誘導(dǎo)敏感且胚性細(xì)胞團(tuán)增殖培養(yǎng)胚性保持質(zhì)量穩(wěn)定的母樹(shù)基因型；2）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)適宜于胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的未成熟合子胚誘導(dǎo)敏感“窗口期”進(jìn)行采種誘導(dǎo)，以確保在最適誘導(dǎo)期處理家系，以提高胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)率；3）今后可從優(yōu)化調(diào)整培養(yǎng)基組成成分方面探討誘導(dǎo)體系，注重碳、氮平衡及其碳源類(lèi)型與氮素形式培養(yǎng)基成分的合理調(diào)整，并對(duì)不同優(yōu)化措施下胚性細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)的分子作用機(jī)制方面開(kāi)展探討，可為針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

感謝：本研究得到了湖南省桂陽(yáng)縣林業(yè)局苗圃唐黎、伍新云，湖南省林業(yè)科學(xué)研究院許忠坤、黃帆等的大力支持，他們積極參與為本實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源和采樣協(xié)助，在此一并感謝。