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    新型冠狀病毒實時熒光雙重逆轉(zhuǎn)錄RPA的建立及其在食品檢測中的應(yīng)用

    2020-12-04 08:07:18呂繼洲吳紹強張舟鄧俊花袁向芬王彩霞馮春燕林祥梅
    生物技術(shù)通報 2020年11期
    關(guān)鍵詞:探針核酸引物

    呂繼洲 吳紹強 張舟 鄧俊花 袁向芬 王彩霞 馮春燕 林祥梅

    (中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100176)

    自2019年12月以來,新型冠狀病毒(SARSCoV-2)所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在湖北省武漢市暴發(fā)蔓延,感染人數(shù)不斷增加。根據(jù)約翰霍普金斯大學(xué)數(shù)據(jù)顯示,截至北京時間2020年11月6日07時03分,全球累計新冠肺炎確診病例4897萬例,死亡病例123萬,傳染力遠超2003年的非典型肺炎(SARS)[1]。

    SARS-CoV-2是β屬單股正鏈RNA病毒,具有典型的5'端帽結(jié)構(gòu)和3'端Poly(A)尾,屬于巢狀病毒目、冠狀病毒科。冠狀病毒分為α、β、γ、δ四個屬,因其在電鏡下的形狀似皇冠,故命名為冠狀病毒[2]。SARS-CoV-2基因在同一條編碼鏈上有5個典型的開放讀碼框架(ORF),包括開放讀碼框架1ab多蛋白(ORF1ab,7096 aa),刺突糖蛋白(Spike gene,S gene,1273 aa),包膜蛋白(Envelope gene,E gene,75 aa),膜蛋白(Membrane gene,M gene,222 aa)以及核衣殼蛋白(Nucleocapsid gene,N gene,419 aa)[3]。SARS-CoV-2感染機體后,病毒RNA是最先能被檢測的標志物,人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體(IgM、IgG)滯后于病毒核酸,目前對COVID-19確診基本以SARS-CoV-2病毒核酸檢測陽性為依據(jù)[4]。截止到2020年4月7日,國家藥監(jiān)局審批的新型冠狀病毒檢測試劑盒共25個,其中有16個試劑盒是核酸檢測方法。實時熒光RT-PCR敏感度高、特異性強,成本較低,成為目前主要的檢測方法。與此同時,宏基因高通量測序技術(shù)、數(shù)字PCR、LAMP、RPA以及基因芯片技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于SARS-CoV-2核酸檢測[4]。SARS-CoV-2病毒可能來源于蝙蝠以及穿山甲等動物[5-6]。因此,在動物組織和動物源性食品中開展SARS-CoV-2病毒的檢測監(jiān)測就成為防控COVID-19疫情的一個重要環(huán)節(jié),目前尚未有相關(guān)SARS-CoV-2檢測技術(shù)在食品及動物組織中應(yīng)用的報道。

    重組酶聚合酶擴增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年P(guān)iepenburg等研發(fā)出的一種等溫擴增技術(shù),它能在37-42℃恒溫條件下快速完成數(shù)十億DNA擴增。RPA反應(yīng)體系中主要包括重組酶(uvsX)、單鏈結(jié)合蛋白(Gp32)和鏈置換DNA聚合酶Bsu,其反應(yīng)原理不同于體外DNA復(fù)制的PCR技術(shù),重組酶uvsX在常溫下就能打開DNA雙鏈進行變性,因此不需要熱循環(huán)PCR儀[7]。RPA反應(yīng)技術(shù)靈敏度高,反應(yīng)快速,方法簡便易行。本研究目的為建立針對SARS-CoV-2的熒光RPA快速檢測技術(shù),并初步應(yīng)用于食品、動物組織器官以及臨床樣本中SARS-CoV-2的檢測。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗中所需引物、探針以及靶標基因由北京六合華大基因科技有限公司合成并提供;食品(包括生羊肉片、生豬肉、熟牛肉、熟雞肉、香腸以及速凍水餃)購自7fresh生鮮超市;實驗用5-6周的Balb/C雌鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;SARS-CoV-2病毒cDNA核酸由浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供;6份SARS-CoV-2病毒疑似臨床樣本(編號:2011、2012、2013、2014、2015及2016)由上海市臨床檢驗質(zhì)量控制中心提供。H1N1甲型流感病毒(influenza A/H1N1 virus)、冠狀病毒豬流性腹瀉病毒(PEDV)、冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、小反芻獸疫病毒(PRRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、輪狀病毒(RV)等其核酸RNA由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢驗與檢疫研究所實驗室保存。SARS-CoV-2病毒S基因全長質(zhì)粒2019-nCoV S由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,質(zhì)粒載體為pUC57。

    1.2 方法

    1.2.1 RNA核酸的提取 相關(guān)樣品材料的RNA核酸提取均采用“Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit”試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany),并按使用說明書操作。

    1.2.2 SARS-CoV-2假病毒顆粒制備 以GenBank公布Wuhan-Hu-1分離株(登錄號為NC_045512.2)基因序列為基準,選擇N基因部分序列進行拼接重組,基因序列總長914 bp,加酶切位點后,送華大基因進行人工合成,連入噬菌體表達載體p-MS2。經(jīng)過一系列表達與純化,獲得SARS-CoV-2的假病毒顆粒(VLPs),使用SM(0.1 mol/L NaCl,8 mmol/L MgSO4·7H2O,50 mmol/L Tris-Cl pH7.5,2%明膠溶液)溶液重懸VLPs,作為陽性質(zhì)控品,模擬病毒。

    1.2.3 RPA引物探針的設(shè)計 按照RPA引物探針設(shè)計原則[8],分析SARS-CoV-2的N基因以及S基因保守序列,設(shè)計兩套RPA引物、探針(表1)。

    表1 RPA試劑引物探針設(shè)計與序列

    1.2.4 熒光RT-RPA反應(yīng) RNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)購自濰坊安普未來生物科技有限公司,貨號WLRE8205KIT,含有逆轉(zhuǎn)錄酶、重組酶、聚合酶等,以RNA核酸為模板可在20 min內(nèi)完成檢測全過程。單重?zé)晒釸PA反應(yīng)體系(50 μL):Buffer A 29.4 μL,上下游引物各2 μL(10 μmol/L),探針0.6 μL(10 μmol/L),核酸模板 2 μL,RNase-free Water 9.3 μL,ROX染料0.2 μL,Buffer B 2.5 μL。雙重?zé)晒釸PA反應(yīng)體系(50 μL):Buffer A 29.4 μL,上下游引物1各1 μL(10 μmol/L),探 針1 0.4 μL(10 μmol/L),上下游引物2各1 μL(10 μmol/L),探針2 0.4 μL(10 μmol/L),核酸模板2 μL,RNase-free Water 9.1 μL,ROX染料0.2 μL,Buffer B 2.5 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為:42℃,20 min,每30 s收集一次熒光信號。儀器自動采集熒光信號,可實時觀察熒光擴增信號,使用ABI的7500熒光PCR儀。為了保證反應(yīng)同時進行,2.5 μL Buffer B應(yīng)該最后加在八連管的蓋子上,小心翻轉(zhuǎn)蓋上,然后上下顛倒八連管混勻,離心。整個操作過程要在冰上進行。RPA 反應(yīng)在 42℃恒溫下反應(yīng)4 min 后,取出反應(yīng)管進行渦旋震蕩并離心,再在42℃恒溫下反應(yīng)16 min。

    1.2.5 N基因熒光RPA分析敏感度試驗取50 μL的VLPs,RNA核酸由Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取,最終用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA,放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。提取VLPs核酸RNA,應(yīng)用微滴式逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR對VLPs所含RNA進行精確定量(N基因拷貝數(shù),結(jié)果未展示),其濃度為5.32×105copies/μL。然后經(jīng)稀釋,調(diào)整,使N基因拷貝數(shù)濃度為5×104-5 copies/μL,RPA反應(yīng)體系加入2 μL核酸,反應(yīng)體系中核酸終濃度為105-10 copies/μL。

    1.2.6 S基因熒光RPA分析敏感度試驗 以生工生物工程(上海)股份有限公司提供的2019-nCoV S質(zhì)粒為模板,按照其濃度拷貝數(shù)換算公式1.492×1011copies/μg,經(jīng)系列倍比稀釋,使得2019-nCoV S質(zhì)??截悢?shù)濃度為5×104-5 copies/μL。RPA反應(yīng)體系加入2 μL模板,最終濃度為105-10 copies/μL。

    1.2.7 熒光RPA分析特異性試驗 以influenza A/H1N1、PEDV、TGEV、PRRV、FMDV、RV等病毒的核酸RNA為模板,進行熒光RT-RPA反應(yīng)。SARS-CoV-2的cDNA作為陽性對照,而Rnase-free water作為陰性對照。

    1.2.8 熒光RPA應(yīng)用于食品中檢測SARS-CoV-2 6種常見食品,各取50 mg;陽性組,每份樣品與10 μL新冠病毒VLPs混合;對照空白組,每份樣品與10 μL SM溶液混合。RNA核酸由Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取,最終應(yīng)用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA,放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。SARS-CoV-2的cDNA作為陽性對照,而Rnase-free water作為陰性對照。

    1.2.9 熒光RPA應(yīng)用于動物組織中檢測SARSCoV-2 5-6周的Balb/C雌鼠,實驗組尾靜脈注射100 μL SARS-CoV-2的VLPs,靜置15 min;對照組選用同一批5-6周的Balb/C雌鼠,尾靜脈注射100 μL SM溶液,靜置15 min。取心、肝、脾、肺、腎及肌肉組織(大腿)各50 mg,RNA核酸由Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取,最終應(yīng)用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA,放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。SARS-CoV-2的cDNA作為陽性對照,而Rnase-free water作為陰性對照。

    1.2.10 熒光RPA應(yīng)用于臨床樣本中檢測SARSCoV-2 上海市臨床檢驗質(zhì)量控制中心提供的樣本為滅活的臨床樣本,600 μL/支。提取RNA時,取100 μL樣品,用Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取,最終應(yīng)用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA,放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。SARSCoV-2的cDNA作為陽性對照,而Rnase-free water作為陰性對照。

    本研究涉及所有熒光RPA檢測,包括靈敏度、特異性分析以及樣品檢測,每組試驗均獨立重復(fù)3次,結(jié)果一致的,展示其中一次結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 RPA引物探針靈敏度

    首先,以倍比稀釋的SARS-CoV-2病毒VLPs以及2019-nCoV S質(zhì)粒作為模板,應(yīng)用單重?zé)晒釸PA檢驗比較NF/NR/NP以及SF/SR/SP 兩組引物探針組合的敏感性,結(jié)果顯示SF/SR/SP組合的分析敏感性優(yōu)于NF/NR/NP。SARS-CoV-2雙重?zé)晒釸PA方法選擇NF/NR/NP及SF/SR/SP組合。

    雙重?zé)晒釸PA反應(yīng)體系下,以S基因為靶標基因的SF/SR/SP引物探針組合分析敏感度可達10 copies/reaction(圖1),與WHO推薦的實時熒光PCR檢測方法基本一致;以N基因為靶標基因的NF/NR/NP引物探針組合分析敏感度(檢測限值)可達102copies/reaction(圖2)。

    圖1 雙重?zé)晒釸T-RPA針對S基因的分析靈敏度檢測

    2.2 RPA引物探針特異性

    以influenza A/H1N1、PEDV、TGEV、PRRV、FMDV、RV等病毒的核酸RNA以及SARS-CoV-2的cDNA為模板,進行雙重?zé)晒釸T-RPA檢測,結(jié)果只有SARS-CoV-2的cDNA模板出現(xiàn)擴增條帶(圖3),說明該方法具有良好的特異性。

    圖2 雙重?zé)晒釸T-RPA針對N基因的分析靈敏度檢測

    圖3 雙重?zé)晒釸T-RPA分析特異性檢測

    2.3 熒光RPA應(yīng)用于食品中SARS-CoV-2的VLPs檢測

    將6種生或熟制食品與新冠病毒VLPs混合,與此同時,6種食品與SM溶液混合作為對照,提取RNA核酸,用做熒光RPA中的模板。結(jié)果(圖4)顯示:6種食品,包括生豬肉、生羊肉、熟牛肉、香腸、熟雞肉及速凍餃子,不影響應(yīng)用RPA熒光檢測技術(shù)從中檢測SARS-CoV-2的VLPs,添加了VLPs顆粒的樣品呈現(xiàn)陽性,無VLPs添加樣品食品均為陰性。

    2.4 熒光RPA應(yīng)用于動物組織中SARS-CoV-2的VLPs檢測

    取尾靜脈注射100 μL SARS-CoV-2的VLPs的Balb/C小鼠的相關(guān)組織,注射SM溶液的Balb/C小鼠作為空白對照,提取RNA核酸,用做熒光RPA中的核酸模板。結(jié)果(圖5)顯示:心、肝、蜱、肺、腎、肌肉等動物組織樣品不影響應(yīng)用RPA熒光檢測技術(shù)從中檢測SARS-CoV-2的VLPs,添加了VLPs顆粒的樣品呈現(xiàn)陽性,無VLPs添加樣品動物組織均為陰性。

    圖4 雙重?zé)晒釸T-RPA食品中檢測新冠病毒VLPs

    圖5 雙重?zé)晒釸T-RPA食品中檢測小鼠組織中VLPs

    2.5 熒光RPA應(yīng)用于臨床樣本檢測

    提取6支臨床樣本的RNA核酸,作為熒光RPA中的模板。結(jié)果顯示:臨床樣本2012/2014/2015/2016為陽性,2011/2013樣本為陰性(圖6-7)。經(jīng)上海市臨床檢驗質(zhì)量控制中心審核,臨床樣本檢測結(jié)果符合率100%,獲得上海市臨床檢驗中心組織頒發(fā)的證書。

    3 討論

    熒光RT-RPA作為實時熒光RT-PCR的替代技術(shù),其可在37-42℃下恒溫擴增目標核酸,免去了傳統(tǒng)PCR技術(shù)所需要的升降溫過程。以實時熒光PCR為例,其整個檢測過程約為80 min,包括20 min反轉(zhuǎn)錄以及60 min的PCR擴增及檢測過程,而熒光RT-RPA檢測過程總計為20 min,節(jié)約檢測時間1 h。此外,接近于室溫的恒溫擴增條件,也簡化了儀器設(shè)備中的升溫、降溫模塊,使得熒光RPA檢測儀器的小型化、手持化成為現(xiàn)實[9]。

    圖6 雙重?zé)晒釸T-RPA檢測臨床樣本(S基因)

    圖7 雙重?zé)晒釸T-RPA檢測臨床樣本(N基因)

    樣品前處理及RNA核酸提取是病毒核酸檢測的首要步驟。目前病毒核酸提取主要方法有離心柱法和磁珠法[10]。離心柱法采用特殊的硅基質(zhì)吸附材料吸附核酸,核酸純度高,操作標準化,但是也存在耗時長、提取步驟反復(fù)離心等缺點。磁珠法應(yīng)用復(fù)合磁性微球,其表面連接可特異性可逆吸附核酸的功能基團,利用磁場實現(xiàn)核酸的富集與分離純化,具有靈敏度高、自動化、高通量等優(yōu)勢,但整個提取過程耗時長,且成本較高。近期,一些病毒RNA核酸快速提取試劑上市,其基本原理減少核酸提取步驟,僅保留核酸裂解步驟[11]。通過去污劑以及95℃加熱等破壞病毒外殼釋放病毒核酸,同時加入RNA核酸穩(wěn)定劑防止核酸降解,全程僅需5 min,配合熒光RT-RPA檢測方法,可將整個SARS-CoV-2檢測時間縮短到30 min內(nèi),適用于COVID-19的食品、動物產(chǎn)品以及快速現(xiàn)場檢疫篩查及監(jiān)管執(zhí)法等特殊場景,具有明顯的優(yōu)勢。然而,RNA核酸快速提取技術(shù)還不完善,其缺點為敏感度不高、核酸提取效率低、僅適用于咽喉拭子等簡易樣本等缺點,新一代的高靈敏度快速核酸提取技術(shù)尚待進一步研發(fā)。

    目前,國家批準的新冠病毒的核酸檢測試劑基本是通過靶向特定區(qū)域,對病毒的ORF1ab、N基因、E基因、S基因等位點開展檢測,以雙靶標為主,單靶標和三靶標均比較少見[12]。本研究建立的雙重?zé)晒釸T-RPA檢測方法,以N基因和S基因作為雙靶標。N基因編碼的N蛋白是SARS-CoV-2的核衣殼蛋白,位于病毒內(nèi)部,在β屬冠狀病毒之間相對比較保守,此外N蛋白還是干擾素(Interferon,IFN)的拮抗劑和病毒編碼的RNA干擾抑制因子,常用作冠狀病毒檢測的靶點[13]。S基因編碼的S蛋白位于病毒外殼,通過識別宿主細胞受體介導(dǎo)病毒和細胞膜融合在病毒感染中發(fā)揮重要作用。S蛋白是宿主中和抗體的重要作用位點以及疫苗(尤其是多肽和mRNA疫苗)、治療性抗體、小分子和診斷開發(fā)的關(guān)鍵靶點[14]。目前,正在研發(fā)的核酸疫苗(mRNA疫苗和DNA疫苗)基本是以S基因為基礎(chǔ),導(dǎo)入宿主細胞后產(chǎn)生S蛋白抗原,刺激機體產(chǎn)生體液及細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。美國制藥公司Moderna研發(fā)的mRNA疫苗就是攜帶S基因,第一批疫苗(mRNA-1273)已經(jīng)開展了臨床試驗(NCT04283461)[14]。本研究建立的雙重?zé)晒釸PA檢測方法,可用于感染或免疫初期區(qū)分鑒定以S基因為基礎(chǔ)的核酸疫苗免疫還是SARS-CoV-2病毒野毒株感染。長期看,區(qū)分免疫還是感染應(yīng)以檢測以S蛋白或N蛋白為靶標的特異性抗體的免疫學(xué)方法為主。

    近期,國內(nèi)外報道SARS-CoV-2病毒可感染犬、貓等寵物,另有研究證實SARS-CoV-2可在雪貂和貓的呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)高效復(fù)制,存在空氣傳播COVID-19的可能[15]。目前,作為人畜共患病病原,SARS-CoV-2病毒感染動物并通過食品鏈傳入餐桌的可能性不能完全排除。因此,在食品、動物組織中開展SARS-CoV-2病毒的檢測監(jiān)測工作可以進一步阻斷COVID-19通過動物源性食品傳播的可能。然而,食品、動物組織樣品基質(zhì)復(fù)雜,含有大量的油脂、蛋白甚至植物纖維,對核酸提取、檢測方法的影響未可知。本研究采用假病毒顆粒替代SARS-CoV-2,可提供從病毒核酸提取到檢測的全流程質(zhì)控,證實了本研究建立的雙重?zé)晒釸T-RPA檢測方法可用于食品、動物組織以及臨床樣本中SARS-CoV-2檢測,應(yīng)用場景豐富,檢測效果良好。

    4 結(jié)論

    本研究建立的SARS-CoV-2病毒熒光RPA檢測方法,操作簡便,檢測速度快(20 min),靈敏度高、特異性好、雙靶標,經(jīng)試驗此方法適用于在食品、動物組織器官以及臨床樣本中檢測SARS-CoV-2病毒。

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