基于代謝組學(xué)的轉(zhuǎn)基因水稻生物安全評(píng)價(jià)方法研究

蘭青闊 趙新 沈曉玲 魏靜娜 劉雙 陳銳 檀建新 王永

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300381；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定 071001）

截止到2018年，全球共有26個(gè)國(guó)家種植了1.917億公頃轉(zhuǎn)基因作物［1］。伴隨轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和人們生活水平的提高，轉(zhuǎn)基因作物及其衍生食品的安全問題受到社會(huì)強(qiáng)烈關(guān)注和爭(zhēng)議［2-3］。世界各個(gè)國(guó)家、組織和地區(qū)，都對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)和應(yīng)用規(guī)定了明確的政策和法規(guī)［2，4］，對(duì)其開展嚴(yán)格的生物安全評(píng)價(jià)。

轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)是基于對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和同類非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的詳細(xì)比較分析。1993年，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）提出“實(shí)質(zhì)等同性原則”作為轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)的基本原則［5］。在比較分析中，對(duì)象的選擇是整個(gè)安全評(píng)價(jià)過程中的關(guān)鍵。最初采用的評(píng)估方法是靶標(biāo)性地檢測(cè)某一種或一類成分的差異；對(duì)象通常包括主要成分、次要成分、有毒物質(zhì)、必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗?fàn)I養(yǎng)因子（胰蛋自酶抑制劑）等［6-7］。近些年，多位研究人員提出當(dāng)前的靶標(biāo)分析方法過于具體，容易漏檢非預(yù)期效應(yīng)［8-10］，應(yīng)該補(bǔ)充采用更加全面無偏向性的、非靶標(biāo)輪廓分析的組學(xué)分析技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)［11］、蛋白質(zhì)組學(xué)［12］和代謝組學(xué)技術(shù)［10-11］。這些組學(xué)技術(shù)能夠更好的挖掘轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因受體之間差異的范圍和來源，發(fā)現(xiàn)非預(yù)期效應(yīng)［13］。

代謝組學(xué)（Metabonomics或Metabolomics）屬于全局系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，其分析靶標(biāo)是細(xì)胞中相對(duì)分子質(zhì)量在1 000 Da以內(nèi)的小分子代謝物［14-15］。本研究以轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻及其非轉(zhuǎn)基因受體為研究對(duì)象，采用基于UPLC-Q/TOF MS分析的轉(zhuǎn)基因作物代謝組評(píng)價(jià)技術(shù)流程，對(duì)代謝組提取方法、數(shù)據(jù)處理方法、數(shù)據(jù)分析軟件等技術(shù)進(jìn)行了探索。本研究豐富了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)的內(nèi)容和方法，為轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)與管理提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻及其非轉(zhuǎn)基因受體水稻種子由本試驗(yàn)室保存。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻含有P-Ubi、Cry1Ab、T-35S、T-nos等4個(gè)外源元件，單拷貝形式插入在水稻染色體中。

1.2 方法

1.2.1 水稻萌發(fā)與培養(yǎng) 將種子均勻鋪在培養(yǎng)皿中，放入光照培養(yǎng)箱（GXZ-450A，寧波江南，條件為16 h光培養(yǎng)，光強(qiáng)80 mE·s-1·m-1，溫度28℃；8 h暗培養(yǎng)，溫度為22℃）；7 d后移至營(yíng)養(yǎng)土中（16 h光培養(yǎng)，光強(qiáng)80 mE·s-1·m-1，溫度32℃；8 h暗培養(yǎng)，溫度為28℃）。轉(zhuǎn)基因及其受體樣本的生長(zhǎng)環(huán)境包括營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)、溫度、濕度和光照時(shí)間等均相同。

1.2.2 代謝組提取方法 取適量水稻葉片組織于2 mL預(yù)先放入鋼珠的離心管中，液氮中處理1 min，用冷凍研磨儀（MM400，德國(guó)萊馳）研磨成粉末；稱取100 mg粉碎樣品于新的2 mL的離心管中，加入提取溶劑（不同濃度的甲醇水溶液）1 mL，渦旋混勻，置于高速冷凍離心機(jī)（CR22GIII，日本日立）中，4℃ 下16 000 ×g離心15 min；上清液即為樣品提取液。轉(zhuǎn)基因及其受體各7株平行。

1.2.3 代謝組分析 本研究應(yīng)用的液質(zhì)平臺(tái)為ACQUITY UPLC H -CLASS串聯(lián)Xevo G2-XS Q/TOF質(zhì)譜。

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱為 BEH C18（1.7 μm，2.1×50 mm）；流動(dòng)相采用乙腈-水-甲酸系統(tǒng)，其中（A）0.1%（V/V）甲酸超純水，（B）乙腈，優(yōu)化以后的梯度洗脫程序見表1；柱溫40℃，流速為0.40 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；進(jìn)樣后洗針6 s；單個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間18 min；樣品室溫度為4℃。

表1 UPLC流動(dòng)相洗脫梯度

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 采用正、負(fù)兩種模式測(cè)定。

正離子模式：毛細(xì)管電壓（Capillary Voltage）1.5 kV；錐孔電壓（Sampling Cone Voltage）40 V；Source offient 80；離子源溫度（Source Temperature）120℃；脫溶劑氣溫度（Desolvation Temperature）400℃；掃描時(shí)間（Scan time）0.2 s；進(jìn)樣錐孔氣體流量（Cone Gas Flow）50L/h；脫溶劑氣流速（Desolvation Gas Flow）800 L/h；質(zhì)量數(shù)檢測(cè)范圍（Mass range）100-1 200 Da；實(shí)時(shí)質(zhì)量校正（Lockmass）標(biāo)準(zhǔn)品為亮氨酸腦啡肽醋酸鹽（LE，［M+H］+=556.277 1，［M-H］-= 554.261 5）。

負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓（Capillary Voltage）1 kV；錐孔電壓（Sampling Cone Voltage）40 V；Source offient 80；離子源溫度（Source Temperature）120℃；脫溶劑氣溫度（Desolvation Temperature）450℃；掃描時(shí)間（Scan time）0.2 s；進(jìn)樣錐孔氣體流量（Cone Gas Flow）50 L/h；脫溶劑氣流速（Desolvation Gas Flow）800 L/h；質(zhì)量數(shù)檢測(cè)范圍（Mass range）50-1 200 Da；實(shí)時(shí)質(zhì)量校正（Lockmass）標(biāo)準(zhǔn)品為亮氨酸腦啡肽醋酸鹽（LE，［M+H］+=556.277 1，［M-H］-= 554.261 5）。

1.2.3.3 代謝組學(xué)方法學(xué)考察 同一份樣品分別在放置0 h、5 h、10 h、20 h、30 h、40 h之后進(jìn)行檢測(cè)，比較保留時(shí)間和峰面積的RSD，考察提取方法的穩(wěn)定性；同一份樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，比較色譜峰保留時(shí)間的一致性，考察方法的精密度；相同條件下提取7株轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的葉片并進(jìn)行代謝組檢測(cè)，比較色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的一致性；考察方法的重復(fù)性。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 首先使用MarkerLynx4.1軟件（Waters公司）對(duì)色譜圖進(jìn)行初步分析處理，提取化合物的質(zhì)量數(shù)、相對(duì)保留時(shí)間、峰強(qiáng)度和峰面積，導(dǎo)出數(shù)據(jù)；應(yīng)用軟件Progenesis QI（Waters）和基于R語言的開源軟件MAIT［16］（Metabolite Automatic Identification Toolkit）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和代謝組差異化分組分析。

Progenesis QI軟件的主要參數(shù)：加和離子選擇M+H，M+NH4，M+Na，M+K；抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻樣本為一組，非轉(zhuǎn)基因受體樣本為一組；分析時(shí)間為0-18 min；質(zhì)量數(shù)范圍為50-1 000 Da；軟件分析后，得到Score圖和Loading圖，選擇Loading圖中偏離遠(yuǎn)點(diǎn)的點(diǎn)進(jìn)行Transfer Loadings data，其中Anova P-value≤0.05，Max fold change≥2的化合物為差異代謝物［17-18］。

2 結(jié)果

2.1 水稻葉片代謝組提取方法優(yōu)化

以水稻苗期葉片為試驗(yàn)對(duì)象，比較不同濃度的提取溶劑（100%甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇）對(duì)水稻代謝物提取的效果。結(jié)果（圖1）顯示，隨著甲醇濃度的增加，BPI譜圖中峰個(gè)數(shù)增多；在甲醇濃度為80%和100%時(shí)，峰個(gè)數(shù)基本保持一致，BPI譜圖中峰的數(shù)目較多，可覆蓋更多代謝物，提取效果較好?？紤]到溶劑效應(yīng)，流動(dòng)相中含有一定比例的水更好，因此選擇80%甲醇濃度開展后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同濃度提取溶劑下BPI圖

2.2 代謝組分析方法考察

對(duì)優(yōu)化的代謝組分析方法的穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性進(jìn)行了考察。同一份樣品提取液分別放置0 h、5 h、10 h、20 h、30 h、40 h之后，進(jìn)行UPLCQTOF分析，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜5%，主要共有峰面積的RSD≤7%，說明樣品提取溶液至少在40 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定；精密度考察中，同一份樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，其色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜2%，表明方法精密度良好；重復(fù)性考察中，同一類型樣品、不同次數(shù)提取，其色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3 數(shù)據(jù)分析方法優(yōu)化

將苗期樣本按陽性（轉(zhuǎn)基因）和陰性（非轉(zhuǎn)基因）分成兩組，經(jīng)UPLC-Q/TOF-MS上機(jī)后得到代謝組數(shù)據(jù)。將得到的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，正、負(fù)兩種離子采集模式下得到Score圖（圖2）。在正離子模式下，陽性和陰性組間距離較近，同組樣品距離較遠(yuǎn)，且分布比較離散，兩組樣品沒有完全區(qū)分，分組效果不明顯，說明樣本之間存在微量差異，但分析獲得的差異不大。負(fù)離子模式下，陽性和陰性兩組樣品之間相互交錯(cuò)，組間比較離散，沒有達(dá)到分組效果。因此，由PCA分析得到的結(jié)論是兩組樣本差異不太明顯，沒有完全區(qū)分開來。

圖2 轉(zhuǎn)基因水稻及其受體苗期葉片的PCA分析圖

采用OPLS-DA分析模式對(duì)苗期的兩組樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到Score圖（圖3）。在正離子模式下，陽性和陰性兩組樣品之間沒有出現(xiàn)交叉和重疊，且同組之間距離較近，組內(nèi)樣品個(gè)體之間離散程度較小，達(dá)到很好的分組效果；在負(fù)離子采集模式下，兩組樣本雖然能夠區(qū)分開來，但是組間樣本離散程度較大，效果沒有陽離子模式好。說明OPLS-DA分析模式在兩組樣品間的區(qū)別能力比PCA分析模式較好，且在正離子采集模式下分組效果更好。

圖3 轉(zhuǎn)基因水稻及其受體苗期葉片的OPLS-DA分析圖

2.4 代謝組差異分析

應(yīng)用Progenesis QI軟件進(jìn)行分析，正離子模式下共檢測(cè)到6 459個(gè)化合物，負(fù)離子模式下共檢測(cè)到6 783個(gè)化合物。選擇VIP圖中≥1的點(diǎn)，根據(jù)P≤0.05、Max fold change≥2條件進(jìn)行篩選，共篩選出49個(gè)差異性位點(diǎn)。導(dǎo)出所有代謝物Normal Abundance Profile圖（圖4），發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，差異較明顯的是14.99 _782.5849 m/z代謝物，在同組樣本中分布不太均勻，總體上在陽性組的含量比陰性組較高；在負(fù)離子模式下，差異較明顯的是4.73_7491.1927 m/z代謝物。

應(yīng)用基于R語言的軟件包MAIT對(duì)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。該軟件的分析步驟包括peak detection、peak annotation、statistical analysis，具 備PCA、OPLS-DA、SVM、KNN等預(yù)測(cè)、統(tǒng)計(jì)分析功能。對(duì)苗期樣本進(jìn)行、代謝組差異篩選、差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分組（圖5）和歐式距離分組（圖6）分析。結(jié)果表明，隨著P值減小，陽性和陰性分組越明顯，也越能獲得差異較大、數(shù)據(jù)更穩(wěn)定的代謝物。

圖4 49個(gè)差異代謝物在兩組樣本中的分布情況

圖5 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻苗期葉片代謝物相關(guān)性分析

圖6 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻苗期葉片代謝物歐氏距離分析

通過相關(guān)性分組（圖5）和歐式距離分組（圖6），均獲得差異代謝物為21 597、21 401、3 221、11 767、9 152、23 412。其含量詳細(xì)信息見圖7。

圖7 差異代謝物在兩組樣本中的分布情況

3 討論

3.1 基于代謝組學(xué)的轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)是轉(zhuǎn)基因生物安全管理的重要支撐，包括分子特征分析、環(huán)境安全評(píng)價(jià)和食用安全評(píng)價(jià)。基于非靶向性的代謝組學(xué)分析，是對(duì)現(xiàn)有安全評(píng)價(jià)方法體系的完善和補(bǔ)充。在開展轉(zhuǎn)基因食用安全評(píng)價(jià)和環(huán)境安全評(píng)價(jià)的同時(shí)，開展代謝組生物安全評(píng)價(jià)，是一個(gè)較為合理的解決方案。食用安全和環(huán)境安全實(shí)驗(yàn)中，環(huán)境和條件均控制在相對(duì)精準(zhǔn)的條件下，技術(shù)方案設(shè)置了不同的處理水平（飼喂、接蟲、干旱等）和對(duì)照材料，可以在對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行常規(guī)靶向性分析的同時(shí)，開展非靶向性的代謝組分析。Mesnage等［19］結(jié)合大鼠喂養(yǎng)試驗(yàn)，以大鼠的肝臟和腎臟為檢測(cè)對(duì)象，開展轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，以觀測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米可能的生理毒性。Peng等［18］以轉(zhuǎn)cry和epsps基因水稻灌漿期（開花后14 d和35 d）籽粒為檢測(cè)對(duì)象，為了解轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因受體在種子發(fā)育階段的代謝變化提供信息。

3.2 代謝組學(xué)分析平臺(tái)

本研究的目標(biāo)為建立一套完整的轉(zhuǎn)基因水稻代謝組生物安全評(píng)價(jià)技術(shù)流程，包括外界脅迫處理、取樣節(jié)點(diǎn)和組織、樣品前處理、樣品代謝組分析、數(shù)據(jù)處理、代謝途徑和非預(yù)期效應(yīng)分析等步驟。在代謝組分析過程中，常用的代謝組學(xué)分析技術(shù)有核磁共振（NMR）［20］、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）［21-22］、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）［23］、傅里葉變換紅外光譜與質(zhì)譜聯(lián)用（FT-ICR MS）［24］、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用（CEMS）［25］等。近幾年出現(xiàn)的超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)大大提高了分離速度，其與四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q/TOF）聯(lián)用組成超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF/MS），已廣泛應(yīng)用于作物代謝組學(xué)研究［18，26］。Wang等［11］以從我國(guó)不同省份收集的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米12-5×IE034、12-5、IE034和常規(guī)品種為研究對(duì)象，應(yīng)用UPLC-MS平臺(tái)對(duì)代謝組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與親本12-5和IE034相比，雜交品種12-5×IE034分別有15和112個(gè)不同的代謝物，其差異小于其他玉米品種之間的差異；Peng等［18］應(yīng)用UHPLC-QTOF-MS分析平臺(tái)，在籽粒灌漿期和成熟期分別鑒定出161和138個(gè)差異代謝物。

4 結(jié)論

本研究以轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻及其非轉(zhuǎn)基因受體為研究對(duì)象，建立了包括樣品培養(yǎng)、代謝物提取、UPLC-QTOF/MS分析、數(shù)據(jù)處理等步驟的轉(zhuǎn)基因作物代謝組評(píng)價(jià)技術(shù)流程，并對(duì)代謝組提取方法、數(shù)據(jù)處理方法、數(shù)據(jù)分析平臺(tái)等進(jìn)行了優(yōu)化評(píng)估。結(jié)果表明，應(yīng)用80%甲醇水能有效提取水稻苗期葉片中的代謝物；經(jīng)UPLC分離、QTOF/MS分析、正交校正的偏最小二乘辨別分（OPLS-DA）等計(jì)算方法，能夠有效發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻及其受體之間的差異代謝物。