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    適合流式細(xì)胞儀分析的大豆細(xì)胞核解離液的篩選與應(yīng)用

    2020-12-04 08:07:16陳林潘貞志戴毅宋麗
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:懸浮液細(xì)胞核緩沖液

    陳林 潘貞志 戴毅 宋麗

    (1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

    流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)處于液流中的單個(gè)細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速分析定量及分選的方法。隨著熒光分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,流式細(xì)胞檢測廣泛的應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域:如通過流式細(xì)胞術(shù)來分析細(xì)胞的各種代謝特征,判斷細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死[1-2],評(píng)估細(xì)胞的分化和增殖特性[3],以及DNA含量分析、細(xì)胞群比例的測定和分選[4]。流式細(xì)胞檢測在植物學(xué)研究中的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面:(1)植物細(xì)胞核分析,如:測定DNA的含量[5]、進(jìn)行植物遺傳倍性分析[6]、細(xì)胞周期分析、測定基因組大?。?-8];(2)染色體分析及分選和構(gòu)建染色體文庫[9-10];(3)原生質(zhì)體和細(xì)胞融合產(chǎn)物分析及分選[11];(4)應(yīng)用在系統(tǒng)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)上[12]。

    然而,與動(dòng)物細(xì)胞或醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不同,植物細(xì)胞具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁,細(xì)胞成分如多酚等大量富集,難以分離得到用于流式檢測的單細(xì)胞懸液。因此,為了對(duì)植物材料中核DNA進(jìn)行定性及定量分析,目前主要采取兩種策略[13]:一種策略是酶解去除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁從而收獲原生質(zhì)體,原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水破裂進(jìn)一步分離細(xì)胞核;另一策略是在合適的緩沖液中,通過物理機(jī)械切割植物材料使植物細(xì)胞破裂,從而使細(xì)胞核釋放到緩沖液中。Galbraith等[14]最早提出建立機(jī)械切割的方法并通過Galbraith’s核解離液成功測定了數(shù)種植物的DNA含量和細(xì)胞周期。Lee 等[15]改良MgSO4緩沖液成分并使核提取液通過一個(gè)棉柱,去除多酚類和細(xì)胞碎片,可從蘭花中可分離出完整的細(xì)胞核用于流式檢測;Loureiro等[16]采用GPB和WPB緩沖液制備了37種不同葉組織結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的草本和木本植物標(biāo)本,采用流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞核DNA含量;李思璐[17]通過流式細(xì)胞檢測MgSO4緩沖液制備的核懸浮液,研究不同逆境脅迫下玉米不同組織器官在各個(gè)發(fā)育時(shí)期內(nèi)核復(fù)制的發(fā)生規(guī)律;張琳琳等[18]分別在Otto和LB01緩沖液中解離出細(xì)胞核并利用流式細(xì)胞術(shù)首次測定藥用植物黃芩的基因組大??;劉鳳霞等[19]從5種緩沖液中篩選出適合通過機(jī)械切割制備完整的梨葉片的細(xì)胞核懸浮液的核解離液。

    大豆是我國重要的糧油作物,然而近年來干旱或洪澇災(zāi)害發(fā)生頻繁,嚴(yán)重影響了其生產(chǎn)發(fā)展。大豆根系發(fā)育愈好,受水分脅迫危害的程度就愈小,抗逆性越強(qiáng)。因此,深入挖掘逆境下大豆根系發(fā)育的調(diào)控機(jī)理,對(duì)減輕干旱或澇漬威脅、保障大豆安全生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[20]。植物根系的生長發(fā)育離不開細(xì)胞的分裂和分化,無論是根原基的起始與分裂,還是分生組織的形成和活化,都涉及到細(xì)胞周期中的細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長兩個(gè)交替循環(huán)的過程[21-22]。此外,植物中一些細(xì)胞由于發(fā)育和/或環(huán)境因素的影響會(huì)在S期后跳過G2和M期直接回到G1期,再次起始DNA復(fù)制,如此循環(huán)導(dǎo)致形成多倍體的細(xì)胞[23-24]。因此研究細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)理不僅可以闡明植物生長發(fā)育的分子機(jī)制,也有利于闡明脅迫對(duì)作物生長影響的機(jī)制。

    本研究在參考流式細(xì)胞術(shù)在其它植物物種檢測DNA含量的研究基礎(chǔ)上,尋找適合不同大豆品種的葉片及根組織的細(xì)胞核解離液及完善植物流式細(xì)胞分析方法及細(xì)胞核的制備方法,并利用該技術(shù)對(duì)PEG模擬的干旱脅迫下大豆根尖中細(xì)胞周期的調(diào)控進(jìn)行了分析,為今后使用流式細(xì)胞儀對(duì)測定大豆DNA的含量、細(xì)胞比例和遺傳倍性、細(xì)胞周期的調(diào)控研究提供了技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料為大豆品種包括William 82、Holladay、PI 567611、PI 567651、Fiskeby III,由揚(yáng)州大學(xué)大豆遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 植物細(xì)胞核解離液配制 本實(shí)驗(yàn)所用6種核解離液配方見表1。

    1.2.2 PEG 6000模擬干旱處理 大豆種子經(jīng)吸水膨脹后種植在土壤中,萌發(fā)生長6 d,選擇生長狀態(tài)一致的豆苗,避免損傷大豆根系的前提下洗凈塵土,根系分別浸沒在濃度分別為0%和20% PEG 6000溶液中脅迫7 d后,將根系殘余的PEG 6000洗滌干凈,取2 cm左右的幼嫩根尖用于細(xì)胞核懸浮液制備。

    1.2.3 細(xì)胞核懸浮液制備 取新鮮幼嫩的大豆葉片或根組織,蒸餾水洗凈表面塵土并用濾紙吸干殘余水分。培養(yǎng)皿置冰上預(yù)冷,加入5 mL預(yù)冷細(xì)胞核解離液,將植物材料浸沒在解離液中,用鋒利的刀片一次性快速切割植物材料。輕微的吹吸核解離液,但避免產(chǎn)生氣泡,以減少釋放的細(xì)胞核粘連在植物組織上,細(xì)胞核解離液經(jīng)400目細(xì)胞濾器過濾,濾液放置于4℃或者冰上孵育5 min。濾液于4℃、1 000 r/min離心1 min,小心移去上清,沉淀經(jīng)適量體積的新鮮的細(xì)胞核解離液重懸,經(jīng)終濃度為4 μg/mL的DAPI染色10 min至60 min。

    表1 核解離緩沖液配方

    1.2.4 流式細(xì)胞儀分析 取制備好的細(xì)胞核懸浮液500 μL,用FACS LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀(BD公司,美國)在低流速條件下檢測,至少吸取10 000 個(gè)經(jīng)DAPI染色的顆粒。用Modfit 5.0軟件分析結(jié)果,分別畫出吸收的顆粒數(shù)(count)和熒光強(qiáng)度(Fluorescence intensity,F(xiàn)L)關(guān)系圖,所有樣品運(yùn)行參數(shù)設(shè)置一致,測定參數(shù)主要有相對(duì)熒光強(qiáng)度、變異系數(shù)(Coefficient variation,CV)、碎片背景(Debris background factor,DF)。

    2 結(jié)果

    2.1 不同核解離液對(duì)細(xì)胞核解離的影響

    本研究共采用6種不同核解離液分離大豆葉片細(xì)胞的細(xì)胞核。經(jīng)流式檢測分析發(fā)現(xiàn),根據(jù)散射光檢測信號(hào),Galbraith’s核解離液(圖1-A)、LB01核解離液(圖1-B)、和mG核解離液(圖1-C)可獲得清晰的2團(tuán)細(xì)胞器顆粒信號(hào)聚集區(qū)域,而Tris·MgCl2核解離液(圖1-D)、GPB核解離液(圖1-E)和WPB(圖1-F)核解離液中僅有一團(tuán)細(xì)胞顆粒信號(hào)富集區(qū)域。通過對(duì)比大豆根中細(xì)胞核散射光信號(hào),確認(rèn)黑色框選中區(qū)域的信號(hào)對(duì)應(yīng)為細(xì)胞核的散射光信號(hào),推測在黑色框以外區(qū)域的信號(hào)富集可能為葉綠體細(xì)胞器。

    2.2 不同解離液對(duì)DNA相對(duì)含量的影響

    為了進(jìn)一步確定適合大豆幼嫩葉片細(xì)胞核提取的核解離液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Modfit5.0軟件,以熒光面積信號(hào)為橫軸,以細(xì)胞核顆粒數(shù)為縱軸,根據(jù)所選定的信號(hào)區(qū)域顯示統(tǒng)計(jì)結(jié)果。通過DNA相對(duì)含量直方圖(圖2)可以得出:在Galbraith’s核解離液(圖2-A)、mG核解離液(圖2-B)和LB01核解離液(圖2-C)提取的細(xì)胞核懸浮液在G0/G1期均形成了呈正態(tài)分布的DNA峰,并且其變異系數(shù)CV均小于5%,分別是2.78%、4.24%和2.96%。但是Galbraith’s核解離液和mG核解離液中多倍體檢測到的量較少,在G2/M期未形成較明顯的峰,這有可能對(duì)DNA倍性和細(xì)胞周期以及有絲分裂各時(shí)期細(xì)胞數(shù)量的分析造成一定的誤差。LB01核解離液可檢測到顯著的G2/M期峰,雖然LB01解離液所形成的碎片較Galbraith's核解離液和mG核解離液多,但是在檢測細(xì)胞周期及遺傳倍性中相對(duì)更好。相反,GPB核解離液(圖2-E)和WPB核解離液(圖2-F)中DNA峰較差,碎片很多,其變異系數(shù)較大。Tris·MgCl2核解離液(圖2-D)可以形成呈正態(tài)分布的DNA峰,但DNA峰與另外由5種核解離液所得的DNA峰在熒光強(qiáng)度上,明顯相對(duì)減小且偏移較大,表明Tris·MgCl2核解離液可能對(duì)核內(nèi)染色質(zhì)的分布造成了影響。

    進(jìn)一步利用Galbraith’s核解離液(圖3-A)和LB01 核解離液(圖3-B)對(duì)大豆根中的細(xì)胞核進(jìn)行了解離,研究結(jié)果表明兩種核解離液均在G0/G1期和G2/M 期均形成了呈正態(tài)分布的DNA峰。綜上所述,Galbraith’s和 LB01 核解離液適用于大豆葉和根中細(xì)胞核的解離。

    圖1 不同核解離液處理獲得的大豆嫩葉組織細(xì)胞核散射光特征

    2.3 不同核解離液對(duì)細(xì)胞核提取效率的比較

    用Galbraith’s和LB01兩種不同核解離液提取的懸浮液細(xì)胞核形態(tài)觀察結(jié)果見圖3。結(jié)果表明這兩種核解離液不但可獲得較多的單個(gè)細(xì)胞核,而且細(xì)胞核呈飽滿的圓形或者橢圓形懸浮在核解離液中,較好辨認(rèn)。因此這兩種核解離液能較好保證完整的細(xì)胞核從細(xì)胞中釋放出來,同時(shí)可以減少細(xì)胞中的次生代謝物的游離,盡管也有少量的幾個(gè)單顆粒細(xì)胞核黏在一起或者與其他雜質(zhì)黏在一起的情況發(fā)生。

    對(duì)比6種核解離液產(chǎn)生的細(xì)胞碎片發(fā)現(xiàn),WPB和GPB核解離液中碎片較多,其中GPB核解離液不能分離出完整的細(xì)胞核,且細(xì)胞核的形態(tài)不完整,導(dǎo)致熒光信號(hào)不能聚集。因此這兩種核解離液不適合分離大豆細(xì)胞核。其中Tris·MgCl2核解離液中葉綠體的污染較少,但是細(xì)胞碎片較多。WPB、GPB以及Tris·MgCl2核解離液流速較慢,單位時(shí)間內(nèi)顆粒數(shù)較少,也表明這3種核解離液不能高效的分離細(xì)胞核。

    2.4 LB01核解離液在不同大豆品種上的適用性及應(yīng)用性

    為驗(yàn)證LB01解離液是否具有廣適性,首先分別取大豆不同品種Holladay、PI 567611、PI 567651、FiskebyIII新鮮幼嫩的根尖,在LB01核解離液中機(jī)械切割釋放出細(xì)胞核,通過流式細(xì)胞儀檢測其DNA含量并分析遺傳倍性,結(jié)果如圖4所示。細(xì)胞核懸浮液在G0/G1期和G2/M期均形成了呈正態(tài)分布的DNA峰,并且其變異系數(shù)CV均小于5%。因此,LB01核解離液在其他大豆品種上亦具有良好的適用性。盡管不同大豆品種的細(xì)胞核的散射光特征上存在微小差異,可能是由于細(xì)胞核在顆粒大小及復(fù)雜程度上存在細(xì)微差異。

    為進(jìn)一步分析LB01解離液和流式細(xì)胞儀在大豆細(xì)胞周期檢測上的應(yīng)用,我們同時(shí)檢測了PEG6000模擬干旱處理對(duì)不同大豆品種根尖的細(xì)胞周期的調(diào)控。結(jié)果(圖4)表明20% PEG6000處理使G2/M細(xì)胞比例相對(duì)增多,顯著促進(jìn)核內(nèi)復(fù)制。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)不同品種大豆對(duì)相同濃度PEG脅迫響應(yīng)程度不同,例如PI 567651根尖的G2/M期細(xì)胞比例未處理為16.17%,處理后為63.22%,說明細(xì)胞周期被顯著阻滯(圖4-E-F);但是PI 567611中根尖的G2/M期細(xì)胞比例未處理為24.36%,處理后的29.24%,雖然細(xì)胞周期被抑制,但是其響應(yīng)PEG脅迫程度較其它品種低(圖4-C-D)。該研究結(jié)果不僅表明利用LB01核解離液和流式細(xì)胞術(shù)可成功檢測大豆根尖的細(xì)胞周期,而且表明干旱脅迫參與調(diào)控大豆根尖的細(xì)胞周期進(jìn)程,及不同大豆品種響應(yīng)程度有差異。

    圖2 不同核解離液獲得的大豆嫩葉組織細(xì)胞核DNA相對(duì)含量

    圖3 不同核解離液獲得的大豆根細(xì)胞核DNA相對(duì)含量及形態(tài)學(xué)觀察

    3 討論

    田新民等[25]建議選取適合實(shí)驗(yàn)材料的解離液時(shí)可參照成功測定同屬或同科的物種的解離液,因此本研究為將來研究豆科植物利用流式細(xì)胞儀技術(shù)上提供參考。此外,由于流式細(xì)胞檢測需要在短時(shí)間內(nèi)分析大量的細(xì)胞核懸液,因此對(duì)提取的細(xì)胞核懸液的純度和濃度要求較高,濃度為1×105-1×107個(gè)/mL的高純度完整的單顆粒細(xì)胞核較為適宜[26]。本實(shí)驗(yàn)中由于葉綠體DNA可與染料DAPI結(jié)合,在分選時(shí)出現(xiàn)熒光值而干擾細(xì)胞核信號(hào),而根組織中沒有葉綠體,由其制備的細(xì)胞核懸液的純度和濃度更高。因此,葉片組織和根組織相比,根組織是更適合流式細(xì)胞儀分選的材料。

    核解離液中添加非離子型表面活性劑(如Tween-20或Triton X-100)可以促進(jìn)細(xì)胞核的釋放及防止黏性物質(zhì)粘住細(xì)胞核。本研究中所有的核解離液均添加了一定濃度的Triton X-100,但是提取細(xì)胞核的效果有差異。在所有的細(xì)胞核解離液,Galbraith’s解離液的解離效果最好,其Triton X-100濃度是0.1%,而WPB和GPB中,Triton X-100 濃度較高(0.5%-1%),核解離液中Triton X-100 的濃度可能是關(guān)鍵因素之一。此外,離心強(qiáng)度過大或時(shí)間過短,細(xì)胞核仍懸浮在核解離液中達(dá)不到富集的效果,在下一步棄多余核解離液而丟失;離心強(qiáng)度過大或時(shí)間過長,制備的細(xì)胞核懸浮液雜質(zhì)會(huì)明顯增加甚至干擾檢測。

    圖4 不同大豆品種在PEG模擬干旱脅迫前后細(xì)胞周期的分析

    核內(nèi)復(fù)制有助于維持植物在壓力條件下的生長以適應(yīng)不利的環(huán)境因素。在許多物種中,水分脅迫可以通過降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性來抑制有絲分裂周期,增加核內(nèi)復(fù)制周期。細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制水平的提高可促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張,從而減輕水分虧缺對(duì)細(xì)胞大小的影響,幫助植物減緩所受到的脅迫傷害[27-28]。本研究在篩選適合大豆組織的核解離液的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)大豆干旱脅迫下細(xì)胞周期的調(diào)控進(jìn)行了初步分析,本實(shí)驗(yàn)采用LB01核解離液提取的細(xì)胞核懸浮液的變異系數(shù)均小于5%,且碎片較少,主峰非常明顯,說明該核解離液不僅分離大豆根的細(xì)胞核效果較好,而且由此對(duì)應(yīng)的細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠,為進(jìn)一步研究逆境對(duì)大豆核內(nèi)復(fù)制水平的影響提供技術(shù)支持。本研究為使用流式細(xì)胞儀簡便、快速、準(zhǔn)確地研究大豆細(xì)胞核DNA的含量、細(xì)胞周期和遺傳倍性奠定了基礎(chǔ)

    4 結(jié)論

    本研究利用流式細(xì)胞儀分析對(duì)比了6種細(xì)胞核解離液的分離效果,找到了適合大豆葉片及根組織的細(xì)胞核解離液。其中Galbraith’s核解離液的核分離效果最好,LB01核解離液次之,但LB01核解離液可檢測到顯著的G2/M 期峰,在細(xì)胞周期及遺傳倍性中相對(duì)更好。進(jìn)一步通過比對(duì)不同大豆品種中PEG處理前后根尖細(xì)胞核細(xì)胞周期,表明LB01核解離液亦具有良好的適用性及應(yīng)用性。

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