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    蓋子區(qū)域氨基酸的定點(diǎn)突變對(duì)T1脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

    2020-12-04 08:07:06朱彩林呂祥夏小樂(lè)
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:鏈長(zhǎng)蓋子耐受性

    朱彩林 呂祥 夏小樂(lè)

    (工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué),無(wú)錫 214122)

    脂肪酶是工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的酶之一,是一種綠色催化劑,可催化水解反應(yīng)、酯化反應(yīng)或者酯交換反應(yīng),主要用于油脂加工、保健品、手性化合物、生物能源、造紙和皮革等領(lǐng)域[1-2]。脂肪酶具有一個(gè)典型的蓋子結(jié)構(gòu),覆蓋住酶的活性位點(diǎn),當(dāng)脂肪酶位于油水界面時(shí),蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變,蓋子結(jié)構(gòu)打開(kāi),酶的活性中心暴露,酶與底物結(jié)合發(fā)生催化作用,稱為界面激活現(xiàn)象[3-4]。由于脂肪酶應(yīng)用范圍廣,并且催化條件復(fù)雜多變,良好的穩(wěn)定性成為酶在實(shí)際應(yīng)用中必備的重要性質(zhì)[5],因此通過(guò)對(duì)蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造以增強(qiáng)脂肪酶性能的研究也很多。Shih等[6]將Geobacillus sp.NTU 03脂肪酶蓋子區(qū)域189號(hào)的Asp殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變,導(dǎo)致活性增強(qiáng),但熱穩(wěn)定性降低。Santarossa等[7]將來(lái)源于Pseudomonas fragi的脂肪酶PCL蓋子結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基Thr137和Thr138分別突變成Val和Asn,導(dǎo)致突變體對(duì)底物的鏈長(zhǎng)選擇性發(fā)生改變。Panizza等[8]對(duì)來(lái)源于 Pseudomonas sp.CR611 的 Lip I.3脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)改造后,使突變體對(duì)底物4-甲基傘形酮庚酯水解活力明顯增強(qiáng)。Karkhane 等[9]將來(lái)源于 Bacillus thermocatenulatus脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)中的苯丙氨酸突變成丙氨酸后,突變體水解活力增加2.6倍。林瑞鳳等[10]通過(guò)對(duì)擴(kuò)展青霉蓋子結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變,使突變體T81P和K94E的酶活力為野生型的3.95倍和3.97倍。

    T1脂肪酶是近年來(lái)研究比較火熱的脂肪酶之一,該酶是一種高溫嗜堿酶,來(lái)源于Geobacillus zalihae菌株,由于具有良好的耐熱性,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等各個(gè)領(lǐng)域。T1脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)由α6和α7螺旋組成,螺旋覆蓋酶活性位點(diǎn),α6螺旋在界面激活過(guò)程中會(huì)發(fā)生明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)重組現(xiàn)象,此時(shí)酶催化口袋打開(kāi),底物與酶結(jié)合并發(fā)揮催化作用[11]。由于T1脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用中經(jīng)常受各種極端條件的壓迫,如高溫、極端pH、有機(jī)溶劑等,通過(guò)理性改造獲得各種極端條件耐受性強(qiáng)的T1脂肪酶突變體顯得尤其重要,高穩(wěn)定性將能極大拓寬脂肪酶的可進(jìn)化性,提高酶的發(fā)展和應(yīng)用潛力[12]。

    近年來(lái),研究者們通過(guò)各種策略對(duì)T1脂肪酶進(jìn)行修飾改造,Ruslan等[13]通過(guò)在環(huán)間引入額外的離子對(duì)設(shè)計(jì)了T1脂肪酶突變體D311E,增加了T1脂肪酶的熱穩(wěn)定性,突變體比野生型T1脂肪酶表現(xiàn)出更高的Tm值。Wang等[14]利用分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬分析了不同溫度下T1脂肪酶蓋子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變,通過(guò)活性位點(diǎn)處水分子的分布推測(cè)出T1脂肪酶的催化機(jī)制,并適用于其他耐熱性脂肪酶。Tang等[15]研究了T1脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域的疏水氨基酸對(duì)底物選擇性和熱穩(wěn)定性的影響,使突變體A186S和A190S的催化效率(kcat/Km)提高了35%-50%,但熱穩(wěn)定性下降。Wahab等[16]將T1脂肪酶的Gln114突變成Trp,導(dǎo)致蛋白穩(wěn)定性顯著下降,催化活性降低。

    然而,之前對(duì)于脂肪酶包括T1脂肪酶在內(nèi)的改造重心主要集中在酶活和熱穩(wěn)定性兩方面,很難使酶其他方面的酶學(xué)性質(zhì),如pH、金屬離子、有機(jī)溶劑耐受性等盡可能同時(shí)得到改善,對(duì)這些酶學(xué)性質(zhì)的詳細(xì)研究比較少,由于T1脂肪酶作為生物催化劑在工業(yè)應(yīng)用中會(huì)受到各種條件的脅迫,因此酶整體的酶學(xué)性質(zhì)依舊有待改良??紤]到適當(dāng)?shù)膲毫?huì)使酶的α螺旋和β折疊不易壓縮,可提高酶在高溫下的熱穩(wěn)定性[17]。此外,目前已知20多種酶在壓力下會(huì)更穩(wěn)定且存在明顯的壓力激活現(xiàn)象[18]?;诖耍狙芯壳捌谕ㄟ^(guò)壓力擾動(dòng)耦合分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法對(duì)蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì),最終得到3個(gè)效果較好的單點(diǎn)突變體A190L、L188M和A190Y。有趣的是,將氨基酸殘基Ala190突變成疏水性強(qiáng)的Leu和疏水性較弱的Tyr后都產(chǎn)生使蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)的趨勢(shì),于是將L188M與Ala190處的兩個(gè)定點(diǎn)突變分別組合作深入探究,對(duì)突變體展開(kāi)最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、金屬離子耐受性以及底物選擇性等酶學(xué)性質(zhì)研究,同時(shí)將單點(diǎn)與復(fù)合突變效果進(jìn)行比較,試圖找到酶學(xué)性質(zhì)改善更為全面的T1脂肪酶突變體,以進(jìn)一步拓寬該酶的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要模擬與分析軟件 GROMACS 5.0.3、FoldX、I-mutant 2.0、STRUM、DynaMut。

    1.1.2 菌種及質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)用到的克隆宿主Escherichia coli(E.coli)JM109和質(zhì)粒pET28a均由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)購(gòu)自生工生物工程有限公司。

    1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)材料 蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉和卡那霉素,上海生工生物科技有限公司;咪唑、IPTG和酪氨酸,上海麥克林生化科技有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(EcoR I 和 BamH I),TaKaRa公司;棕櫚酸對(duì)硝基苯酯,碧云天生物術(shù)有限公司;膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒,AxyGen公司;Fast Mutagenesis Kit V2,諾唯贊生物科技有限公司;目的基因及引物由金唯智生物科技有限公司合成。引物如表1所示。

    表1 突變體引物

    1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 YP20002電子分析天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司;TGL-16M 離心機(jī),湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;Tanon 電泳儀,上海天能科技有限公司;EDG-81 PCR儀,東勝創(chuàng)新生物技術(shù)科技有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì),美國(guó)Thermo Scientific公司;DRB200 金屬浴,美國(guó)HACH公司。

    1.2 方法

    1.2.1 突變體的虛擬篩選 以野生型T1脂肪酶的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:2DSN)為初始模型,在不同壓力(1 Bar、100 Bar、500 Bar、1 000 Bar、2 000 Bar、4 000 Bar)及313 k條件下,通過(guò)GROMACS進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,計(jì)算蛋白質(zhì)的RMSD、Rg和RMSF,分析T1脂肪酶整體結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì),從而確定與T1脂肪酶功能密切相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域。對(duì)關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸進(jìn)行虛擬飽和突變,通過(guò)FoldX計(jì)算自由能變化小于0的突變體,構(gòu)建初始突變體庫(kù),運(yùn)用穩(wěn)定性預(yù)測(cè)軟件I-mutant 2.0、STRUM、DynaMut對(duì)初始突變體庫(kù)進(jìn)行再預(yù)測(cè),選擇3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為最終研究對(duì)象。

    1.2.2 T1脂肪酶突變體構(gòu)建 將目的基因和pET28a質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切,T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物于16℃金屬浴過(guò)夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞,涂布于LB(含50 μg/mL的Kan)平板,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行PCR及核酸瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,將顯示目的條帶的單菌落送樣進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,對(duì)于測(cè)序驗(yàn)證成功的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。設(shè)計(jì)突變體引物(表1),通過(guò)PCR擴(kuò)增構(gòu)建目標(biāo)突變體,反應(yīng)體系及條件分別如表2和表3所示。用Dpn I酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化,轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞,涂平板,挑取單菌落驗(yàn)證,將驗(yàn)證成功的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3),-20℃保存。

    表2 突變體擴(kuò)增反應(yīng)體系

    表3 突變體擴(kuò)增條件

    1.2.3 T1脂肪酶突變體表達(dá)及純化 將突變體重組質(zhì)粒菌株E.coli BL21(DE3)接種到LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL的Kan)中,37℃振蕩培養(yǎng)6-8 h,得種子液,再轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3 h至OD600為0.6-0.8,加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG于16℃(200 r/min)振蕩培養(yǎng)16 h。收集菌體,用10 mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液重懸、破碎(450 W,5 s/5 s/,25 min),10 000 r/min高速離心1 h,收集上清。利用1 mL His Trap FF鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化并進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證,以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯為底物檢測(cè)酶活。

    1.2.4 T1脂肪酶突變體最適溫度及溫度穩(wěn)定性 測(cè)定最適溫度時(shí),以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(pNPP)為底物,取100 μL純化酶液于40-80℃條件下分別測(cè)定酶活,分別將野生型及突變體最高酶活定義為100%,計(jì)算其余溫度下的相對(duì)酶活。測(cè)定溫度穩(wěn)定性時(shí),取100 μL酶液于40-80℃條件下保溫2 h后,在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定各溫度下的殘余酶活,將未保溫酶液在37℃條件下的酶活定義為100%。脂肪酶酶活單位定義:一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol 對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)脂肪酶水解酶活國(guó)際單位。

    1.2.5 T1脂肪酶突變體最適pH及pH穩(wěn)定性 配制pH 4-12的緩沖液:50 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 4-6);50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7-8);50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 9.0);50 mmol/L glycine-NaOH緩沖液(pH 10-11);50 mmol/L Na2HPO3/NaOH緩沖液(pH 12.0),將緩沖液與酶液以1∶1比例混勻[19],以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(pNPP)為底物檢測(cè)酶活。測(cè)定最適pH時(shí),將酶液分別與pH 4.0-12.0緩沖液混勻,檢測(cè)酶活,分別將野生型及突變體的最高酶活定義為100%,并計(jì)算其余溫度下的相對(duì)酶活。測(cè)定pH穩(wěn)定性時(shí),將酶液與pH 4.0-12.0緩沖液混勻,于37℃保溫1 h后,在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定酶活,將野生型及突變體的最高酶活定義為100%,測(cè)定其余pH下的殘余酶活。

    1.2.6 T1脂肪酶突變體的有機(jī)溶劑耐受性 將純化得到的酶液分別與不同log P值的有機(jī)溶劑:二甲基亞砜(-1.38)、乙腈(-0.4)、乙酸乙酯(1.8)、甲苯(2.5)、二甲苯(3.1)、正己烷(3.5)、異辛烷(4.4)、正十四烷(7.6)、正十六烷(8.8)以1∶3的體積比混合,在30℃條件下孵育30 min,并以200 r/min的速度振蕩混勻[16,20],最后以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯為底物測(cè)定酶活,將未經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑處理的酶液酶活定義為100%,計(jì)算各有機(jī)溶劑處理后的相對(duì)酶活。

    1.2.7 T1脂肪酶突變體的金屬離子耐受性 金屬離子是一種常見(jiàn)的添加劑,它對(duì)脂肪酶的反應(yīng)活性會(huì)產(chǎn)生明顯的影響[21-22],配制Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+溶液,分別將各離子溶液添加到純化后的脂肪酶液中,使離子終濃度為1 mmol/L,在65℃條件下孵育30 min[16,23],最后以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯為底物在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定脂肪酶酶活。將未經(jīng)過(guò)金屬離子處理的酶液酶活定義為100%,計(jì)算各金屬離子處理后的相對(duì)酶活[24]。

    1.2.8 T1脂肪酶突變體的底物選擇性 以不同鏈長(zhǎng)的三?;视王ィ–12-C18)為底物測(cè)定野生型脂肪酶及突變體的底物偏好性,分別將野生型及突變體脂肪酶在不同鏈長(zhǎng)底物下的最高酶活定義為100%,計(jì)算其余鏈長(zhǎng)底物下的相對(duì)酶活[15]。

    2 結(jié)果

    2.1 突變體的虛擬篩選

    通過(guò)不同壓力下的分子動(dòng)力學(xué)模擬及RMSD、RMSF和Rg分析發(fā)現(xiàn)組成T1脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)的α6螺旋為關(guān)鍵區(qū)域。該螺旋由15個(gè)氨基酸組成(176 FTDRFFDLQKAVLEA 190),為避免帶電氨基酸的突變?cè)斐傻鞍自宣}橋相互作用的損失,將螺旋上的5個(gè)帶電氨基酸Asp178、Arg179、Asp182、Lys185和 Glu189排除,對(duì)其余10個(gè)氨基酸進(jìn)行虛擬飽和突變并通過(guò)FoldX計(jì)算自由能變化小于0的突變體,得到36個(gè)突變體。運(yùn)用穩(wěn)定性預(yù)測(cè)軟件I-mutant 2.0、STRUM、DynaMut對(duì)36個(gè)突變體進(jìn)行再預(yù)測(cè),選擇3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集,最終得到該研究的3個(gè)突變體L188M、A190L和A190Y。

    2.2 T1脂肪酶突變體的表達(dá)及純化鑒定

    T1脂肪酶及其突變體純化酶液的SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示,圖1-A為野生型T1脂肪酶純化結(jié)果,圖1-B為突變體純化結(jié)果,由圖可知蛋白純化后在43 kD處出現(xiàn)一個(gè)明顯的蛋白條帶,與目的蛋白大小相符,證明本實(shí)驗(yàn)通過(guò)純化得到了較純的目的蛋白,可用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。

    以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(pNPP)為底物表征酶活并計(jì)算蛋白收率(表4)。結(jié)果顯示野生型T1脂肪酶及突變體均表現(xiàn)出酶活,突變體酶活相比野生型提高為12%-22%,且復(fù)合突變體酶活較單點(diǎn)突變體略高,野生型及突變體的蛋白收率為43%-57%。

    圖1 純化蛋白SDS-PAGE電泳驗(yàn)證結(jié)果圖

    表4 突變體純化小結(jié)

    2.3 T1脂肪酶突變體最適溫度及溫度穩(wěn)定性

    最適溫度及溫度穩(wěn)定性結(jié)果分別如圖2和圖3所示,圖2顯示野生型T1和3個(gè)單點(diǎn)突變體的最適溫度為65℃,而復(fù)合突變體L188M/A190L和L188M/A190Y的最適溫度為70℃。圖3顯示單點(diǎn)突變體及復(fù)合突變體的溫度穩(wěn)定性相比野生型均提高,并且復(fù)合突變體相比單點(diǎn)突變體提高幅度更明顯,60℃時(shí),野生型殘余酶活為56%,L188M/A190L殘余酶活為80%,相比野生型,復(fù)合突變體溫度穩(wěn)定性提高43%。L188M/A190Y的溫度穩(wěn)定性在70℃時(shí)提高顯著,殘余酶活為70%,而野生型殘余酶活為48%,相比野生型,復(fù)合突變體溫度穩(wěn)定性提高了46%。

    2.4 T1脂肪酶突變體的最適pH及pH穩(wěn)定性

    最適pH及pH穩(wěn)定性結(jié)果分別如圖4和圖5所示,結(jié)果顯示野生型T1及突變體的最適pH均為9.0,而突變體的pH穩(wěn)定性相比野生型呈現(xiàn)不同程度的提高,單點(diǎn)突變體A190L比L188M和A190Y的pH穩(wěn)定性略佳,在pH4-6的穩(wěn)定性提高較明顯,其中pH為6時(shí)提升效果更顯著,A190L殘余酶活為59%,野生型為41%,相比野生型,A190L的pH穩(wěn)定性提高44%。而復(fù)合突變體整體pH穩(wěn)定性高于單點(diǎn)突變體,其中L188M/A190L穩(wěn)定性幅度提高更明顯,對(duì)于pH 12的穩(wěn)定性約為野生型的2倍。

    圖2 野生型T1脂肪酶及突變體最適溫度

    圖3 野生型T1脂肪酶及突變體溫度穩(wěn)定性

    2.5 T1脂肪酶突變體的有機(jī)溶劑耐受性

    圖6反映了突變體對(duì)不同logP值有機(jī)溶劑的耐受性,結(jié)果顯示乙酸乙酯對(duì)野生型T1及突變體均有較強(qiáng)的抑制作用,酶活顯著降低。對(duì)于野生型及單點(diǎn)突變體而言,有機(jī)溶劑的作用效果基本相同,但是單點(diǎn)突變體的耐受性略高于野生型。復(fù)合突變體的耐受性相比野生型及單點(diǎn)突變體顯著增強(qiáng),尤其是對(duì)二甲基亞砜及正十六烷的耐受性提高最為明顯,野生型脂肪酶經(jīng)兩種溶劑處理后的殘余酶活分別為45%和33%,L188M/A190L的殘余酶活分別為85%和95%,L188M/A190Y的殘余酶活為88%和85%,相比野生型,L188M/A190L對(duì)兩種溶劑的耐受性分別為野生型的1.88倍和2.73倍,L188M/A190Y的耐受性為野生型的1.96倍和2.58倍。

    圖4 野生型T1脂肪酶及突變體最適pH

    圖5 野生型T1脂肪酶及突變體pH穩(wěn)定性

    圖6 野生型T1脂肪酶及突變體有機(jī)溶劑耐受性

    2.6 T1脂肪酶突變體的金屬離子耐受性

    如圖7所示,經(jīng)不同金屬離子處理后,野生型T1及突變體在Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Mn2+存在條件下依然能保持較高酶活,而Fe3+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活具有明顯的抑制作用。突變體對(duì)于各種金屬離子的耐受性相比野生型有不同程度的提高,復(fù)合突變效果更加顯著,經(jīng)Fe3+和Cu2+處理后,野生型殘余酶活為30%和35%,L188M/A190L殘余酶活為55%和62%,相比野生型脂肪酶,L188M/A190L對(duì)于Fe3+和Cu2+的耐受性分別提高50%和77%,且對(duì)Zn2+的耐受性為野生型的2倍。L188M/A190Y對(duì)Fe3+耐受性顯著增強(qiáng),處理后殘余酶活為65%,對(duì)Fe3+的耐受性為野生型的2.17倍。

    圖7 野生型T1脂肪酶及突變體金屬離子耐受性

    2.7 T1脂肪酶突變體的底物選擇性

    野生型T1及突變體對(duì)不同鏈長(zhǎng)底物的選擇性如圖8所示,結(jié)果表明底物鏈長(zhǎng)為C12時(shí),脂肪酶的反應(yīng)活性最佳,偏好性次之的底物鏈長(zhǎng)為C10,而底物鏈長(zhǎng)為C14-C18時(shí),反應(yīng)活性較低。整體而言,突變體較野生型T1對(duì)不同底物的反應(yīng)活性提高,復(fù)合突變體比單點(diǎn)突變體反應(yīng)活性提高趨勢(shì)更加顯著,對(duì)于長(zhǎng)鏈底物(C16-C18)的活性增強(qiáng)尤其明顯,底物鏈長(zhǎng)為C16和C18時(shí),L188M/A190L反應(yīng)活性分別為野生型的1.65倍和2.7倍,L188M/A190Y為野生型的1.5倍和2.25倍。

    3 討論

    綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出單點(diǎn)突變體L188M、A190L和A190Y的溫度、pH穩(wěn)定性以及有機(jī)溶劑耐受性、金屬離子耐受性相比野生型均有不同程度的提高,表明突變體較野生型更加穩(wěn)定,抗外界脅迫的作用力增強(qiáng)。推測(cè)L188M將Leu突變成側(cè)鏈更大的Met,一方面增加了空間位阻,有利于酶穩(wěn)定性的增強(qiáng);另一方面,引入的Met可能增強(qiáng)了穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力,如氫鍵等,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性與氫鍵的數(shù)量成正比。疏水相互作用是指在水介質(zhì)中,疏水性側(cè)鏈或者基團(tuán)為了避開(kāi)水的需要而被迫接近的傾向,疏水作用主要影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵,是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素[25-27]。A190L將Ala突變成疏水性較強(qiáng)的Leu,可能增加了α螺旋內(nèi)部疏水側(cè)鏈之間的相互作用,使α螺旋更加穩(wěn)定,從而使蛋白整體剛性增加,穩(wěn)定性增強(qiáng)。A190Y將Ala突變成Tyr后,疏水性減弱,但是抗外界因子脅迫能力增強(qiáng),表明穩(wěn)定性也得到了改善,推測(cè)突變后引入的酪氨酸因含有芳香環(huán)增強(qiáng)了與周圍氨基酸,如Phe、Tyr、Trp之間的芳香環(huán)作用,即π-π堆積,該作用力會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響[28]。另外將Ala突變成側(cè)鏈基團(tuán)更大的Tyr,會(huì)增加空間位阻,也有利于蛋白穩(wěn)定性的增強(qiáng)。突變體酶活及對(duì)不同鏈長(zhǎng)底物的反應(yīng)活性比野生型高,表明突變體除了整體穩(wěn)定性提高外,催化性能也得到了改善,突變后酶的活性位點(diǎn)更容易打開(kāi),酶與底物結(jié)合更容易。脂肪酶活性中心的催化三聯(lián)體一般位于疏水性裂縫中,活性位點(diǎn)打開(kāi)主要依靠催化口袋周圍疏水氨基酸的疏水作用力,推測(cè)突變后蛋白蓋子結(jié)構(gòu)疏水作用力增強(qiáng),蓋子作為活性位點(diǎn)的保護(hù)結(jié)構(gòu)在強(qiáng)疏水力的環(huán)境下更易打開(kāi),活性中心暴露,底物更容易進(jìn)入疏水通道與活性部位相結(jié)合發(fā)生催化反應(yīng)[29-30]。

    圖8 野生型T1脂肪酶及突變體底物選擇性

    復(fù)合突變體L188M/A190L和L188M/A190Y較單點(diǎn)突變體而言,酶學(xué)性能改善效果更顯著,可能由于兩個(gè)突變位點(diǎn)之間產(chǎn)生了協(xié)同作用,另外由于兩個(gè)位點(diǎn)相隔很近,同時(shí)突變后酶學(xué)性能達(dá)到疊加改善效果的可能性很高[31-32]。突變位點(diǎn)L188和A190都位于T1脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)的C端,進(jìn)行組合突變后,由于C端氨基酸疏水等作用力增強(qiáng),會(huì)使蓋子結(jié)構(gòu)C端與N端作用力發(fā)生變化,而兩者之間的相互作用對(duì)蛋白穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生巨大的影響[33],因此推測(cè)蓋子結(jié)構(gòu)兩端作用力的增強(qiáng)也是導(dǎo)致復(fù)合突變體酶學(xué)性質(zhì)改善的重要原因。

    4 結(jié)論

    本研究對(duì)T1脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)突變,對(duì)3個(gè)單點(diǎn)突變體L188M、A190L、A190Y和兩個(gè)復(fù)合突變體L188M/A190L、L188M/A190Y進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征,結(jié)果顯示突變體較野生型T1脂肪酶的酶學(xué)性能均呈現(xiàn)不同程度的增強(qiáng),且復(fù)合突變體酶學(xué)性能改善更明顯,溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑、金屬離子耐受性、底物選擇性等酶學(xué)性質(zhì)均得到綜合性提高,組合突變比單點(diǎn)突變效果更突出。從而獲得了酶學(xué)性能改善更為全面的T1脂肪酶突變體,使該酶抗外界環(huán)境因子脅迫的能力得到一定程度增強(qiáng),對(duì)于擴(kuò)大T1脂肪酶的應(yīng)用價(jià)值具有重要意義,拓寬了T1脂肪酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

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