嗜水氣單胞菌acrA缺失菌株的構(gòu)建及其生理功能的測(cè)定

李小艷 李澤琦 汪玉倩 于晶 林鎮(zhèn)平 林向民

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

AcrA蛋白是革蘭氏陰性菌中的一種含有398個(gè)氨基酸序列的內(nèi)膜蛋白，由α-螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)域、脂肪結(jié)構(gòu)域、β-桶狀結(jié)構(gòu)域和膜近端結(jié)構(gòu)域等4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，通常具有藥物外排泵的功能［1］。其中α-螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)域與TolC相互作用，膜近端結(jié)構(gòu)域和物外排結(jié)構(gòu)域則參與了與AcrB的相互作用［2］。AcrA在組裝為外排泵時(shí)常常作為二聚體組裝，通過(guò)將內(nèi)外膜組件結(jié)合在一起來(lái)完成泵的組裝。其通常與外膜蛋白和周質(zhì)空間蛋白組成三聯(lián)體復(fù)合物行使蛋白功能，將多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物或藥物等泵出到革蘭氏陰性細(xì)菌的胞外，在革蘭氏陰性細(xì)菌的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要的作用［3-4］。例如，大腸桿菌的AcrAB-TolC系統(tǒng)中，AcrA蛋白將周質(zhì)空間蛋白AcrB與外膜蛋白TolC連接形成復(fù)合物，從而起到藥物泵的作用，可以促進(jìn)氯霉素、四環(huán)素、紅霉素和溶劑的外排［5-6］；這種外排泵的過(guò)度表達(dá)還增加了大腸桿菌對(duì)異丁醇的耐受性及環(huán)丙沙星的耐藥性［7］。此外，Yutaka等研究發(fā)現(xiàn)，acrA的缺失或突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)多種抗生素（左氧氟沙星、林可霉素、米諾環(huán)素、頭孢他啶和頭孢呋辛等）、染料（吖啶黃素等）及去污劑（SDS和Triton等）的敏感性增加，還會(huì)顯著增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)膽鹽和癸酸（一種脂肪酸）的敏感性［8-9］。還有研究者提出，AcrA蛋白質(zhì)中具有較高保守性的氨基酸殘基是不同種屬菌株進(jìn)化的關(guān)鍵位點(diǎn)，當(dāng)細(xì)菌在外在環(huán)境發(fā)生變化時(shí)（如不同種類、濃度的抗菌藥物等），菌株為了適應(yīng)新的生長(zhǎng)條件，在選擇性壓力下產(chǎn)生氨基酸殘基的突變，如第51-60位、141-150位等氨基酸殘基的突變；從而能更加有效的泵出抗菌藥物，使其能耐受極端的環(huán)境［10］。由于AcrA蛋白質(zhì)在膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的重要作用，當(dāng)前關(guān)于該蛋白的研究大多數(shù)集中于AcrA在藥物泵中的功能，而對(duì)其在細(xì)菌其他生理功能的研究較少。嗜水氣單胞菌是廣泛存在的一類條件性致病菌，對(duì)魚類、禽類、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等有較強(qiáng)的感染力。此外，該菌對(duì)人類公共衛(wèi)生與食品安全造成了嚴(yán)重的威脅［11］。因此，研究該菌的各項(xiàng)生理功能對(duì)其防治具有深遠(yuǎn)的意義。本實(shí)驗(yàn)以水產(chǎn)病原菌嗜水氣單胞菌為研究對(duì)象，成功構(gòu)建acrA敲除菌株ΔacrA，探究acrA在嗜水氣單胞菌中的生理功能，豐富與補(bǔ)充了對(duì)該基因功能的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株該實(shí)驗(yàn)所用到的菌株，自殺載體pRE112，嗜水氣單胞菌ATCC 7966均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑和引物L(fēng)B培養(yǎng)基胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蔗糖購(gòu)買于廣州賽國(guó)生物科技有限公司；抗生素氨芐青霉素（Amp）100 μg/mL，氯霉素（Cm）30 μg/mL 均購(gòu)買于上海拜力生物科技有限公司，綿羊血和脫脂牛奶均購(gòu)買于索萊寶生物科技有限公司。膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)買于 Omega；總DNA提取試劑盒購(gòu)買于北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司；常用的Xba I和Sac I限制性內(nèi)切酶購(gòu)買于Thermo FisherScientific；ClonExoress Multis?One Step Cloning Kit C113多克隆片段連接酶購(gòu)買于南京諾唯贊生物科技有限公司，引物由福州博尚生物公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 acrA敲除菌的構(gòu)建 根據(jù)acrA基因序列設(shè)計(jì)目的基因上下游同源臂，以嗜水氣單胞菌ATCC 7966總基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因上下游各500 bp左右的兩條同源臂，將上下游兩條同源臂用多克隆片段連接酶與經(jīng)過(guò)（Xba I和Sac I）雙酶切的pRE112進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至MC1061感受態(tài)細(xì)胞中，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入S17感受態(tài)細(xì)胞；將攜帶兩條同源臂的pRE112載體的S17菌與嗜水氣單胞菌按1∶4的比例在濾紙片上結(jié)合培養(yǎng)16-18 h，進(jìn)行第一次同源重組，然后將無(wú)菌LB培養(yǎng)液洗滌下來(lái)的混合菌液涂于雙抗板上（氨芐青霉素和氯霉素），挑取陽(yáng)性克??；將該陽(yáng)性克隆的過(guò)夜菌涂布于含有20% 蔗糖的LB平板上，然后挑取單克隆，分別點(diǎn)在氯霉素和正常LB平板上。最后選取在氯霉素板上不長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆用P5P6及P7P8進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，P7P8 PCR得到的1 000 bp左右的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得ΔacrA敲除菌株，穩(wěn)定遺傳20代后，-80℃保菌。以上步驟根據(jù)表1設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證并測(cè)序，PCR體系（20 μL：DNA模板3 μL，2×Hieff?PCR Master Mix（With Dye）10 μL上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 15 μL，PCR程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，X℃ 30 s，72℃ Y s，72℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 培養(yǎng)基配置 LB 液體培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂），抗性培養(yǎng)基為在 LB 培養(yǎng)基滅菌溫度降至60℃后，按相應(yīng)比例加入Amp（終濃度為100 mg/L），Cm（終濃度為30 mg/L）。0.7%綿羊血瓊脂平板，按0.7%（V/V）將無(wú)菌綿羊血與無(wú)菌固體LB培養(yǎng)基均勻混合，倒無(wú)菌0.7%綿羊血瓊脂平板；1.0% 牛奶瓊脂平板，10%的液體牛奶115℃，20 min滅菌溫度降至60℃按1.0%（V/V）將牛奶與固體無(wú)菌LB培養(yǎng)基均勻混合，倒無(wú)菌1.0% 牛奶瓊脂平板。

表1 嗜水氣單胞菌acrA基因缺失以及驗(yàn)證引物列表

1.2.3 溶血性的測(cè)定 將過(guò)夜的野生菌株和敲除菌株按1%（V/V）轉(zhuǎn)接至新鮮LB中，30℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為1.0后，將上述菌液各取5 μL 點(diǎn)于挖好孔的1.0%綿羊血瓊脂平板上，30℃正置培養(yǎng)16 h，觀察并測(cè)量溶血斑直徑。上述實(shí)驗(yàn)皆重復(fù)3次，并用Graph Pad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 胞外蛋白酶活的測(cè)定 將過(guò)夜的野生菌株和敲除菌株按1%（V/V）轉(zhuǎn)接至新鮮LB中，30℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為1.0后，將上述菌液各取5 μL 點(diǎn)于挖好孔的1.0%牛奶瓊脂平板上，30℃正置培養(yǎng)16 h，觀察并測(cè)量牛奶斑直徑。上述實(shí)驗(yàn)皆重復(fù)3次，并用Graph Pad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 ΔacrA 對(duì)抗生素及染料的敏感性測(cè)定 將過(guò)夜16 h的野生菌株和敲除菌株按1%（V/V）轉(zhuǎn)接至新鮮LB，30℃，200 r/min至OD600nm為1.0，將10 μL菌液接入到1 mL新鮮LB中，然后進(jìn)行梯度稀釋（10-2-10-8），每個(gè)梯度取2 μL菌液點(diǎn)在含抗生素或染料的瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)16 h，拍照，重復(fù)3次。1.2.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 分別挑取野生菌和敲除菌的單克隆于液體LB培養(yǎng)基中，30℃或42℃，200 r/min培養(yǎng)16 h；將上述菌液以1∶100（V/V）轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600nm約為1.0 然后按 1∶100 稀釋，將稀釋后的菌液加入生長(zhǎng)曲線板的孔隙中，每孔加入300 μL，每個(gè)菌做3次重復(fù)，隨后將生長(zhǎng)曲線板置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（Bioscreen）中培養(yǎng)16 h。最后用GraphPad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.7 生物膜的測(cè)定將培養(yǎng)16 h的野生菌株和敲除菌株按 1%（V/V）轉(zhuǎn)接至新鮮LB，30℃或42℃，200 r/min培 養(yǎng) 至OD600nm為1.0，再按1%（V/V）轉(zhuǎn)接至96孔微量板中30℃靜置培養(yǎng)24 h；用SpectraMax? i3多功能酶標(biāo)儀（Molecular devices）檢測(cè)其OD600nm波長(zhǎng)下的吸光值；棄去菌液，用雙蒸水緩慢洗滌3次后晾干；每孔中加入 250 μL的0.01%（W/V）結(jié)晶紫溶液，室溫靜置染色30 min；棄去結(jié)晶紫染液，再用雙蒸水緩慢洗滌3次晾干；最后每孔加入300 μL的 95%（V/V）的乙醇溶液，用SpectraMax?i3多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD595nm波長(zhǎng)下的吸光值，每個(gè)樣品做8孔重復(fù)，并做3次生物學(xué)重復(fù)。最后將數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 acrA敲除菌構(gòu)建的結(jié)果

利用同源重組原理，通過(guò)目的基因的驗(yàn)證引物P5P6及同源臂外側(cè)引物P7P8對(duì)獲得的敲除菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示：泳道1和2分別是P5P6對(duì)敲除菌株及野生菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證的結(jié)果，泳道3和4分別是P7P8對(duì)敲除菌株及野生菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證的結(jié)果。

圖1 acrA敲除菌株P(guān)CR驗(yàn)證

2.2 溶血性測(cè)定的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中為測(cè)定野生菌株和敲除菌株的溶血性，在0.7%綿羊血瓊脂平板的孔隙中培養(yǎng)敲除菌和野生菌16 h，對(duì)溶血斑的大小進(jìn)行觀察并用GraphPad Prism 5對(duì)溶血斑直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到如圖2所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2 野生菌株與敲除菌株溶血性測(cè)定

2.3 胞外蛋白酶活測(cè)定的結(jié)果

研究中為測(cè)定野生菌株和敲除菌株的胞外蛋白酶活，將野生菌和敲除菌在1.0% 牛奶瓊脂平板的孔隙中培養(yǎng)16 h，對(duì)牛奶水解圈的的大小進(jìn)行觀察并用GraphPad Prism 5對(duì)牛奶水解圈的直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到如圖3所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 野生菌株與敲除菌株胞外蛋白酶活測(cè)定

2.4 ΔacrA對(duì)抗生素及染料的敏感性測(cè)定結(jié)果

為了探究 acrA缺失后，嗜水氣單胞菌對(duì)抗生素及染料敏感性的變化，將野生菌株和敲除菌株分別在含有卡那霉素（Kanamycin 6.25 μg/μL）、羅紅霉素（Erythromycin 32 μg/μL）、巴洛沙星（Balofloxacin 0.05 μg/μL）抗生素及吖啶黃素染料（Acriflavinium chloride 10 μg/μL）的瓊脂平板上的進(jìn)行稀釋點(diǎn)板，得到如圖4所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定的結(jié)果

為了探究acrA缺失后對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)及高溫脅迫性的影響，利用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（Bioscreen）在30℃和42℃下分別測(cè)定野生菌與敲除菌16 h的生長(zhǎng)趨勢(shì)，通過(guò)GraphPad Prism 5對(duì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到如圖5所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4 野生菌株與敲除菌株對(duì)Kanamycin、Erythromycin、Balofloxacin抗生素及Acriflavinium chloride染料敏感性的測(cè)定

圖5 野生菌株與敲除菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)測(cè)定

2.6 生物膜測(cè)定的結(jié)果

將野生菌株和敲除菌株分別培養(yǎng)16 h，再利用結(jié)晶紫染色法測(cè)定野生菌株和敲除菌株在30℃和42℃條件下生物膜的形成能力，通過(guò)GraphPad Prism 5對(duì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到如圖6所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖6 野生菌株與敲除菌株生物膜形成能力測(cè)定

3 討論

AcrA蛋白一般通過(guò)與AcrB和TolC的相互作用形成AcrAB-TolC多藥泵系統(tǒng)，從而排出如氯霉素、四環(huán)素、紅霉素等多種抗生素，在細(xì)菌的藥物外排中起著至關(guān)重要的作用［12-14］。有研究結(jié)果表明AcrA在一些染料試劑的滲透過(guò)程中也有關(guān)鍵作用［15-17］，acrA基因的突變或缺失會(huì)提高細(xì)菌對(duì)許多抗生素和染料試劑的敏感性。曾有文獻(xiàn)報(bào)道嗜水氣單胞菌中的acrA基因也有這樣的功能，把嗜水氣單胞菌中的acrA基因在大腸桿菌中高表達(dá)發(fā)現(xiàn)，acrA增加了大腸桿菌對(duì)奎諾酮類藥物的外排作用［18］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。迄今為止acrA基因的研究幾乎都是與藥物外排及膜的通透性相關(guān)［19］，而關(guān)于該基因在細(xì)菌中其他生理方面的功能知之甚少。為了充分了解該基因在細(xì)菌生長(zhǎng)中所起的作用，本實(shí)驗(yàn)首先成功敲除了嗜水氣單胞菌中的acrA基因，如圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，通過(guò)P5P6及P7P8分別對(duì)敲除菌株和野生菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同源重組技術(shù)的理論結(jié)果一致。本文還研究了嗜水氣單胞菌中acrA基因在溶血性、胞外毒理性、抗生素和染料的敏感性、生物膜形成及高溫耐受性等方面的功能。

本研究通過(guò)對(duì)圖2和圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得到溶血斑及牛奶水解圈的直徑幾乎沒有差別，這表明了acrA基因可能與細(xì)菌中的毒理因子無(wú)關(guān)。但是由圖4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)acrA基因的缺失可以提高嗜水氣單胞菌對(duì)卡那霉素，羅紅霉素，巴洛沙星及吖啶黃素的敏感性。隨后圖5生長(zhǎng)曲線測(cè)定的結(jié)果說(shuō)明：30℃條件下野生菌株與敲除菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)沒有差別，但是在42℃條件下野生菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯比敲除菌株的好，表明acrA基因的缺失本身不會(huì)影響嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)，但會(huì)降低嗜水氣單胞菌的高溫耐受性，提示acrA基因與高溫耐受性有關(guān)；同時(shí)圖6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在30℃條件下野生菌株生物膜的形成能力明顯比敲除菌的能力弱，而在42℃下野生菌生物膜的形成能力明顯強(qiáng)于敲除菌，這說(shuō)明在高溫刺激下野生菌生物膜形成能力也比敲除菌株的強(qiáng)，與高溫環(huán)境下野生菌株和敲除菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，暗示著嗜水氣單胞菌中acrA基因可能通過(guò)影響嗜水氣單胞菌的高溫耐受性，從而影響該菌生物膜的形成，研究者已經(jīng)證明在42℃高溫下培養(yǎng)嗜肺乳桿菌菌株和肺炎鏈球菌菌株，其生物膜的形成能力能夠得到顯著的提高［20］。但是在嗜水氣單胞菌中acrA基因是如何通過(guò)影響高溫耐受性進(jìn)而調(diào)節(jié)生物膜的形成還有待進(jìn)一步研究。除此之外，我們還在正常溫度下對(duì)野生菌和敲除菌株的生物膜形成能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在正常溫度下野生菌株的生物膜形成能力明顯弱于敲除菌株，因此推測(cè)在嗜水氣單胞菌中acrA基因?qū)ι锬さ男纬捎胸?fù)調(diào)控的功能。曾有研究表明適宜溫度下分別缺失沙門氏菌中的tolC、acrE和acrF基因都會(huì)產(chǎn)生沙門氏菌的csgB基因表達(dá)下調(diào)，減少curli菌毛產(chǎn)生，影響細(xì)菌形成成熟生物膜的現(xiàn)象，但是并未發(fā)現(xiàn)acrA基因的缺失會(huì)對(duì)細(xì)菌生物膜的形成產(chǎn)生影響［21］。而本研究發(fā)現(xiàn)在嗜水氣單胞菌中acrA的缺失會(huì)顯著增強(qiáng)生物膜形成能力，說(shuō)明在不同細(xì)菌中可能存在多個(gè)調(diào)控因子影響其對(duì)生物膜形成的作用。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了acrA基因的敲除菌株，通過(guò)溶血性、胞外蛋白酶活性、抗生素及染料的敏感性、生長(zhǎng)趨勢(shì)和生物膜形成的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌中acrA基因與毒理能力無(wú)關(guān)，但在抗生素外排中可能起一定的調(diào)節(jié)作用。而且研究還發(fā)現(xiàn)acrA基因起著熱脅迫抗逆性的功能，并參與調(diào)控細(xì)菌的生物膜形成。這一發(fā)現(xiàn)豐富了我們對(duì)acrA基因功能的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步探究AcrA蛋白在細(xì)菌中高溫耐受性及對(duì)生物膜形成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。