豬肉生產(chǎn)鏈四環(huán)素抗性基因污染分布研究進(jìn)展

□ 張程鵬 申元英 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖上的應(yīng)用極為廣泛。我國(guó)是抗生素生產(chǎn)和使用大國(guó)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)一年生產(chǎn)抗生素21萬(wàn)噸，其中有40%左右被用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)[1]，尤其在雞、鴨、豬的養(yǎng)殖中使用更為嚴(yán)重。四環(huán)素作為一種廣譜抗生素廣泛用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)，用以預(yù)防和治療動(dòng)物疾病及促生長(zhǎng)[2]。而抗生素大多未能被充分吸收，抗生素的濫用和對(duì)四環(huán)素污染處理工藝的缺乏使得環(huán)境中的抗生素殘留濃度增加。殘留的抗生素含量最高可達(dá)到mg/kg級(jí)水平。如：豬糞中檢出四環(huán)素類藥物的濃度高達(dá)59.06 mg/kg[3]。自然環(huán)境中的微生物種類、數(shù)量眾多，環(huán)境中抗生素殘留的增多大大增加了致病菌或條件致病菌獲得抗生素抗性的機(jī)會(huì)，產(chǎn)生大量的抗性基因。

基因是遺傳信息的載體，抗生素抗性 基 因（Antibiotic resistance genes,ARGs）即具有抗性的遺傳因子[4],其賦予攜帶該基因的生物體以對(duì)抗生素的抗性。耐藥基因有可能會(huì)通過(guò)直接接觸或沿著食物鏈的污染等多種途徑進(jìn)入到動(dòng)物體內(nèi),提高致病菌的抗生素抗藥性,使得細(xì)菌感染性疾病的治療難度更大，導(dǎo)致大量攜帶有ARGs的微生物出現(xiàn)，最終結(jié)果便是抗生素治療效力的日益下降。目前已發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗性基因（Tet-R）的種類達(dá)到40種以上?？剐曰蚴强剐跃哂锌剐缘闹饕蛑唬股乜剐约?xì)菌對(duì)抗生素的耐藥機(jī)理包括：細(xì)菌外膜不滲透性障礙、細(xì)菌外排泵系統(tǒng)、抗生素作用的靶位變化和抗生素的鈍化失活等[5]。它可以通過(guò)多種形式的可移動(dòng)遺傳原件如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制（horizontal gene transfer，HGT）在微生物間、微生物與自然環(huán)境間轉(zhuǎn)移傳播[6]。

2014年，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球抗生素耐藥報(bào)告》明確指出抗生素抗性是21世紀(jì)公共衛(wèi)生的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，針對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)應(yīng)監(jiān)督和促進(jìn)畜禽業(yè)的合理用藥，并強(qiáng)調(diào)了食用動(dòng)物的抗生素抗性及其在食物鏈的傳播方面的數(shù)據(jù)缺乏，應(yīng)加強(qiáng)此方面的研究[7]。我國(guó)目前正大力推行生豬養(yǎng)殖屠宰定點(diǎn)化，廢水的生物處理、農(nóng)田利用等公益模式。本研究通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，總結(jié)歸納了豬肉生產(chǎn)鏈中生豬養(yǎng)殖、屠宰、上市等環(huán)節(jié)中的豬肉、環(huán)境以及廢棄物中四環(huán)素抗性基因污染情況，以期讓更多人對(duì)生豬生產(chǎn)鏈中抗生素耐藥性問(wèn)題有更深入的認(rèn)識(shí)，為養(yǎng)殖業(yè)抗生素耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供一定的支持。

1 生豬生產(chǎn)鏈中四環(huán)素抗性基因分布情況

目前畜禽養(yǎng)殖業(yè)耐藥菌的研究主要是與動(dòng)物傳染性疾病及人畜健康關(guān)系密切的病原菌。許多研究發(fā)現(xiàn)，生豬生產(chǎn)鏈中Tet-R的分布存在空間差異性和時(shí)間差異性。例如：Christina[8]等通過(guò)熒光定量PCR（q-PCR）對(duì)生產(chǎn)鏈中的豬肉進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)零售環(huán)節(jié)（5.58 log copies）的豬肉較屠宰場(chǎng)環(huán)節(jié)（2.38 log copies）的豬肉tet（M）濃度顯著升高，且存在實(shí)質(zhì)性差異。作者認(rèn)為腸球菌應(yīng)該是可能的病原體及tet（M）潛在受體，其他一些多見(jiàn)于革蘭氏陰性菌群的抗性基因或在革蘭氏陽(yáng)性與革蘭氏陰性菌之間有更高可交換程度的抗性基因，可能在生產(chǎn)鏈中會(huì)顯示出相似的積累。Guillermo[9]等人利用宏基因組DNA序列的方法在生豬屠宰的“麻醉區(qū)”“動(dòng)物到達(dá)區(qū)”均檢測(cè)到了Tet-R，比如tet（B）、tet（Q）和tet（X）。Looft[10]等人的研究有類似的發(fā)現(xiàn)，雖在檢出的35～62個(gè)ARGs中Tet-R僅有1～4個(gè)，但這可以用“豬腸道微生物受到多重抗生素的選擇壓力，對(duì)抗生素壓力的抗性是由通用的外排泵機(jī)制而非特定的抗性基因驅(qū)動(dòng)的”這一理論來(lái)解釋。王學(xué)君[11]等人研究了從貴州省8個(gè)地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)分離的豬源大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)其攜帶的四環(huán)素耐藥基因的檢出率為（41.50%～92.60%）。孟赫誠(chéng)[12]等對(duì)生豬肉加工廠食品接觸面進(jìn)行Tet-R檢測(cè)，存在9種四環(huán)素耐藥基因，其中tet（L）的檢出率最高，為7.7%，其次為tet（A）（6.0%）、tet（B）（4.8%）、tet（C）（4.8%）、tet（E）（3.6%）、tet（M）（3.6%）、tet（S）（3.6%）、tet（K）（1.2%）和tet（X）（0.6%）。所有分離菌無(wú)論對(duì)四環(huán)素敏感還是耐藥都攜帶1種或多種耐藥基因，這可能與基因選擇性表達(dá)有關(guān)，同時(shí)可觀察到生豬肉加工廠食品接觸面Tet-R多為核糖體保護(hù)基因，與王珊珊[13]等人的研究結(jié)果類似。Rukayya[14]對(duì)接受常規(guī)農(nóng)場(chǎng)治療而未使用抗微生物劑的豬的糞便大腸桿菌的表型-基因型抗微生物耐藥性（AMR）模式與常規(guī)使用抗生素超過(guò)70天的豬的比較，發(fā)現(xiàn)兩組動(dòng)物中均能檢測(cè)出Tet-R（63.9%的分離物中發(fā)現(xiàn)至少一個(gè)四環(huán)素抗性基因），且在生長(zhǎng)階段也檢測(cè)到了Tet-R，因此認(rèn)為豬的ARGs可以在生長(zhǎng)過(guò)程中的任何階段形成，且與是否直接接觸抗生素關(guān)系不是十分密切。

生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物同樣有很高的Tet-R檢出。Cheng W等[15]利用熒光定量PCR方法對(duì)中國(guó)東南地區(qū)5省的16個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中的5類抗生素（四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類）的21種耐藥基因進(jìn)行定量調(diào)查，發(fā)現(xiàn)糞便樣品中tet（M）基因是污染程度最重的基因之一，其相對(duì)豐度達(dá)到了copies/g，陽(yáng)性率大于90%。土壤樣品中tet（C）、tet（M）為優(yōu)勢(shì)基因，濃度高于copies/g。任雪麗[16]等對(duì)上海市松江區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)的豬糞耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌（TRLFE）進(jìn)行四環(huán)素抗性基因檢測(cè)，檢測(cè)菌株總數(shù)的74.03%攜帶至少1種或2種Tet-R基因，樣品的乳糖發(fā)酵型腸桿菌中tet（R）基因檢出率范圍為3.12%～96.87%。tet（A）和tet（B）在所有樣品中均有檢測(cè)到，與Al-Bahry SN[17]和Roberts[18]等的研究結(jié)果基本吻合。Tet-R的分布存在一定的時(shí)間分布特征，tet（S）則僅出現(xiàn)在9月份和11月份，tet（M）幾乎在每個(gè)季度的豬糞中的TR-LFE中都有檢測(cè)到，而所有樣品中都沒(méi)有檢測(cè)到編碼核糖體蛋白的tet（O）和tet（X）。在生豬養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中的情況則有所不同[19]，Cheng等[15]檢測(cè)了豬場(chǎng)廢水中的四環(huán)素抗性基因，發(fā)現(xiàn)編碼核糖體蛋白的抗性基因（tetM、tetO、tetQ、tetW）比外排泵機(jī)制抗性基因（tetA、tetB、tetC、tetL）、編碼使抗生素失活的修飾酶的抗性基因（tetX）的豐度更高，分別為9.25×、5.53×、1.69× copies/16S rRNA。Tao等檢測(cè)了中國(guó)臺(tái)灣6個(gè)豬場(chǎng)污水處理系統(tǒng)中的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)tetA、tetW（-）在所有樣品中均被檢出。

2 抗生素耐藥性（antimicrobial resistance,AMR）常見(jiàn)分子生物學(xué)檢測(cè)方法——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR是1980年代開(kāi)發(fā)的技術(shù)，在分子生物學(xué)中應(yīng)用廣泛[20-21]。常規(guī)PCR包括3個(gè)步驟：在95 ℃下使雙鏈DNA變性，在50～60 ℃下對(duì)PCR引物進(jìn)行退火，以及在72 ℃下進(jìn)行DNA延伸。結(jié)束后可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)并用溴化乙錠或其他熒光DNA螯合染料對(duì)DNA染色來(lái)可視化PCR擴(kuò)增的基因產(chǎn)物。

PCR技術(shù)發(fā)展迅速且已較成熟，一些進(jìn)展如：實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）和等溫?cái)U(kuò)增。實(shí)時(shí)PCR又稱為定量PCR（qPCR），反應(yīng)體系中存在有利于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目標(biāo)DNA序列擴(kuò)增的熒光染料，因此在PCR后無(wú)須進(jìn)行可視化電泳操作步驟，省時(shí)且更加安全[22]，越來(lái)越多的研究選用qPCR進(jìn)行AMR檢測(cè)。RT-PCR可以使用插入任何雙鏈DNA的非特異性染料，或者由寡核苷酸組成的序列特異性DNA探針，這些寡核苷酸用熒光來(lái)報(bào)告基因標(biāo)記，只有在探針與其互補(bǔ)序列雜交后才能進(jìn)行檢測(cè)順序[23]。等溫PCR（如LAMP和RPA）的特殊之處則在于整個(gè)過(guò)程在恒定的溫度下進(jìn)行，具有條件要求簡(jiǎn)單、資源要求低、適用于現(xiàn)場(chǎng)操作觀察等特點(diǎn)。多重PCR在檢測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌中與頭孢菌素或碳青霉烯[24]抵抗有關(guān)的β-內(nèi)酰胺酶時(shí)也體現(xiàn)出了投入少、時(shí)間消耗少等優(yōu)勢(shì)。RT-PCR的優(yōu)勢(shì)在于可以檢測(cè)特定基因中的點(diǎn)突變，而普通PCR則無(wú)法做到。q-PCR常常用于較短片段的檢測(cè)，而常規(guī)PCR則能用于大片段的檢測(cè)。PCR作為該領(lǐng)域的主要技術(shù)仍在蓬勃發(fā)展：Glocker等利用RT-PCR檢測(cè)16S rRNA基因突變，且能夠區(qū)分出野生型菌株和表現(xiàn)出單堿基對(duì)、雙堿基對(duì)或三堿基對(duì)突變的抗性菌株[25]。

3 結(jié)論與展望

由于技術(shù)、經(jīng)濟(jì)、管理等各方面的限制，我國(guó)豬肉生產(chǎn)鏈中Tet-R污染嚴(yán)重，耐藥基因分布存在一定的空間分布特征和時(shí)間分布特征。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，廢棄物未能得到妥善處理，廢水大多直接排放或進(jìn)行簡(jiǎn)單處理即排放，急需新的能夠降低廢水中ARGs殘留的廢棄物處理工藝；生豬糞便多采用簡(jiǎn)單堆放風(fēng)干處理，少數(shù)進(jìn)行堆肥或發(fā)酵處理。堆肥能有效降低有機(jī)肥料中的四環(huán)素抗性基因殘留，但是也增加了向土壤中播撒ARGs的風(fēng)險(xiǎn)。從屠宰到生產(chǎn)零售環(huán)節(jié)，由于加工面的污染，也使得豬肉中Tet-R的污染情況增加。由于四環(huán)素在豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中作為促生長(zhǎng)劑和抑菌藥而占據(jù)重要地位，Tet-R的污染情況十分值得關(guān)注，針對(duì)此現(xiàn)狀本文提出如下建議：①避免創(chuàng)造適于抗性基因選擇、動(dòng)員和儲(chǔ)存的環(huán)境。如：制定糞便堆肥的相關(guān)技術(shù)指標(biāo)，改良污水處理工藝等。②阻斷耐藥菌向致病微生物組的擴(kuò)散途徑。制定關(guān)于農(nóng)業(yè)廢棄物排放的法律法規(guī)，減少農(nóng)業(yè)廢棄物的使用，從而降低環(huán)境中的ARGs傳播給人類、糧食作用和野生生物的風(fēng)險(xiǎn)。③限制抗藥性病原體的選擇壓力，對(duì)人和動(dòng)物謹(jǐn)慎使用抗生素。優(yōu)化牲畜的生活條件，以減少中國(guó)食用動(dòng)物的抗生素消耗；臨床上規(guī)范合理用藥等。④建立完善健全的監(jiān)測(cè)管理系統(tǒng)。從Tet-R的多樣性可見(jiàn)，還有更多的抗性基因可供病原體吸收。即使沒(méi)有直接的抗生素選擇壓力，Tet-R仍然有出現(xiàn)的可能，并且已存在的Tet-R不可能被消除。在病原體中出現(xiàn)的新的ARGs有可能會(huì)給人類健康、畜牧業(yè)等帶來(lái)毀滅性的打擊。因此在國(guó)家積極引導(dǎo)以及科研人員密切配合下建立標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的，免費(fèi)共享的，定期更新的監(jiān)測(cè)管理系統(tǒng)是控制抗生素污染的重要措施。