短乳桿菌鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的重組表達(dá)及其性質(zhì)研究

方若思 周澄笑 金誠豫 張一維 黃溫迪 黃 俊 呂常江 肖功年 龔金炎 陳啟和

（1 浙江科技學(xué)院 杭州310023 2 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室 杭州310023 3 浙江大學(xué) 杭州310058）

鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶（OTCase/OTC，EC 2.1.3.3） 是瓜氨酸合成代謝中的一個關(guān)鍵酶，廣泛存在于動、植物與微生物中，分布于生物生長發(fā)育的各個階段。在原核生物和真菌中，OTCase 是一種雙功能酶，不僅可催化瓜氨酸的合成，也催化瓜氨酸的降解[1-2]；在植物中，它是尿素循環(huán)第1 步反應(yīng)的催化酶，催化鳥氨酸和氨甲酰磷酸反應(yīng)合成瓜氨酸和磷酸鹽[3]；在動物中，OTCase 主要參與尿素循環(huán)，是尿素循環(huán)的關(guān)鍵酶之一；在人體內(nèi)，OTCase是肝臟尿素循環(huán)的必需酶，OTCase 的缺失常導(dǎo)致嗜睡、嘔吐、精神發(fā)育遲緩等癥狀，同時OTCase的缺失與否也可作為肝細(xì)胞癌的早期診斷指標(biāo)之一[4-5]。

鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶參與乳酸菌精氨酸代謝途徑的關(guān)鍵一步，即將瓜氨酸分解成為鳥氨酸和氨甲酰磷酸。瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，因最先從西瓜中獲取而得名[6]。研究表明，瓜氨酸對于男性性功能障礙、高血壓和冠心病具有一定療效，并可作為人體NO 產(chǎn)生的評價因子，且在腦血流的調(diào)節(jié)，提高身體免疫力和美容護(hù)膚中具有重要的作用[7-10]。

除上述優(yōu)點外，瓜氨酸也是發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的重要前體物[11-12]。氨基甲酸乙酯（簡稱EC，又稱脲烷），是一種在試驗動物甚至人體內(nèi)造成多位點致癌的物質(zhì)，2007年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定EC 為2A 類致癌物質(zhì)，與丙烯酰胺同等危險。EC 存在于多種發(fā)酵食品，尤其是發(fā)酵的酒精飲料中，如葡萄酒、黃酒、日本清酒等[13-14]。

酒類中的瓜氨酸主要來自精氨酸降解。在乳酸菌中，精氨酸的降解通過精氨酸脫亞胺酶途徑（arginine deiminase pathway，ADI pathway）完成。在這一途徑中，包含3 個關(guān)鍵酶：精氨酸脫亞胺酶（ADI，arginine deiminase，EC 3.5.3.6）、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶 （OTC，ornithine transcarbamylse，EC 2.1.3.3） 和氨基甲酸激酶（CK，carbamatekinase，EC 2.7.2.2）[15]，它們分別由arcA、arcB 和arcC 基因編碼[16]，如圖1所示。

圖1 乳酸菌中精氨酸的代謝途徑Fig.1 Arginine metabolic pathway in LAB

目前，對精氨酸脫亞胺酶的研究較為透徹，而對鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的研究仍為空白。尋找更加安全有效的OTCase 具有重要的研究價值。

乳桿菌是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在含碳水化合物的動物及植物發(fā)酵產(chǎn)品以及溫血類動物的消化系統(tǒng)中十分常見，作為一般認(rèn)為安全（Generally recognized as safe，GRAS）的食品級微生物，在食品、工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域中亦擁有重要的應(yīng)用價值。挖掘益生性乳酸菌源的各種酶類是目前人們的關(guān)注點之一。短乳桿菌（Lactobacillus brevis） 是乳桿菌屬中一種非常重要的菌種，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫顯示短乳桿菌中無疑存在著具有生物活性的OTCase。獲取并研究短乳桿菌的OTCase 酶學(xué)性質(zhì)，將為探索其應(yīng)用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 短乳桿菌（Lactobacillus brevis），由浙江大學(xué)食品微生物重點實驗室保存；大腸桿菌BL21（DE3），購自全試金公司；質(zhì)粒pET-28a，由浙江科學(xué)院保存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、L-精氨酸、DL-鳥氨酸、茚三酮、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan）、Ni-NTA 瓊脂糖樹脂，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、SalI，購自TaKaRa 公司，

1.1.3 培養(yǎng)基

1）LB 培養(yǎng)基 酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

2）MRS 培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉5 g/L，酵母浸粉4 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三胺2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，pH 6.2，用于短乳桿菌的培養(yǎng)。

1.2 鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的克隆

短乳桿菌鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的正向引物序列：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAA AATGTA-3’（下劃線為BamHI 識別序列）；反向引物 序 列：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAA TAAGTTACCT-3’（下劃線為SalI 識別序列）。以短乳桿菌的基因組DNA 為模板，進(jìn)行鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的基因擴(kuò)增，反應(yīng)程序：98 °C 變性5 min，以98°C 20 s，55°C 15 s，72°C 20 s 反應(yīng)35個循環(huán)后，72 °C 延伸7 min，最后冷卻至4 °C。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

采用限制性內(nèi)切酶BamHI 和SalI 分別對鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因片段和載體pET-28a 進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含卡那霉素的LB 培養(yǎng)平板上，經(jīng)菌落PCR 驗證后，篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆子DNA 后測序驗證。

1.4 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

挑取陽性單菌落接種于5 mL LB 培養(yǎng)基中，于37°C、200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL LB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)于37°C、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，至OD600nm值在0.6～0.8時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），25°C、180 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。

離心、收集菌體后，加入30 mL 緩沖液 （50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑pH 8.0） 重懸菌體，隨后冰水浴超聲破碎細(xì)胞，4°C、9 000/min 離心30 min，獲得上清液。

Ni-NTA 瓊脂糖樹脂是螯合金屬Ni2+而形成的一種親和層析介質(zhì)。該純化介質(zhì)對帶有His-Tag的蛋白有專一的吸附能力，能使His-Tag 蛋白結(jié)合在Ni-NTA 親和層析介質(zhì)上，而沒有結(jié)合的雜蛋白被洗滌掉。結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)一定濃度的咪唑洗脫下來，得到高純度的目的蛋白。參照Ni-NTA 瓊脂糖樹脂的使用說明，采用親和層析純化重組蛋白，隨后用SDS-PAGE 檢測蛋白純度及分子質(zhì)量。

1.5 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶活性的測定[17]

取125 μL 酶液與125 μL 10 mmol/L MnCl2在55 ℃下培養(yǎng)20 min，激活酶，加入250 μL 0.1 mol/L 精氨酸底物（pH 9.5），于37 ℃水解55 min。取樣100 μL，加入300 μL 冰醋酸終止酶反應(yīng)，最后加入100 μL 70 mmol/L 茚三酮進(jìn)行比色測定，檢測有無鳥氨酸形成。煮沸30 min 后測OD515nm值。根據(jù)鳥氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程計算酶液中鳥氨酸含量，蛋白含量采用Brandford 法測定。OTC 酶活定義為每分鐘水解1 mg 蛋白質(zhì)產(chǎn)生1 μmol 鳥氨酸所需的酶量（OTC）為1 個酶活單位。

1.6 重組鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶最適溫度的測定 將酶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入底物，分別置于25，35，45，55，65，75 ℃條件下反應(yīng)，測定酶活。

1.6.2 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性的測定 將酶液分別置于4，37，60 ℃中保溫放置0，20，40 min，1，2，3 h 后進(jìn)行反應(yīng)，測定其活性。

1.6.3 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶最適pH 的測定 配制pH 5.5～11.5 的精氨酸底物，加入酶液，反應(yīng)后測定酶活。

1.6.4 NaCl 和乙醇對酶活穩(wěn)定性的影響 將純化得到的酶液在不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù) （0%，2.5%，5%，10%，15%，18%，20%）的緩沖液中保溫1 h，測定酶活，確定NaCl 對酶活穩(wěn)定性的影響。將純化的酶液在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0%，2.5%，5%，10%，15%，18%，20%）的緩沖液中保溫1 h，測定酶活，確定乙醇對酶活穩(wěn)定性的影響。

1.6.5 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的動力學(xué)參數(shù)的測定 酶的米氏常數(shù)Km值，即酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度的二分之一時的底物濃度，是酶的非常重要的動力學(xué)常數(shù)，表示酶與反應(yīng)底物的結(jié)合能力。Km越小，結(jié)合能力越強(qiáng)，反之亦然。在pH 9.5，37 ℃條件下，以精氨酸為底物，分別測定重組ADI 在底物濃度為0.01～1 mol/L 時的反應(yīng)速度，然后將試驗數(shù)據(jù)按Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法作圖，求出酶的Km和Vmax。

2 試驗結(jié)果

2.1 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因序列的測定結(jié)果

將構(gòu)建并鑒定的重組質(zhì)粒交由上海生工生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果該序列與短乳桿菌具有100%的相似性，表明重組鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建成功。

2.2 重組鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的分離純化

見圖2。

2.3 重組鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度 溫度對酶活性的影響表現(xiàn)在兩個方面：一是溫度升高，提高了分子運動速率，從而增加了底物分子與酶蛋白的結(jié)合幾率；二是溫度影響酶蛋白分子的結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度過高時易使蛋白變性失活，降低酶分子的催化效率。綜上，溫度對酶活性的影響是兩個因素綜合作用的結(jié)果。其它反應(yīng)條件相同，在25～75 ℃范圍，間隔10 ℃測定不同溫度下的酶活性，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明，重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的酶活隨溫度的升高而升高，在溫度高于45 ℃后酶活的提高幅度較大，55 ℃時酶活達(dá)到最高值，隨后急速下降。綜上，此OTC 酶的最適反應(yīng)溫度為55℃。

圖2 重組OTCase 純化SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis for the purified recombinant OTCase

圖3 溫度對重組OTCase 活性的影響Fig.3 Effects of temperature on activity of the recombinant OTCase

圖4 不同溫度下鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性Fig.4 Stability of the recombinant OTCase at different temperature

2.4 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性

重組鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶在4 ℃放置3 h后活性差異不大，在37 ℃下放置3 h 仍保持50%以上的生物活性，然而，其在65 ℃下的半衰期僅為10 min，放置40 min 后已檢測不到活性。

2.5 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的最適pH 值

pH 值對酶活性的影響主要是酸性或堿性環(huán)境改變酶的空間結(jié)構(gòu)。在其它反應(yīng)條件相同的前提下，在pH 5.5～11.5 范圍測定酶活性，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶活性隨pH值的變化而變化。當(dāng)pH 5.5～6.5 時，隨著pH 值的升高，酶活性升高，在pH 6.5 時酶活性達(dá)到最高值。當(dāng)pH 高于6.5 后，酶活下降，在pH 11.0時，酶活力僅為最高值的1/6，表明此酶為酸性偏中性酶。

2.6 NaCl 和乙醇對重組鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶活性穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵食品和飲料酒中普遍存在 NaCl 和乙醇，例如醬油中NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%左右，黃酒、葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%～15%?？疾霴TC酶對鹽和乙醇的耐受性，有利于為其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供參考。

圖5 pH 值對重組OTCase 活性的影響Fig.5 Effects of pH on activity of the recombinant OTCase

如圖6可知，OTC 酶的活性隨著乙醇、NaCl濃度的變化而變化。乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時酶活性達(dá)到最高值，隨著乙醇濃度的增加，酶活性也開始降低，但不明顯，這表明該OTC 酶在含酒精的發(fā)酵食品或飲料中具有一定的應(yīng)用潛力。而在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%～5%時，酶活性隨NaCl 濃度的增加而增加，在鹽NaCl 5%時酶活性最高。隨后在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～20%時，酶活性隨NaCl 濃度的增加而降低，NaCl 20%左右時酶活性最低。試驗結(jié)果表明，即使在高鹽濃度的反應(yīng)體系中，OTC 酶活性受到的影響也不大，表明該酶在高濃度鹽的溶液中具有一定的應(yīng)用潛力。

圖6 鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶對乙醇和氯化鈉的耐受性Fig.6 Effects of ethanol and NaCl on OTCase activity

2.7 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的動力學(xué)參數(shù)

以精氨酸為底物，利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法測定重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的米氏常數(shù)。重組酶的Km為1.58 mmol，Vmax為5.88 mmol/min。

3 結(jié)論

以短乳桿菌的基因序列為模板，通過分子克隆手段獲得鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因，以大腸桿菌為宿主進(jìn)行重組表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA 親和層析柱純化獲得重組蛋白，研究其酶學(xué)性質(zhì)。重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶最適溫度為55°C，4 ℃下熱穩(wěn)定性優(yōu)異，37 ℃下放置3 h 仍保持50%以上的生物活性。然而，在65 ℃放置40 min 后已檢測不到酶活性。該酶的最適pH 值為6.5，在pH 值為堿性時，酶活力下降明顯；5% NaCl 和5%乙醇時具有最高酶活性，而整體差異不明顯，說明重組鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶具有良好的耐鹽和酒精耐受力。動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax分別為1.58 mmol 和 5.88 mmol/min。由此可見，來源于短乳桿菌的鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶具有良好的溫度穩(wěn)定性及耐鹽、耐酒精能力，在酒類發(fā)酵中應(yīng)用前景看好。