以何首烏為核心配伍藥對的指紋圖譜建立及多元統(tǒng)計分析

張慧杰 任曉亮 孫浩 王雅琦 梁穎

摘 要 目的：建立何首烏為核心的32個配伍藥對的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并進行多元統(tǒng)計分析。方法：采用UPLC法，以何首烏及配伍藥物的單味飲片為參照，繪制32個何首烏配伍藥對的UPLC指紋圖譜;采用相對保留時間及色譜峰紫外吸收光譜確定共有峰。采用SPSS 19.0軟件和SIMCA 13.0軟件進行無監(jiān)督的主成分分析（PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）。結果：32個何首烏配伍藥對的UPLC圖譜有12個共有峰。無監(jiān)督的PCA分析結果顯示，前6個主成分的累積方差貢獻率為84.633%;PCA綜合評分的聚類分析結果顯示，何首烏單味飲片以及何首烏與枸杞子、熟地黃、白芍、黨參、墨旱蓮、當歸、甘草、黃芪、麥冬的配伍藥對聚為一類，其余聚為一類。有監(jiān)督的OPLS-DA分析結果顯示，4個主成分特征值分別為2.32、2.61、1.58、0.90;在配伍過程中，何首烏與補虛類、非補虛類藥物的12個共有成分含量存在差異，且與補虛藥配伍后的成分含量變化具有相似性;共有峰7、4、6、3是引起差異的主要原因（變量重要性投影值均大于1）。結論：所建指紋圖譜操作簡便，結合多元統(tǒng)計分析可用于評價以何首烏為核心的32個配伍藥對共有成分的含量變化。

關鍵詞 何首烏;配伍藥對;超高效液相色譜法;指紋圖譜;主成分分析;正交偏最小二乘法-判別分析

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2486-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.10

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish UPLC fingerprint of 32 compatible herb pairs with Polygonum multiflorum as the core， and to conduct multivariate statistical analysis. METHODS： UPLC method was adopted. Using P. multiflorum and single decoction pieces of compatible herb as reference， UPLC fingerprints of 32 compatible herb pairs of P. multiflorum were drawn. Common peaks were confirmed by relative retention time and UV absorption spectrum. Non-supervised PCA and supervised OPLS-DA were conducted by using SPSS 19.0 software and SIMCA 13.0 software. RESULTS： There were totally 12 common peaks in UPLC fingerprints of 32 compatible herb pairs of P. multiflorum. The results of non-supervised PCA showed that the accumulative variance contribution rate of primary 6 principal components was 84.633%. The results of cluster analysis of PCA comprehensive score showed that single decoction piece of P. multiflorum， compatible herb pairs of P. multiflorum with Lycium barbarum， Rehmannia glutinosa， Paeonia lactiflora， Codonopsis pilosula， Eclipta prostrate， Angelica sinensis， Glycyrrhiza uralensis， Astragalus membranaceus and Ophiopogon japonicus were clustered into one category; others were clustered into one category. Results of supervised OPLS-DA analysis showed that eigen values of 4 principal components were 2.32， 2.61， 1.58 and 0.90， respectively. There were differences in the contents of 12 common components in the compatibility of P. multiflorum with tonic medicine and non-tonic medicine. The changes of the content of the components after compatibility with tonic medicine were similar. Common peak 7， 4， 6， 3 were main reasons for the differences （variable importance projection value were all higher than 1）.CONCLUSIONS： Established fingerprint is simple in operation， and can be combined with multivariate statistical analysis to evaluate the content changes of common components of 32 compatible herb pairs with P. multiflorum as the core.

KEYWORDS? ?Polygonum multiflorum; Compatible herb pairs; UPLC; Fingerprint; PCA; OPLS-DA

中藥復方是在中醫(yī)理論指導下，依據(jù)“七情”及“君臣佐使”原則，由兩味或兩味以上的中藥配伍而成[1]。復方是中藥臨床應用的主要形式，由于時、地、人、病、癥的不同，中藥組方形式多樣，且配伍而成的化學成分體系十分復雜[2-3]，因此有必要對配伍機理進行深入研究。隨著分析技術的不斷發(fā)展，采用現(xiàn)代研究手段對中藥配伍過程中成分及含量變化進行分析已成為配伍機理研究的重要內容之一，其中指紋圖譜技術及多元統(tǒng)計分析方法已被廣泛應用于中藥多成分分析等領域中[4-5]。

何首烏又名首烏、地精，為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根[6]。該藥始載于北宋《開寶本草》[7]，其炮制品為中醫(yī)臨床常用的滋補名藥，具有補肝腎、益精血、烏髭發(fā)的功效，常與牛膝、當歸、枸杞子、山楂、澤瀉等中藥配伍應用，治療肝腎兩虛、精血不足引起的頭暈眼花、脫發(fā)白發(fā)以及高脂血癥、白癜風等疾病，療效顯著[8]。然而，近年來何首烏所導致的肝毒性引起了學者的廣泛關注。有研究發(fā)現(xiàn)，不同質量的茯苓、甘草、三七與何首烏配伍后，可顯著減輕何首烏對肝竇內皮的損傷作用[9]。這提示，配伍得當可能是減輕何首烏致肝損傷的途徑之一。但若配伍不當亦可導致某些不良反應的發(fā)生，如萊菔子與何首烏同用可引發(fā)頭暈、神志恍惚等癥狀[10]。因此，配伍研究對于保障何首烏的有效性及安全性具有重要意義[8，11]。目前，少見有關首烏配伍研究的報道，且也未見有關何首烏在復方配伍過程中化學成分變化的相關研究。

藥對是指經過臨床應用并被證明行之有效的、具有一定理論依據(jù)的、符合一定組合法度的兩味相對固定的藥物配對，是中醫(yī)臨床遣藥組方常用的配伍形式，其組成簡單且兼具中藥配伍的基本特征[12-13]。本課題組前期對2015年版《中國藥典》（一部）中含有何首烏的61種成方制劑進行數(shù)據(jù)挖掘分析，經Apriori算法關聯(lián)得到36個何首烏藥對，配伍藥物包括32個植物來源中藥以及4個動物來源中藥[14]?；谏鲜鲅芯?，本文擬通過建立32個何首烏配伍藥對（植物來源）的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，同時采用無監(jiān)督的主成分分析（PCA）、有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），評價何首烏與32個配伍藥物在共煎過程中的成分含量變化，旨在為何首烏配伍機理研究和安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY 型UPLC系統(tǒng)，包括二元溶劑管理系統(tǒng)、樣品管理器、二極管陣列檢測器（美國Waters公司）;BT125D型十萬分之一天平（德國Sartorius公司）;JA31002型萬分之一電子天平（上海精天電子儀器有限公司）;KDM型調溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠）;TG16-WS型臺式高速離心機（湖南省湘儀離心機儀器有限公司）;KH3200B型超聲波清洗器（江蘇省昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

何首烏飲片（批號：150802，四川新荷花中藥飲片有限公司）、32個單味飲片均經天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥學部孫浩副主任藥師鑒定分別為蓼科植物何首烏P. multiflorum Thunb.的干燥塊根以及相應藥材的真品。單味飲片信息見表1，藥對配伍信息見表2。甲醇、甲酸均為色譜純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 UPLC指紋圖譜分析

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，5%A;1～5 min，5%A→15%A;5～10 min，15%A→22%A;10～16 min，22%A→45%A）;流速：0.4 mL/min;柱溫：45 ℃;檢測波長：254 nm;進樣量：5 μL。

2.1.2 樣品溶液的制備 分別稱取何首烏飲片、32個單味飲片及32個何首烏配伍藥對樣品（1 ∶ 1，m/m，下同）約10 g，加水200 mL浸泡1 h，回流提取1 h，趁熱以三層紗布濾過，濾液冷卻后，用水定容至200 mL，即得何首烏飲片樣品、32個單味飲片樣品及32個何首烏配伍藥對樣品溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取何首烏飲片樣品4 mL，置于10 mL量瓶中，放至室溫，加入50%甲醇稀釋至刻度，渦旋混勻，以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得何首烏飲片供試品溶液。同法操作制得32個單味飲片及32個何首烏配伍藥對的供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3”項下何首烏飲片供試品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以8號峰（響應較強且峰形好）為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，12個共有峰相對峰面積的RSD均不高于1.52%（n=6），相對保留時間的RSD均不高于1.04%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下何首烏飲片供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以8號峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，12個共有峰相對峰面積的RSD均不高于1.44%（n=6），相對保留時間的RSD均不高于1.15%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取何首烏飲片樣品溶液適量，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以8號峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，12個共有峰相對峰面積的RSD均不高于1.95%（n=6），相對保留時間的RSD均不高于1.79%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.7 UPLC指紋圖譜的建立 取32個何首烏配伍藥對樣品，按“2.1.2”“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以何首烏飲片為參照，32個單味飲片為陰性對照，建立32個何首烏配伍藥對的UPLC指紋圖譜，采用相對保留時間及色譜峰紫外吸收光譜確定共有峰，詳見圖1、圖2。由圖1、圖2可知，32個何首烏配伍藥對中共有12個共有峰。

2.2 PCA

以12個共有峰峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件進行無監(jiān)督的PCA分析，結果見表3。由表3可知，前6個主成分的累積方差貢獻率為84.63%，表明其可反映樣品的基本信息。

2.3 OPLS-DA

“2.2”項下研究結果顯示，大部分與補虛類藥物配伍的何首烏藥對的成分與何首烏飲片相似，提示何首烏與補虛類及非補虛類藥物配伍后其成分變化可能不同。故將32個何首烏配伍藥對分為補虛類與非補虛類兩類，每種藥對樣品平行3次，采用SIMCA 13.0軟件進行有監(jiān)督的OPLS-DA分析。結果顯示，共得到4個主成分，特征值分別為2.32、2.61、1.58、0.90，模型決定系數(shù)（R 2）為0.752、預測優(yōu)度參數(shù)（Q 2）為0.712，均大于0.5，表明所建模型具有良好的識別與預測能力[16]，詳見圖4。由圖4可知，何首烏與補虛類配伍藥對分布在得分圖的左側，何首烏與非補虛類配伍藥對分布在得分圖的右側。這提示，何首烏與補虛類、非補虛類藥物在配伍過程中，12個共有峰對應成分的含量變化存在差異，而何首烏與補虛類藥物配伍后的成分含量變化與何首烏飲片具有相似性。

進一步對樣品的差異性進行整體分析，得到變量重要性投影值（VIP值，VIP值可反映模型擬合的貢獻水平，該值越大表明該變量對結果擬合具有顯著意義）[5]，以VIP值>1[16]為標準篩選造成差異的成分。結果顯示，共得到貢獻相對較大的4個變量色譜峰，VIP值由大到小依次為7、4、6、3號峰，詳見圖5。

3 討論

本研究建立了以何首烏為核心配伍藥對的UPLC指紋圖譜。經方法學驗證，所建方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性均符合中國藥典要求;同時，以何首烏飲片為參照，32個配伍藥對樣品共有12個共有峰。由于配伍藥對樣品較多，需在建立色譜條件方法過程中通過不斷調整梯度洗脫程序來保證32個配伍藥對中何首烏的12個共有峰與其他色譜峰的有效分離。但因部分配伍藥物存在與何首烏相同的化學成分或者結構類型相似的化學成分，而難以通過調整梯度洗脫程序將色譜峰完全分離，若采用指紋圖譜相似度評價軟件進行相似度分析，就會使得有些成分的峰面積存在較大誤差，故本研究未進行相似度分析。此外，對上述未達到基線分離色譜峰的峰面積進行預處理：當何首烏及單味飲片在同一保留時間處均有色譜峰時，以何首烏飲片溶液中該色譜峰峰面積為a，單味飲片溶液中該色譜峰峰面積為b，何首烏與單味飲片配伍藥對溶液中該色譜峰峰面積為c，由于本研究的共有峰均來源于何首烏，假設藥對配伍溶液中該色譜峰峰面積的變化為何首烏中該成分的變化，故該色譜峰的峰面積為c-b，如果該值為負數(shù)，則以0表示。

PCA可對原始數(shù)據(jù)所包含的多個變量（即多指標）進行擬合，以新的低維度變量（即主成分）代替原始高維度變量，進而實現(xiàn)樣本多指標數(shù)據(jù)的降維，體現(xiàn)不同中藥樣品聚類的相似性、中藥樣品與指標間的關聯(lián)信息等[4，17]。PCA結果顯示，何首烏單味飲片以及何首烏與枸杞子、熟地黃、白芍、黨參、墨旱蓮、當歸、甘草、黃芪、麥冬的配伍藥對聚為一類，配伍藥物均為補虛類藥物，提示何首烏與補虛類藥物配伍后的成分含量變化具有相似性。

OPLS-DA可在有監(jiān)督的情況下提取利于樣品分類的變量信息，能較大程度地降低系統(tǒng)噪聲的干擾，提高分類效能，具有較好的樣本分組能力[18]。OPLS-DA結果顯示，何首烏與補虛類、非補虛類藥物在配伍過程中，其成分分散在兩個不同區(qū)域，具有明顯的差異。筆者曾嘗試采用液質聯(lián)用技術對VIP值>1的成分（7、4、6、3號峰）進行鑒定，但4、6號峰對應的成分在正負離子下均無響應，7、3號峰的分子質量分別為406、246，由于試驗條件有限未能獲得二級質譜圖，故暫無法根據(jù)一級質譜推斷其成分結構。雖然8號峰的質譜信息顯示其結構為2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，但該成分的VIP值小于0.5，提示該成分不是引起何首烏與補虛類、非補虛類藥物配伍后含量差異的主要原因。

《神農本草經》中將藥物的配伍關系歸納為“七情”，其中“相須”是指兩種功效類似的藥物配合應用，以增強原有藥物的功效[19]。本研究前期試驗發(fā)現(xiàn)，何首烏多與補虛類藥物“相須”配伍入藥[14]。何首烏與補虛類藥物在“相須”配伍過程中其成分含量變化具有相似性，這為何首烏“相須”配伍機理研究提供了新的思路。此外，本研究中，何首烏與配伍藥材均以質量比1 ∶ 1進行配伍共煎，而臨床實際應用中藥配伍的比例較為多樣。有研究認為，不同比例的何首烏-牛膝配伍對何首烏所含成分的影響有所差異[20]。因此，不同配伍比例下的含量變化規(guī)律還有待后續(xù)研究進一步探討。

綜上所述，所建指紋圖譜操作簡便，結合多元統(tǒng)計分析可用于評價以何首烏為核心的32個配伍藥對共有成分的含量變化。

參考文獻

[ 1 ] 周遠，蘇式兵.中藥復方配伍的研究方法及其進展[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（23）：202-208.

[ 2 ] 羅光芝，季旭明，馬婷，等.基于中醫(yī)傳承輔助平臺分析含黃連-干姜藥對方劑的組方規(guī)律[J].中國藥房，2019，30（1）：99-103.

[ 3 ] 任素劍，林江，丘志良，等.中藥組分配伍與方劑配伍的相關性研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2019，46（4）：711-714.

[ 4 ] 劉娜，李軍，李寶國.多元統(tǒng)計分析在中藥質量控制中的應用和思考[J].中國中藥雜志，2014，39（21）：4268-4271.

[ 5 ] 黃萌萌，王琪，李曉琦，等.基于全-精細指紋圖譜與多元統(tǒng)計分析的梔子炒制前后差異評價[J].中草藥，2020，51（9）：2460-2466.

[ 6 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：175-177.

[ 7 ] 盧多遜，李昉.開寶本草輯復本[M].尚志鈞，輯校.合肥：安徽科學技術出版社，1998：253.

[ 8 ] 吳成勝，孫蓉.何首烏臨床研究進展與安全應用思考[J].中國中藥雜志，2017，42（2）：259-263.

[ 9 ] 龐晶瑤，李雨萌，柏兆方，等.基于高內涵分析的何首烏對肝竇內皮細胞損傷的配伍減毒研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17（4）：331-334.

[10] 蔡新榮.萊菔子與何首烏、熟地配伍致不良反應1例[J].中國中西醫(yī)結合雜志，1996，16（10）：633.

[11] 羅春穎，黃曉婧，史翌川，等.何首烏及其制劑的安全性研究進展及風險因素分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2018，14（1）：53-56.

[12] 唐于平，尚爾鑫，陳艷琰，等.藥對配伍效應與功效物質現(xiàn)代研究方法與策略[J].藥學學報，2019，54（9）：1564- 1573.

[13] 郭玲玲，顏永剛，王紅艷，等.桃仁-大黃藥對在中藥方劑中發(fā)揮功效的相關因素分析[J].中國藥房，2017，28（23）：3188-3191.

[14] 張慧杰，孫浩，安雅婷，等.《中國藥典》成方制劑中何首烏藥對配伍規(guī)律分析[J].中南藥學，2019，17（4）：622-625.

[15] JAYARAMANN U，GUPTA AK. An efficient minutiae based geometric hashing for fingerprint database[J]. Neurocomputing，2014，137（5）：115-126.

[16] 李園，李秀麗，王淑，等.不同淫羊藿羊脂油烘制品的HPLC指紋圖譜建立、多元統(tǒng)計分析及烘制工藝優(yōu)化[J].中國藥房，2020，31（12）：1480-1486.

[17] TRYGG J，WOLD S. Orthogonal projections to latent structures：O-PLS[J]. J Chemometrics，2002（16）：119- 128.

[18] WIKLUND S，JOHANSSON E，SJ?STR?M L，et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds? ? using OPLS class models[J]. Anal Chem，2008，80（1）：115-122.

[19] 孫鑫，錢會南.《神農本草經》中藥理論體系框架研究：上[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（6）：1871-1874.

[20] 孫艷濤，王冰，張明波，等.不同配比何首烏、牛膝藥對指紋共有模式和基于主成分分析的等級評價研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2020，40（5）：510-514.

（收稿日期：2020-05-15 修回日期：2020-09-01）

（編輯：陳 宏）