代謝綜合征血管損傷動物模型的建立與評價

陳 恂，燕曉茹，劉 晶，姚玉璞，張立平

0 引 言

代謝綜合征的核心是肥胖、高血糖、血脂異常和高血壓[1-3]，是心、腦血管病變的病理基礎[4-6]。最新的流行病學調查顯示，我國的代謝綜合征發(fā)病率已上升為33.6%[7]。與此同時，心腦血管疾病的發(fā)病率也隨之成倍增加[8]。因此，研究代謝綜合征早期血管病變對于延緩相關心腦血管病變的發(fā)生發(fā)展至關重要。建立代謝綜合征血管損傷動物模型是實驗研究的基礎。目前，代謝綜合征動物模型的構建大多通過飲食誘導來完成[9-11]，但具體飼料的比例并不統(tǒng)一，缺乏既定的標準。血管損傷模型的構建也可通過飼喂高脂飼料來建立[12]。此外，對于代謝綜合征各組分的研究較多，但對于相關血管內皮功能障礙的研究卻較少。研究發(fā)現(xiàn)，在血糖控制不佳的2型糖尿病患者中，空腹狀態(tài)下血清脂肪酸比健康的非糖尿病患者高出50%，餐后的棕櫚酸水平(主要的飽和脂肪酸之一)幾乎比健康的非糖尿病患者高3倍[13]。棕櫚酸能誘導內皮細胞發(fā)生炎癥反應，介導細胞凋亡[14-15]，參與許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。棕櫚酸作為一種飽和脂肪酸，也常用于制備血管損傷細胞模型[16]。本課題組前期研究證實通過予SD雄性大鼠飼喂自擬高糖高脂高鹽配方飼料能建立代謝綜合征模型[17]，本研究通過改進飼料配方以期建立代謝綜合征血管損傷動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠53只，6～8周齡，體重(200±10)g。來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號： SCXK(京)2016-0006，動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院SPF級動物實驗室中，室內溫度：23～25 ℃，相對濕度(55±10)%，40 W日光燈照射，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜交替光照。隨機數(shù)字表法分為對照組14只，模型組39只，實驗前動物適應性飼養(yǎng)7 d，對照組以全價顆粒飼料喂養(yǎng)，模型組以全價顆粒飼料混合高糖高脂高鹽飼料適應性喂養(yǎng)，自由飲水。實驗中對實驗動物的處理遵循3R原則，并通過北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院倫理委員會審議(倫理審批號：201902)。

1.2實驗試劑與儀器高鹽高脂飼料定制于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料配方為：50%基礎飼料，10%熟豬油，10%蛋黃粉，2%膽固醇，7.5%奶粉，10%果糖，5%棕櫚油，3%食用鹽，2%魚粉，0.5%膽鹽。NO Elisa試劑盒購自美國RD公司(貨號：KGE001)，ET-1 Elisa 試劑盒購自美國RD公司(貨號：DET100)，10 kDa超濾管購自中國GE公司(貨號：Vivaspin 500)，Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：G1340)，油紅o染色液購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：G1260)。大小鼠無創(chuàng)血壓儀(Softron BP-98A)、全自動生化檢測儀(日立 7160)，離心機(Eppendorf Centrifuge 5810R)。

1.3實驗方法

1.3.1 造模及標本采集實驗周期為8周，模型組給予高鹽高脂高糖飼料喂養(yǎng)，對照組給予全價顆粒飼料喂養(yǎng)，2組均自由攝食、飲水。實驗8周末2組按隨機數(shù)表法隨機選擇7只大鼠，禁食不禁水12 h，采用1%戊巴比妥(40 mg/kg)對2組大鼠進行腹腔注射麻醉，沿腹壁正中線逐層切開腹部，于腹主動脈取血，靜置2 h，置于離心機中4 ℃，離心半徑：20.5 cm，轉速：3000 r/min，離心15min，分離上層血清，分裝后于-80 ℃冰箱保存待檢。取血完成后，剪開胸腔，于胸腔后壁仔細剝離胸主動脈，切取約1.0 cm左右的胸主動脈，用冰等滲鹽水沖洗后置于4%多聚甲醛中固定，切取約0.5 cm左右的胸主動脈于凍存管中，直接保存于-80 ℃冰箱中。余大鼠進行后續(xù)實驗。

1.3.2體重、Lee′s指數(shù)及體脂率自造模第1天起每周測量2組大鼠體重。8周末大鼠麻醉后取仰臥位固定于手術臺上，測量鼻尖至肛門距離記為大鼠身長，按公式計算兩組大鼠Lee′s指數(shù)，公式如下：

Lee’s指數(shù)=體重(g)1/3×103/體長(cm)[18]

切取并稱重腎周及睪丸周圍脂肪，按公式體脂率計算兩組大鼠體脂率，共同反應肥胖程度。公式如下：

體脂率=腎周及睪丸周圍脂肪(g)/體重(g)×100%[9]

1.3.3血壓實驗8周末，采用Softron無創(chuàng)血壓計BP-98A進行大鼠尾動脈無創(chuàng)容積血壓測定。測量時，將大鼠放置在鼠袋中，保持38 ℃恒溫，然后將感應器置于大鼠的尾根部，待大鼠處于安靜狀態(tài)下按下開始鍵，讀數(shù)記錄。測定3次，取其平均值作為收縮壓。

1.3.4空腹血糖、血脂水平及血清NO、ET-1全自動生化分析儀測定血清空腹血糖(Glu)、三酰甘油(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)，按照ELISA 試劑盒說明書進行NO、ET-1的測定。

1.3.5血管切片將固定好的血管組織從多聚甲醛中取出，流水過夜后脫水機梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm連續(xù)切片行HE 染色及Masson染色；將-80 ℃冰箱保存的血管組織以4 μm連續(xù)切片，100%異丙醇脫水后行油紅o染色，光鏡下觀察大鼠血管病變情況。

2 結 果

2.1體重、Lee′s指數(shù)和體脂率結果對照組大鼠Lee′s指數(shù)、體脂率和收縮壓均明顯低于模型組(P<0.05),見表1。對照組和模型組大鼠體重均逐漸升高，第3～8周，模型組明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

表 1 對照組和模型組Lee′s指數(shù)、體脂率和收縮壓對比表

2.2空腹血糖、血脂水平和血清NO、ET-18周末，對照組大鼠血清中Glu、CHO、TG、LDLC、ET-1均低于模型組(P<0.01)，而HDLC、NO明顯高于模型組(P<0.01)。見表3。

2.3胸主動脈病理組織學改變結果HE染色結果表明：對照組大鼠胸主動脈血管內膜均一平滑，內皮細胞形態(tài)扁平，排列規(guī)整，中膜未見增厚，血管平滑肌細胞呈長梭形，排列規(guī)整，大小均一，模型組大鼠胸主動脈內膜欠光滑，內皮細胞排列紊亂，可見脫落，中膜明顯增厚，平滑肌細胞肥大，排列不整，細胞核大小不一。Masson染色結果表明：對照組大鼠胸主動脈彈力纖維、膠原纖維排列正常，模型組大鼠胸主動脈彈力纖維明顯減少，且排列紊亂，膠原纖維明顯增多；油紅o染色結果表明：模型組大鼠胸主動脈脂質沉積明顯多于對照組。HE染色(內膜厚度)、Masson染色及油紅O染色陽性面積(膠原纖維和脂滴)發(fā)現(xiàn)，模型組內膜厚度、膠原纖維和脂滴的面積均明顯高出對照組(P<0.01)。見圖1，表4。

表 2 對照組和模型組體重變化比較

表 3 對照組和模型組空腹血糖、血脂水平對比表

圖 1 鏡下觀察對照組和模型組大鼠胸主動脈形態(tài)(×400)

表 4 對照組和模型組胸主動脈內膜厚度和膠原纖維及脂滴面積對比表

3 討 論

代謝綜合征與心腦血管疾病關系密切,可明顯增加心血管疾病的發(fā)病風險[19-20]。內皮細胞功能障礙是心血管事件的始動環(huán)節(jié)，可能導致胰島素抵抗、血脂紊亂、血壓升高等一系列病理改變，從而可能成為代謝綜合征的早期預測因子[21]。對于代謝綜合征的治療，目前尚無統(tǒng)一、確切的治療方案,因此早期干預血管內皮功能損傷,或許將成為延緩代謝綜合征患者動脈粥樣硬化風險及其并發(fā)癥的關鍵[22]。建立合適的動物模型是相關研究開展的基礎，但由于早期代謝綜合征診斷標準不一，這給相應動物模型的構建造成困難。近年來，國內外均頒布了統(tǒng)一的代謝綜合征診斷標準[1,23]，均圍繞肥胖、高血壓、高血糖、血脂紊亂四個代謝綜合征核心成分。診斷標準的制定為動物模型的構建奠定基礎，本研究亦以此評價代謝綜合征建模成功與否。

內皮素1(endothelin-1, ET-1)是一種由21個氨基酸組成，正常生理條件下由血管內皮細胞產生和釋放的內源性血管收縮肽[24]。ET-1的增加是心血管疾病發(fā)生的重要致病因素[25]，可與細胞間黏附因子、炎癥細胞因子一同造成動脈粥樣硬化[26]。新近一宗納入76名患者的橫斷面研究同樣發(fā)現(xiàn)[27]：與非代謝綜合征患者相比，代謝綜合征患者血清ET-1的水平顯著升高(P<0.05)。且ET-1水平升高是血管功能紊亂及血脂異常的獨立危險因素。提示ET-1是評價代謝綜合征血管內皮損傷的指標。NO是一種重要的血管信號分子，在調控血管功能和調節(jié)血腦屏障中起重要作用[28]。其生物活性和/或生物利用度降低是內皮功能障礙的主要原因，也是心血管疾病和2型糖尿病的早期危險因素[29]。新近研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征相關的血管內皮損傷伴隨NO含量降低，通過提高NO的含量，可以改善代謝綜合征血管內皮損傷，提示NO亦是評價代謝綜合征血管內皮損傷的指標[11]。本課題組既往研究以高糖高脂高鹽飼料飼喂SD大鼠8周成功建立代謝綜合征動物模型，并發(fā)現(xiàn)血清炎癥因子(腫瘤壞死因子、白介素-6、核因子κB)及黏附因子(血管細胞粘附分子-1、細胞間黏附分子-1)均升高，提示存在血管損傷可能[17,22]。本次研究在前期研究基礎上，調整飼料配方，加入富含棕櫚酸的棕櫚油，結果發(fā)現(xiàn)模型組39只大鼠，除2只體重不達標(低于對照組平均體重)，2只測量血壓時窒息死亡，余35只均造模成功，模型成功率為89.74%。8周末模型組大鼠較對照組出現(xiàn)明顯的肥胖、高血壓、高血糖和血脂紊亂，滿足代謝綜合征動物模型。在血管損傷方面，模型組大鼠血清NO較對照組明顯降低，ET-1明顯升高；血管病理染色顯示明顯內膜增厚，膠原纖維和脂滴沉積，可見血管損傷明顯，提示造模成功。

研究中應當注意：①動物適口性的問題，當通過逐步替代的方法使實驗動物適應高糖高脂高鹽飼料；②油脂含量高的飼料質地較軟，不適嚙齒類動物啃咬，長期飼喂可能造成牙齒過尖長而不能進食，當提供小木棒幫助磨牙；③高脂飼料容易變質酸化，影響進食，飼料給予當少量多次，保證口感；④基礎飼料和造模飼料中的基礎飼料當保持一致，不同飼料公司提供的基礎飼料可能會有差異。本研究仍存如下問題：①高糖高脂高鹽飼料未能明確各營養(yǎng)組分，不利于今后各營養(yǎng)素和機體代謝關系的研究；②為增加進食量，飼料中的棕櫚油以人造黃油的形式提供，不能排除食品添加劑對研究的影響；③僅動態(tài)觀測體重變化，余指標未能動態(tài)觀測，忽略了實驗時間被縮短的可能。今后研究將進一步明確造模飼料各營養(yǎng)組分的配比情況，優(yōu)化飼料組分，并增加相關指標的觀測時間窗，找尋最優(yōu)飼喂時長，為代謝綜合征血管損傷動物模型的建立提供合適、經濟的方法。代謝綜合征血管損傷動物模型的建立可為相關研究提供支持，有利于早期干預代謝綜合征預防相關心腦血管疾病的研究。