新型冠狀病毒特異性抗體的動態(tài)變化和臨床意義

熊亞莉，徐慶慶，唐 健

0 引 言

自2019年12月以來，國內(nèi)外相繼發(fā)生新型冠狀病毒導(dǎo)致的肺炎，目前已經(jīng)是全球大流行，WHO命名為“2019冠狀病毒病”(COVID-19)。該病原體是一種新的冠狀病毒，被命名為2019嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，簡稱新型冠狀病毒。國家衛(wèi)健委診療規(guī)范第七版[1]之前是將核酸檢測作為確診新型冠狀病毒肺炎的金標(biāo)準(zhǔn)，但核酸檢測存在假陰性，而特異性抗體檢測可以作為核酸檢測的重要補充[2]，目前已被納入確診標(biāo)準(zhǔn)之一[1]。新型冠狀病毒特異性IgM抗體多于發(fā)病3～5 d后開始產(chǎn)生[1]，IgG抗體可在10～15 d產(chǎn)生[3]。但病程中新型冠狀病毒特異性抗體的變化情況尚不清楚。本研究擬探討新型冠狀病毒特異性IgM、IgG抗體的動態(tài)變化特點，并進(jìn)一步明確特異性抗體檢測在新型冠狀病毒肺炎診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2020年2月至3月南京鼓樓醫(yī)院援鄂醫(yī)療隊在華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院光谷院區(qū)收治的59例新型冠狀病毒肺炎的患者。確診標(biāo)準(zhǔn)參見國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》第七版[1]，患者均有臨床流行病學(xué)史，符合3條臨床表現(xiàn)的2條及以上[發(fā)熱和(或)呼吸道癥狀、影像學(xué)顯示雙肺有磨玻璃影或斑片影、發(fā)病早期血常規(guī)白細(xì)胞正常或減低、淋巴細(xì)胞減少或減低]，及病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)之一(實時熒光定量RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性，或血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性，或血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性，或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高)。

1.2 檢測方案入院時每例患者行特異性IgM、IgG抗體檢測以及咽拭子新型冠狀病毒核酸檢測。IgM抗體或核酸檢測陽性者，1周后復(fù)查，直至IgM抗體轉(zhuǎn)陰或核酸兩次以上陰性出院時為止。另予檢測血常規(guī)、生化全套(肝功能、血脂、空腹血糖、腎功能、尿酸、乳酸脫氫酶等)、淀粉酶、肌酸激酶、肌鈣蛋白I、凝血五項(凝血酶原時間、活化凝血酶原時間、纖維蛋白原、凝血酶時間、D-二聚體)、淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子譜、胸部CT等，根據(jù)結(jié)果定期復(fù)查。

1.3 試劑新型冠狀病毒特異性IgM及IgG抗體定量檢測：空腹采血，采用深圳亞輝龍生物科技有限公司的新型冠狀病毒2019-nCoV抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測(化學(xué)發(fā)光法，批號：20200206)，正常值參考范圍為≤10U/mL。新型冠狀病毒ORF1ab/N基因雙重核酸檢測：采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的新型冠狀病毒檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增分析(熒光定量RT-PCR法)。

2 結(jié) 果

2.1患者臨床特征及入院時實驗室檢查59例患者入院時平均病程(3.81±2.2)周。合并癥中最常見的是高血壓病，其次是腦梗死、糖尿病及冠心病。60%以上患者起病有發(fā)熱或咳嗽癥狀。見表1。血常規(guī)中淋巴細(xì)胞減少最常見。淋巴細(xì)胞亞群分析顯示約25%患者CD4、CD8、NK細(xì)胞數(shù)量降低，而B細(xì)胞數(shù)量降低相對少見。5%～39%患者并發(fā)肝、腎、胰腺、心肌、凝血等器官系統(tǒng)功能損害。見表2。

2.2新型冠狀病毒特異性抗體及核酸檢測的敏感性分析59例患者住院期間抗體和核酸檢測分別為107人次、148人次。9例(15.3%)患者入院前后連續(xù)3次以上新冠病毒核酸檢測均呈陰性，但入院后特異性IgG抗體均呈陽性，其中7例(11.9%)患者IgM抗體同時呈陽性；且另有2例患者核酸檢測陽性，IgM、IgG抗體卻均呈陰性。核酸檢測敏感性為84.74%(50/59)，IgG抗體檢測敏感性為96.61%( 57/59)，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.065)。見表3。

表 1 本組新型冠狀病毒肺炎患者的臨床特征

表 2 新型冠狀病毒肺炎患者入院時的異常實驗室指標(biāo)

表 3 新型冠狀病毒特異性IgM、IgG抗體與核酸檢測陽性結(jié)果比較(n)

2.3新型冠狀病毒特異性抗體及核酸動態(tài)變化

2.3.1 新型冠狀病毒特異性抗體及核酸檢測標(biāo)本每周陽性率148人次新型冠狀病毒核酸檢測中，最早病程第2周即有檢測呈陰性者，最晚第8周時仍有1例次呈陽性。107人次新冠病毒特異性抗體檢測中，2例患者共3人次IgM、IgG檢測均呈陰性，分別處于病程第4、6和7周。IgM 抗體檢測最早病程第3周即有1人次呈陰性，最晚第9周時仍有1人次呈陽性。IgG抗體檢測在病程第2-9周中除2例患者3人次外呈陰性外，其余均呈陽性。見圖1。

圖 1 新型冠狀病毒特異性抗體及核酸每周檢測陽性率

2.3.2 新型冠狀病毒特異性抗體滴度變化59例患者病程第2-4周新型冠狀病毒特異性IgM 抗體滴度為32.09(6.87，74.95)U/mL，第5-6周為29.72(11.39，56.62)U/mL，第7-9周為13.8(6.89，27.76)U/mL，僅第5-6周與第7-9周IgM 抗體滴度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。第2-4周新型冠狀病毒特異性IgG抗體滴度為102.66(61.33，202.56)U/mL，第5-6周為158.80(95.40，208.76)U/mL，第7-9周為88.35(75.70，104.29)U/mL，僅第5-6周與第7-9周IgG 抗體滴度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。見圖2。

2.3.3 新型冠狀病毒特異性抗體及核酸檢測轉(zhuǎn)陰時間在住院期間的連續(xù)檢測中，37例(62.7%)患者新型冠狀病毒核酸由陽性轉(zhuǎn)為陰性，轉(zhuǎn)陰時間為病程(5.76±1.95)周；15例(25.4%)患者新型冠狀病毒特異性IgM抗體發(fā)生轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰時間為病程(6.73±1.48)周；無患者在9周病程內(nèi)發(fā)生新型冠狀病毒特異性IgG抗體轉(zhuǎn)陰。

2.4新型冠狀病毒特異性IgM抗體及核酸轉(zhuǎn)陰的影響因素單因素分析顯示CD4細(xì)胞計數(shù)減低(P=0.047)、IL-2R水平增高(P=0.025)與IgM抗體轉(zhuǎn)陰相關(guān)。多因素分析顯示CD4細(xì)胞計數(shù)減低(HR：3.541， 95%CI：1.014～12.364)、IL-2R水平增高(HR ：5.450，95%CI：1.048～28.340)是IgM抗體轉(zhuǎn)陰的影響因素(P<0.05)。見表4。

*P<0.05

表 4 新型冠狀病毒特異性IgM抗體轉(zhuǎn)陰的影響因素分析

3 討 論

特異性抗體的檢測是目前很多感染性疾病的常規(guī)診斷方法，如果患者體內(nèi)存在類風(fēng)濕因子、自身抗體等可以導(dǎo)致抗體檢測出現(xiàn)假陽性可能[4]，但目前研究顯示新型冠狀病毒特異性IgM、IgG抗體檢測的特異性相對較高，為90%～96%[5-7]。本研究中存在9例核酸檢測陰性、特異性抗體檢測陽性的患者，這部分患者流行病學(xué)及臨床特征均符合新型冠狀病毒肺炎的疑似診斷標(biāo)準(zhǔn)，且特異性抗體滴度有動態(tài)變化，故考慮抗體檢測為假陽性可能極小。對于疑似患者，尤其是核酸反復(fù)檢測呈陰性者，特異性IgM、IgG抗體應(yīng)該作為常規(guī)檢測方法之一，這樣能減少因病毒載量極低或采樣所致的核酸檢測假陰性帶來的漏診。由于操作或標(biāo)本保存問題，抗體檢測也存在假陰性可能，文獻(xiàn)報道新型冠狀病毒特異性抗體檢測的敏感性為85%～92%[5-7]。臨床研究和專家共識顯示化學(xué)發(fā)光法靈敏度高于膠體金法，具有操作方便、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[8-9]。本研究顯示2例患者多次核酸檢測呈陽性，結(jié)合流行病學(xué)及臨床特征均符合新型冠狀病毒肺炎的確診標(biāo)準(zhǔn)，而IgM、IgG抗體定量檢測均為陰性，檢測時間分別為病程的第4周及第6-7周，據(jù)文獻(xiàn)報道新型冠狀病毒特異性IgM抗體檢測的窗口期可能為8 d左右，這2例患者已過窗口期，故考慮檢測結(jié)果陰性非病程所致[5]。但即使如此，本研究顯示聯(lián)合IgM、IgG抗體檢測敏感性仍可達(dá)96.61%?？梢?，新冠病毒特異性IgM、IgG抗體定量檢測可以作為一項很好的診斷指標(biāo)，對于新型冠狀病毒感染疑似患者的確診以及無癥狀感染者的篩查具有重要意義[10]。由于存在“窗口期”，抗體檢測可能出現(xiàn)“假陰性”，由于交叉反應(yīng)、內(nèi)源性或外源性干擾物的影響，導(dǎo)致“假陽性”結(jié)果，因此強(qiáng)調(diào)多次動態(tài)檢測抗體以提高診斷的準(zhǔn)確性[11]。

有文獻(xiàn)報道，在病程15～30 d時新型冠狀病毒特異性IgM抗體檢測陽性率最高，病程15 d后、出院后14 d與病程7 d以內(nèi)的IgM抗體水平相比有統(tǒng)計學(xué)差異[5]。另有文獻(xiàn)報道，IgM抗體8 d后陽性率達(dá)100%，28 d后IgM抗體開始消失[6]，但尚少有IgM抗體在病程4周以后滴度的變化以及轉(zhuǎn)陰情況的報道。本研究顯示病程第3周及第5周時IgM抗體檢測陽性率最高，分別為83.33%和76%。第2-4周與第5-6周IgM抗體滴度沒有明顯差別，而第7-9周較第5-6周有明顯下降(P=0.02)，顯示第7周以后IgM抗體滴度下降明顯。本研究沒有發(fā)現(xiàn)IgM滴度的早期峰值，考慮與本研究中患者入院時病程普遍偏晚有關(guān)。但重要的是，本研究動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)15例患者住院期間發(fā)生了IgM抗體的轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰時間在病程的(6.73±1.48)周，故IgM抗體可能可用于起病或隱性感染7周以內(nèi)現(xiàn)癥感染的診斷。IgG抗體滴度在第5-6周高于第2-4周，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這同樣不排除本研究早中期患者樣本量偏少所致。第7-9周滴度較第5-6周明顯下降(P=0.01)，雖然在病程第7周以后IgG抗體滴度也有下降，但病程第9周時滴度仍然明顯高于正常值，且沒有患者在此期間轉(zhuǎn)陰。因此，本研究提示，IgG抗體至少可用于起病或隱性感染9周以上的恢復(fù)期或既往感染的診斷。而IgG抗體持續(xù)陽性的更長時間節(jié)點有待于對患者長期隨訪后確定。本研究初步探討了新型冠狀病毒肺炎病程不同時間段IgM、IgG抗體的變化特點，同其他很多感染性疾病一樣，新型冠狀病毒特異性IgM與IgG抗體滴度也呈升高、下降的動態(tài)變化過程，通過動態(tài)檢測、聯(lián)合檢測能有助于判斷患者病程階段。

既往在SARS中研究顯示，患者病情越重，病毒特異性抗體滴度越高，高峰期延遲[12]。新型冠狀病毒肺炎特異性抗體變化特點尚不完全清楚，其轉(zhuǎn)陰影響因素亦未見報道。目前認(rèn)為，新型冠狀病毒肺炎后期病情的惡化可能是病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子風(fēng)暴所致[13]。研究表明，患者CD4+T、CD8+T細(xì)胞活化增加、數(shù)量減少，同時B細(xì)胞減少，DC細(xì)胞和B細(xì)胞活化亦減少。CD4+T細(xì)胞功能的代償性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致了細(xì)胞因子風(fēng)暴[14]。免疫活化時，CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD25，可溶性CD25(也即是IL-2R)釋放進(jìn)入血流，因此IL-2R水平體現(xiàn)了CD4+T細(xì)胞的活化程度。隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平顯著增加，IL-2R的濃度與IL-6、TNF-α呈正相關(guān)，與淋巴細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān)，IL-2R與淋巴細(xì)胞數(shù)量的比值能預(yù)測患者預(yù)后[15]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-2R是IgM抗體轉(zhuǎn)陰的獨立影響因素，提示患者IL-2R水平越高，IgM抗體轉(zhuǎn)陰時間可能越長。IL-2R升高與IgM抗體陰轉(zhuǎn)之間的相關(guān)性體現(xiàn)了機(jī)體細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng)之間的某種關(guān)聯(lián)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究中，B細(xì)胞數(shù)量與新型冠狀病毒IgM抗體轉(zhuǎn)陰之間沒有發(fā)現(xiàn)明確相關(guān)性。但由于本研究病例數(shù)較少，尚有待于擴(kuò)大樣本數(shù)量驗證上述結(jié)論，同時也有必要進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究明確新型冠狀病毒對機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的影響。

綜上所述，本研究明確了病毒特異性IgM、IgG抗體檢測對于新型冠狀病毒肺炎的診斷、尤其是核酸陰性患者的診斷具有重要價值，通過對病程中IgM、IgG抗體滴度的變化特點、IgM抗體轉(zhuǎn)陰時間的分析，提示特異性IgM、IgG抗體滴度的動態(tài)變化可能有助于病程判斷，而IgG抗體留存時間較長，對于至少9周以上的感染者、尤其是無癥狀既往感染者具有診斷價值。但本研究也存在一些缺陷，如納入樣本數(shù)不多、檢測時間點不完全統(tǒng)一、觀察到轉(zhuǎn)陰的病例數(shù)較少、缺乏長期隨訪結(jié)果等，有待于今后進(jìn)一步完善和通過其他研究進(jìn)行驗證。