一株芘降解菌的分離鑒定

呂亞輝，黃友良 ，陳澤雄，李嘉琳，黃澤民，黃賽花*，吉喜燕

1.廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所/華南土壤污染控制與修復(fù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650；2.廣東益地農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東 廣州 510000；3.佛岡沃土農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511699；4.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是煤、石油、木材、煙草、有機(jī)高分子化合物等有機(jī)物不完全燃燒產(chǎn)生的揮發(fā)性碳?xì)浠衔?，是環(huán)境中重要的持久性有機(jī)污染物（Gbeddy et al.，2020；Yin et al.，2018），含有兩個(gè)或以上的閉合苯環(huán)，具有強(qiáng)疏水性、高脂溶性、難降解性等特點(diǎn)，容易在土壤中大量累積，造成嚴(yán)重污染（Wang et al.，2020；Vagge et al.，2018），PAHs污染土壤的修復(fù)已經(jīng)成為亟待解決的重要環(huán)境科學(xué)問(wèn)題。

微生物修復(fù)以高效、價(jià)廉、環(huán)境友好、無(wú)二次污染等特點(diǎn)，受到一致肯定（Yang et al.，2020；Li et al.，2019）。目前能降解雙環(huán)或三環(huán)的PAHs降解菌主要有：氣單胞菌（Aeromonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia）等多種細(xì)菌和白腐真菌（whiterotfungi）。一般地，降解四環(huán)及以上的高環(huán) PAHs的細(xì)菌主要集中在Mycobacterium（分支桿菌屬）、Rhodococcus（紅球菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）這3個(gè)屬，而降解高環(huán) PAHs的真菌，報(bào)道較多的是白腐真菌（Canet et al.，2001）。白腐真菌因?yàn)槠鋸?qiáng)大的木素降解酶系具有強(qiáng)大的氧化能力和底物無(wú)特異性等特點(diǎn)而受到一致關(guān)注（班巧英等，2020）。有研究發(fā)現(xiàn)菲、蒽和熒蒽在初始質(zhì)量濃度為 5 mg·L-1和 10 mg·L-1時(shí)白腐真菌乳白耙齒菌F17（Irpexlacteus）降解率分別達(dá)93%、85%和73%以上（劉俊，2019）。并且真菌特有的菌絲結(jié)構(gòu)可穿透土壤顆粒，與土壤緊密裹抱在一起，從而增大與PAHs接觸的面積，改變PAHs的生物可及性而提高其降解效率。所以充分利用土壤降解真菌的修復(fù)功能，是一類低耗高效和環(huán)境安全的生物修復(fù)技術(shù)（伍鳳姬等，2014；張燦燦等，2020），而篩選、分離高效降解PAHs的真菌菌株則是該項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不但能擴(kuò)充PAHs降解霉種庫(kù)，還能為PAHs污染的生物修復(fù)提供資源。

芘（Pyrene）是含有4個(gè)苯環(huán)、高度對(duì)稱的稠環(huán)芳烯，常被作為PAHs污染的指示物和降解的研究對(duì)象（Ren et al.，2016；Liu et al.，2020）。本論文以芘為污染研究對(duì)象，采集施用蚯蚓糞的土壤，利用芘從低濃度到高濃度連續(xù)馴化20 d后，從中篩選分離并鑒定芘降解霉菌，并以黃胞原毛平革菌（Panerochaetechrysosporium）為參照對(duì)比其降解率，以其為PAHs污染的生物修復(fù)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

顯微鏡，分光光度計(jì)北京普析UV-2000，恒溫培養(yǎng)搖床HZC-250，生化培養(yǎng)箱LRH-250-A，色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津GCMAS QP2010 Plus）等。

1.2 培養(yǎng)基配方

PDA培養(yǎng)基：土豆浸出物 200.00 g·L-1，葡萄糖 20.00 g·L-1，瓊脂 15.00 g·L-1。

液體培養(yǎng)液：在Tien et al.（1988）的配方的基礎(chǔ)上稍加改良：其中用質(zhì)量濃度為 0.02 mol·L-1的乙酸緩沖液（pH=4.4）代替丁二酸二甲酯緩沖液。其中葡萄糖10.00 g·L-1，KH2PO42.00 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.25 g·L-1，CaCl20.10 g·L-1，酒石酸銨0.50 g·L-1（C4H12N2O6），微量元素 10.00 mL·L-1，微量元素的組成（L-1）：

MnSO40.50 g，NaCl 1.00 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.10 g，COCl20.10 g，ZnSO4·7H2O 0.10 g，CuSO40.10 g，AlK(SO4)212H2O 0.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g。

接種前無(wú)菌過(guò)濾加入維生素B1（VB1）溶液，使得最終VB1的質(zhì)量濃度為5.00 mg·L-1。

無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：在上述液體培養(yǎng)液中添加15.00 g·L-1的瓊脂即可。

察氏培養(yǎng)基配方：蔗糖30.00 g·L-1，NaNO33.00 g·L-1，K2HPO41.00 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.50 g·L-1，KCl 0.50 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g·L-1，15.00 g·L-1瓊脂。

麥芽汁培養(yǎng)基配方：20.00 g·L-1麥芽浸膏，1.00 g·L-1蛋白胨，20.00 g·L-1葡萄糖，15.00 g·L-1瓊脂。

察氏酵母培養(yǎng)基配方：K2HPO41.00 g·L-1，查氏濃縮液 10.00 ml·L-1，酵母抽提物 5.00 g·L-1，蔗糖 30.00 g·L-1，15.00 g·L-1瓊脂。

1.3 試劑和對(duì)照菌株

所有藥品均為常用無(wú)機(jī)及有機(jī)生化試劑，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，全部為分析純；P.chrysosporiumBKM-F-1767（GIM3.383），購(gòu)自廣東省微生物研究所菌種保存中心的凍干粉。

1.4 芘降解菌的馴化

選取以豬糞為原料生產(chǎn)的蚯蚓糞（由佛岡沃土農(nóng)業(yè)科技有限公司提供），施入土壤2 d后取樣約500 g，含水量約50%，將其平攤于托盤(pán)中，均勻噴施芘的丙酮溶液20 mL，攪拌均勻后，在通風(fēng)廚放置2—3 h以便丙酮揮發(fā)干凈后，生化培養(yǎng)箱28 ℃避光培養(yǎng)，連續(xù)馴化20 d。芘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和噴施時(shí)間：第 1天 25 mg·kg-1，第 4天 50 mg·kg-1，第 8天100 mg·kg-1，第 15 天 200 mg·kg-1。

1.5 分離

稱取已馴化好的蚯蚓糞土壤10.00 g，放入90.0 mL無(wú)菌水中，搖床振蕩15 min后，放置30 s后，取0.10 mL涂布到無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，然后用升華法在培養(yǎng)基上形成芘膜，28 ℃遮光培養(yǎng)，選取芘膜平板上周圍有透明圈、生長(zhǎng)良好的真菌用PDA培養(yǎng)基平板畫(huà)線，多次純化后的菌種斜面保存，并做進(jìn)一步的鑒定和芘降解能力的測(cè)定。

芘膜成膜方法：把接種后的平板倒扣到底部平鋪有固體芘的燒杯上，并用封口膜將接口處封嚴(yán)，將燒杯底部放到電爐上稍加熱，在平板上方放置冰塊，使芘升華后遇平板冷卻而附著在固體培養(yǎng)基上（圖1）。

1.6 鑒定

1.6.1 平板觀察

制作察氏、察氏酵母、麥芽汁培養(yǎng)基平板，利用滅菌接種針蘸取少量的孢子，點(diǎn)植于平板的中央點(diǎn)位置，25 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落的生長(zhǎng)特征。

1.6.2 顯微觀察

于載玻片上點(diǎn)滴生理鹽水1滴，用解剖針挑取少許孢子均勻分散涂抹于生理鹽水中，于顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.6.3 分子鑒定

提取菌絲 DNA，利用 ITS1通用引物（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′） 和 ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增ITS序列，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化和克隆，送由上海生物工程公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件去除載體后，把所得的ITS rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Blast工具進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)同源率。

1.7 芘降解能力測(cè)定

1.7.1 一級(jí)種子的制取

選取在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7—10 d的真菌孢子，用無(wú)菌勺輕輕刮下平板表面的孢子，置于含有 100 mL無(wú)菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液的三角瓶中，160 r·min-1，28 ℃培養(yǎng)3—5 d，待孢子球長(zhǎng)至直徑約2 mm左右，即將進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，備用。此為一級(jí)種子。

圖1 芘膜成膜前后的對(duì)比Fig.1 Photos showing before and after the formation of a pyrene film on the plate

1.7.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取50 mL三角瓶，除空白外每瓶接入5 mL一級(jí)種子（5 mL一級(jí)種子的菌絲干質(zhì)量0.0112 g），液體培養(yǎng)基20 mL，加入芘的甲醇溶液（甲醇的加入量很少，對(duì)菌絲的影響可忽略不計(jì)），約5 mg·L-1左右，以 GCMAS上機(jī)檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)（回收率為87.7%—91.2%），置搖床上28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)，并在接種的第0、8、14、23、30天取樣，每次取3個(gè)平行，以相同體積芘的甲醇溶液的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。取樣后用濾紙和燒杯過(guò)濾菌絲球，并用丙酮5 mL分兩次洗滌濾紙和菌絲球，濾紙及其菌絲球一并轉(zhuǎn)入已稱至恒質(zhì)量的燒杯中；80 ℃烘至恒質(zhì)量，測(cè)量菌絲干質(zhì)量；濾液用于測(cè)定芘的濃度。

1.7.3 芘的測(cè)定

濾液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用6 mL環(huán)己烷洗滌燒杯，洗滌液一并加入分液漏斗中，振搖萃取2 min，靜置分層；用25 mL的容量瓶收集上層環(huán)己烷并加入10 g烘干的無(wú)水硫酸鈉去除多余的水分，下層水相依照以上方法用環(huán)己烷反復(fù)萃取3次，收集的環(huán)己烷定容至25 mL，搖勻。移取1 mL至2 mL的密封棕色瓶中，加內(nèi)標(biāo)10 μL六甲基苯和10 μL氘代芘，利用GCMAS對(duì)有機(jī)相中的芘含量進(jìn)行測(cè)定，平均回收率為89.4%。

色譜條件：進(jìn)樣口無(wú)分流模式，進(jìn)樣口溫度為270 ℃；色譜柱型號(hào)為DB-5彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱流量 1.65 mL·min-1；爐溫55 ℃保持1 min，以25 ℃·min-1升至200 ℃，再以10 ℃·min-1升至240 ℃保持0.5 min，最后以30 ℃·min-1升至280 ℃，并保持2 min。

芘去除率=(芘初始質(zhì)量濃度-芘剩余質(zhì)量濃度)/芘初始質(zhì)量濃度×100%。

統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 20。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)特征和孢子特征

霉菌在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌絲蔓延呈稀薄絮狀，菌落白色，毛狀，反面無(wú)色（圖2a）；在察氏酵母培養(yǎng)基上呈毛絮狀，菌落生長(zhǎng)比在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，菌絲呈白色偏淡黃色，5 d生長(zhǎng)高度離培養(yǎng)皿蓋很近，分生孢子囊后期呈白色（圖2b）；在麥芽汁培養(yǎng)基上呈毛狀，淡黃色，比在察氏酵母培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更旺盛，菌絲也更濃密，反面淡黃色，5 d菌絲生長(zhǎng)高度能觸碰到皿蓋，與平板結(jié)構(gòu)緊密，用接種針或玻棒很難挑起菌絲，觸碰即匍匐倒下，與平板連接緊密（圖2c）；分生孢子囊后期呈黃色，孢子囊梗直接由菌絲體生出，單軸式總狀分枝，孢子囊著生在囊梗上，孢子球形、圓形、橢圓形（圖2d）。

2.2 測(cè)序結(jié)果

該菌的 ITS序列共 612 bp，與卷枝毛霉菌（Mucorcircinelloides）的同源性達(dá)99.3%，其培養(yǎng)特征及顯微特征與卷枝毛霉菌（M.circinelloides）最相似，命名為M.circinelloidesH3。菌種已經(jīng)交由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）保藏并已向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局申請(qǐng)了專利，保藏號(hào)是11578，專利號(hào)是ZL201511033977.4。

圖2 真菌的培養(yǎng)特征和孢子的形狀Fig.2 Colony and spore morphologies of H3.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

采用 MEGA及 ClustalX1.38等分析軟件對(duì)序列進(jìn)行同源性分析，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，圖3是M.circinelloidesH3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.4 M.circinelloides H3對(duì)芘的去除率

以未接種菌種的芘液體培養(yǎng)液為空白對(duì)照，比較了M.circinelloidesH3和P.chrysosporium在30 d之內(nèi)的芘降解能力（圖4a、b），從圖4a可以看出，H3在 8 d時(shí)芘的去除率為 74.5%，比P.chrysosporium的64.9%高了9.6%；14 d去除率為93.6%，比P.chrysosporium高了38.0%；23 d去除率為94.1%，比P.chrysosporium高了26.3%；30 d去除率為96.0%，比P.chrysosporium高了22.6%。P.chrysosporium因能分泌特殊的木質(zhì)素降解酶而具有強(qiáng)大的降解 PAHs的能力（Li et al.，2018；Voberkova et al.，2018；Huang et al.，2020），但在本實(shí)驗(yàn)中同一實(shí)驗(yàn)條件下分離菌M.circinelloidesH3比P.chrysosporium具有更高的去除率。這可能是，（1）卷枝毛霉將芘轉(zhuǎn)化為脂肪酸。卷枝毛霉是常見(jiàn)的產(chǎn)油微生物，大部分的微生物都不能在其細(xì)胞內(nèi)積累超過(guò)自身干質(zhì)量20%的油脂，而產(chǎn)油微生物卻能積累20%—80%的油脂，其產(chǎn)油機(jī)制是在具有充足的芘作為碳源，而其他營(yíng)養(yǎng)元素（氮、磷、硫等）缺乏時(shí)，微生物不再進(jìn)行細(xì)胞繁殖，而是將過(guò)量的碳源轉(zhuǎn)化為脂肪酸儲(chǔ)存于細(xì)胞體內(nèi)（Wu et al.，2010，2011）。（2）卷枝毛霉產(chǎn)生油脂增溶芘，提高降解效率。由于油脂和芘具有相似的結(jié)構(gòu)，二者“相似相溶”，油脂產(chǎn)生了類似于表面活性劑的作用，促進(jìn)了芘的溶解，提高了酶促轉(zhuǎn)化效率（許學(xué)峰等，2018）。至于酶的具體降解機(jī)理，有待進(jìn)一步的研究。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of M.circinelloides H3

圖4 M.circinelloides H3對(duì)芘的去除率和菌絲干質(zhì)量變化曲線Fig.4 Pyrene removal by M.circinelloides H3

統(tǒng)計(jì)分析顯示H3的芘濃度和菌絲生長(zhǎng)量顯著相關(guān)（P=0.008，P＜0.05），從圖4b可以看出，M.circinelloidesH3在培養(yǎng)的0—8 d，菌絲增長(zhǎng)緩慢，推測(cè)培養(yǎng)液中的較高濃度的芘對(duì)菌絲生長(zhǎng)存在抑制作用；8—14 d，M.circinelloidesH3和P.chrysosporium的菌絲均進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，并于第23天分別達(dá)到菌絲干質(zhì)量最大值0.0743、0.0786 g，表明此時(shí)菌絲已經(jīng)適應(yīng)了環(huán)境中芘的濃度，且伴隨著菌絲的快速生長(zhǎng)帶來(lái)芘濃度的快速下降；30 d的菌絲干質(zhì)量比23 d又下降，這是培養(yǎng)后期菌絲產(chǎn)生自溶所致。從圖4a可以看出，P.chrysosporium在第14天比第8天的芘濃度還高，由于8 d前芘的去除主要以生物吸附為主，且菌絲達(dá)到最大吸附量，8—14 d發(fā)生生物解吸，且生物解吸量大于生物吸附量，導(dǎo)致溶液中芘濃度的上升；而在推測(cè)23—30 dP.chrysosporium應(yīng)該產(chǎn)生了降解酶，其對(duì)芘的降解量大于解吸量，因此去除率較高。但是M.circinelloidesH3由于其具有儲(chǔ)存和產(chǎn)生油脂的作用，具有增溶芘的作用，從而加快芘的降解，導(dǎo)致對(duì)芘的消耗量大于解吸量，使芘溶液一直處于下降階段，因此，對(duì)芘的去除率顯著高于P.chrysosporium。

據(jù)報(bào)道，Agrawal et al.（2017）研究Coriolopsis byrsinastrain APC5降解芘中，當(dāng)初始質(zhì)量濃度為20 mg·L-1，培養(yǎng) 18 d降解率為 96.1%；Mycobacteriumspp.PO1和PO2降解初始質(zhì)量濃度為 100 mg·L-1時(shí)；6 d降解率達(dá)到了 100 %（Wanapaisan，2018）；KlebsiellapneumoniaPL1在降解芘初始質(zhì)量濃度為 20 mg·L-1，10 d降解率為63.4%（Ping et al.，2014）；Bacilluscereus降解50 mg·L-1時(shí)，21 d降解率達(dá)到了 65.8%（蔡麗希，2018）。本研究M.circinelloidesH3降解芘初始質(zhì)量濃度為 5.00 mg·L-1，搖床培養(yǎng) 30 d降解率為96.0%，由于培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件的不同，其降解率差異較大。本去除實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)液是根據(jù)Tien的培養(yǎng)液改良而來(lái)，pH為4.4，是P.chrysosporium的最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)液，但M.circinelloidesH3在該培養(yǎng)液中菌絲干質(zhì)量和降解率都比P.chrysosporium高。事實(shí)上，卷枝毛霉在環(huán)境pH為5—8時(shí)都能很好地適應(yīng)（昝新藝，2019）。所以，進(jìn)一步研究M.circinelloidesH3，發(fā)揮其在疏水類環(huán)境有機(jī)污染物的修復(fù)方面的積極作用，就顯得意義尤為重大。

3 結(jié)論

通過(guò)馴化從蚯蚓糞土壤里分離出一株芘降解真菌，采用平板觀察、顯微鏡檢和分子比對(duì)等手段發(fā)現(xiàn)，該菌的培養(yǎng)特征及顯微特征與M.circinelloides最相似，ITS序列與M.circinelloides的同源性達(dá)99.3%，鑒定該菌為卷枝毛霉，命名為M.circinelloidesH3。該菌30 d對(duì)芘的降解率達(dá)到96.0%，且能在pH 4.4的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好，是一株有巨大應(yīng)用潛力的霉菌。