紫檀芪對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

彭艷芳 張瑩雯 張亞兵

摘要 目的：觀察紫檀芪（Pterostilbene，PTE）對博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化進(jìn)程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的抑制作用及其可能機(jī)制。方法：選取40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常組、模型組、紫檀芪組及潑尼松組。除正常組外，其余組采用氣管內(nèi)注射博來霉素溶液制備大鼠肺纖維化模型。紫檀芪組給予30 mg/（kg·d）紫檀芪溶液灌胃，潑尼松組給予3 mg/（kg·d）潑尼松溶液灌胃，正常組和模型組予以等量DMSO溶劑灌胃，連續(xù)21 d。取肺組織行天狼猩紅染色觀察大鼠肺組織中Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）的分布情況;免疫組化和PCR檢測大鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、上皮細(xì)胞鈣連蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)。結(jié)果：與正常組比較，模型組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的分布均增多，Vimentin、α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)升高，E-cadherin蛋白和mRNA的表達(dá)下降。與模型組比較，藥物組Ⅰ、Ⅲ型膠原的分布均減少，同時上調(diào)E-cadherin的mRNA及蛋白表達(dá)水平，抑制α-SMA、Vimentin的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：紫檀芪能有效緩解肺纖維化大鼠的纖維化進(jìn)程，其機(jī)制可能與抑制膠原形成以及調(diào)控EMT相關(guān)分子的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 紫檀芪;Ⅰ、Ⅲ型膠原;肺纖維化;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;細(xì)胞外基質(zhì)

Abstract Objective：To observe the inhibitory effects of Pterostilbene（PTE）on Epithelial-to-mesenchymal transition（EMT）in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats and its possible mechanism.Methods：A total of 40 SD rats were randomly divided into 4 groups：a normal group，a model group，a PTE group and a prednisone group.Except for the normal group，the rat pulmonary fibrosis model was prepared by intratracheal injection of bleomycin solution.30 mg/（kg·d）of PTE was given to the PTE group，3 mg/（kg·d）of prednisone was given to the prednisone group，and the normal group and the model group were given the same amount of DMSO for 21 days.Take the lung tissue and stain it with Sirius scarlet to observe the distribution of collagen type Ⅰ（Collagen Ⅰ）and collagen type Ⅲ（Collagen Ⅲ）in rat lung tissue.Immunohistochemistry and PCR detected the expression of a-SMA，E-cadherin and Vimentin in rat lung.Results：Compared with normal group，the distribution of Col-Ⅰand Col-Ⅲ in the model group were increasing.Vimentin，a-SMA higher protein and mRNA expression were rising.The expression of E-cadherin protein and mRNA decreased.Compared with the model group，the distribution of type Ⅰ and type Ⅲ collagen in the drug group was reduced，and at the same time the mRNA of E-cadherin and protein expression levels were up-regulated，and the mRNA of α-SMA、Vimentin and protein expression level were inhibited.Conclusion：PTE can effectively alleviate the fibrosis process of pulmonary fibrosis rats.The mechanism may be related to the inhibition of collagen formation and the regulation of the expression of EMT-related molecules.

Keywords Pterostilbene; Type Ⅰ and Ⅲ collagen; Pulmonary fibrosis; Epithelial-mesenchymal transition; Extracellular matrix

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.004

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是由多種因素導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性間質(zhì)性肺部疾病，病理表現(xiàn)以成纖維細(xì)胞增殖、大量細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）增生并伴炎性損傷、膠原沉積、肺組織結(jié)構(gòu)破壞及重構(gòu)等為特征，臨床表現(xiàn)為活動性呼吸困難、限制性通氣功能障礙、低氧血癥等，最終發(fā)展為呼吸循環(huán)衰竭而死亡，嚴(yán)重危害人類身體健康[1]。吸煙、病毒感染、環(huán)境污染、遺傳易感性和藥物等為常見病因，隨著人口老齡化加劇，加上空氣污染日益嚴(yán)重，其患病率和發(fā)病率不斷上升，盡管近年來我們對PF發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識和治療有了一定的進(jìn)展，但目前尚沒有特效藥物來治療肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化患者及博來霉素引起的鼠肺纖維化模型中均發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)過程中伴有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-to-mesenchymal Transition，EMT），EMT是肺纖維化的關(guān)鍵過程。肺泡上皮細(xì)胞在炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及某些細(xì)胞因子等刺激下逐漸失去緊密連接，向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞積累，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，則發(fā)生EMT[2]，是肌成纖維細(xì)胞的重要來源，在EMT的過程中有許多通路和細(xì)胞因子參與。EMT過程被啟動，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），從而分泌大分子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，例如膠原蛋白、酶等，維持器官發(fā)育，而ECM過度沉積或失調(diào)會出現(xiàn)病理修復(fù)，正常的肺組織結(jié)構(gòu)反復(fù)破壞，進(jìn)一步導(dǎo)致EMT持續(xù)發(fā)生，最終出現(xiàn)組織器官的纖維化[3]，因此EMT在肺纖維化形成中起關(guān)鍵作用。

隨著對PF研究的深入，中醫(yī)中藥表現(xiàn)出突出的的特點和優(yōu)勢。肺纖維化患者需長期服藥，所以開發(fā)低毒、不良反應(yīng)少、能夠長期服用的抗EMT藥物是肺纖維化藥物研發(fā)的方向。紫檀芪是中藥龍血竭的有效組成成分及存在于紫檀、葡萄、藍(lán)莓等植物的生物活性成分，具有預(yù)防氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗腫瘤、抗炎、抗纖維化等作用，是白藜蘆醇的甲基化衍生物，且具有更高的生物利用度。Gu TT等[4]研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪可延緩果糖誘導(dǎo)的腎纖維化大鼠腎臟纖維化的進(jìn)展，具有抗纖維化作用。本實驗室前期研究證實了紫檀芪明顯抑制博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[5]，但其具體的作用機(jī)制目前尚不明確。目前肺纖維化的發(fā)病機(jī)制典型特征是ECM的過度沉積以及EMT，在EMT過程中有很多因子會發(fā)生改變，其中細(xì)胞外基質(zhì)中主要成分Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原過度蓄積，間充質(zhì)標(biāo)志物如α-SMA、Vimentin等的表達(dá)水平上調(diào)，α-SMA是肺纖維化過程中肌成纖維細(xì)胞的表型標(biāo)志，E-cadherin表達(dá)丟失是EMT最顯著的特征[6-7]。本實驗旨在研究紫檀芪對肺纖維化大鼠的影響及通過紫檀芪作用下EMT目的蛋白E-cadherin、ECM標(biāo)志蛋白α-SMA、Vimentin、Col-I等的調(diào)節(jié)變化來推測紫檀芪在肺纖維化中的可能作用，意在為紫檀芪治療肺纖維化提供新思路。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取健康雄性 SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物 紫檀芪（PET，上海哈靈生物科技有限公司），純度>99%，相對分子質(zhì)量為256.30，分子式C16H16O3），常溫、避光保存，溶于DMSO中。對照藥物：潑尼松片（浙江仙居制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33021207），5 mg/片。

1.1.3 試劑與儀器 博來霉素（日本化藥株式會社，貨號：H20055883）;BSA（牛血清白蛋白）（Roche公司，型號：10735078001）;DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，型號：ZLI-9033）;Vimentin一抗（Abcam公司，貨號：ab20346）;α-SMA一抗（博士德公司，貨號：BM0002）;E-Cadherin一抗（Servicebio公司，貨號：GB12082）;天狼猩紅染液（ASPEN公司，貨號：AS1067）;中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10004160）;TRIpure Total RNA Extraction Reagent（ELK Biotechnology公司，貨號：EP013）;PCR儀（杭州博日科技公司，型號：TC-XP）;熒光定量PCR儀（Life technologies公司，型號：StepOneTM Real-Time PCR System）;倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，型號：IX51）;成像系統(tǒng)（Q-IMAGING公司，型號：MicroPublisher）;病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將大鼠隨機(jī)分為正常組（A組）、模型組（B組）及潑尼松組（C組）、紫檀芪組（D組），每組10只，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。除正常組外，其余3組大鼠參照Szapie等[8]經(jīng)典造模方法誘導(dǎo)PF大鼠模型：大鼠麻醉后仰臥固定于鼠臺上，將鼠頸部皮膚消毒并逐層分離，用1 mL注射器經(jīng)暴露的氣管朝向心端穿刺，注入博來霉素生理鹽水溶液0.2～0.3 mL誘導(dǎo)肺纖維化模型，注射完畢后立即將大鼠直立旋轉(zhuǎn)30 s，盡量使藥液向下流入肺內(nèi)時能夠均勻分布，然后切口局部縫合。正常組以相同方法滴入等體積生理鹽水，待大鼠自然蘇醒后自由進(jìn)食和飲水。

1.2.2 給藥方法 于造模后第2天開始進(jìn)行灌胃給藥，空白組和模型組DMSO溶劑灌胃10 mL/（kg·d），潑尼松組予以潑尼松混懸液3.0 mg/（kg·d），紫檀芪組予以紫檀芪30 mg/（kg·d）給藥，連續(xù)3周。

1.2.3 天狼猩紅染色檢測大鼠肺組織膠原沉積 天狼猩紅是一種陰離子強(qiáng)酸性染料，可與膠原分子特異性結(jié)合而染色，能顯示組織中Ⅰ～Ⅳ型膠原，其染色是顯示肺纖維化時膠原含量變化的一種理想且特異的方法[9]。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，將水洗過的切片入天狼猩紅染液中浸染1 h，片子直接入純乙醇分化脫水，二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化檢測大鼠肺組織Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白的表達(dá) 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、EDTA緩沖液中微波修復(fù)，置于3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育10 min，PBS沖洗，5% BSA封閉20 min去除BSA液，每張切片滴加含鼠α-SMA抗體（1∶400）、鼠E-cadherin抗體（1∶100）、鼠Vimentin抗體（1∶100）的一抗，4 ℃搖床孵育過夜，PBS沖洗，滴加相應(yīng)種屬的二抗（1∶200），37 ℃孵育50 min，PBS洗后加DAB溶液，顯微鏡控制顯色，蘇木素復(fù)染，脫水干燥，透明封固，使用顯微鏡拍照。

1.2.5 RT-PCR檢測大鼠肺組織Vimentin、α-SMA、E-cadherin mRNA的表達(dá) 取大鼠右上肺組織20 mg，于1 mL預(yù)冷的TRIpure中充分研磨勻漿，倒入EP管中加入250 μL三氯甲烷10 min離心，嚴(yán)格按照超純RNA提取試劑盒提取總RNA，配制qRT-PCR反應(yīng)體系。見表1。第一鏈cDNA的合成采用EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行（ELK Biotechnology，EQ003），實時熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTM Real-Time PCR儀上完成，每個樣品均作3個復(fù)孔，使用EnTurboTM SYBR Green PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行（ELK Biotechnology，EQ001）采用2-△△Ct法計算 mRNA表達(dá)量。見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組動物肺纖維化程度改變比較 膠原含量是確定肺纖維化是否發(fā)生及其嚴(yán)重程度的關(guān)鍵指標(biāo)，天狼猩紅染色是膠原較特異性的染色方法，可以在1張切片上同時顯示出Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維及其相互間的關(guān)系。結(jié)果可見正常肺組織中除各級支氣管和血管壁存在較多Ⅰ和Ⅲ型膠原之外，肺泡壁僅有少量膠原存在。模型組肺泡壁可見較多黃色或紅色Ⅰ型膠原及綠色的Ⅲ型細(xì)纖維膠原沉積，Ⅰ型膠原纖維呈緊密排列，為黃色或紅色的纖維，Ⅲ型膠原纖維呈疏網(wǎng)狀，顯示弱的雙折光性，為綠色的細(xì)纖維，大鼠肺組織膠原的面積顯著高于正常組（P<0.01）;經(jīng)紫檀芪干預(yù)治療后Ⅰ型與Ⅲ型膠原面積均較模型組下降（P<0.01）。見圖1，表2。

2.2 4組動物采用免疫組化法檢測Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)的比較 α-SMA蛋白主要表達(dá)于氣管周圍，E-cadherin主要位于肺泡上皮，以棕黃色染色為陽性表達(dá)。與正常組比較，模型組肺泡周圍α-SMA、Vimentin表達(dá)明顯增加，肺組織E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）;與模型組比較，紫檀芪組和潑尼松組E-cadherin表達(dá)增加，α-SMA、Vimentin表達(dá)減少，紫檀芪可抑制模型組誘導(dǎo)的肺組織EMT。見圖2，表3。

2.3 4組動物采用RT-PCR法檢測Vimentin、α-SMA、E-cadherin結(jié)果比較 與正常組比較，模型組Vimentin、α-SMA mRNA水平顯著增高，E-cadherin mRNA水平降低（P<0.01）;與模型組比較，紫檀芪處理組Vimentin、α-SMA mRNA水平顯著降低，E-cadherin mRNA水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;但紫檀芪組和潑尼松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示紫檀芪可以下調(diào)肺纖維化大鼠的Vimentin、α-SMA mRNA表達(dá)，上調(diào)E-cadherin mRNA表達(dá)。見圖3。

3 討論

目前中醫(yī)文獻(xiàn)中多把肺纖維化歸類為肺痿、肺痹范疇，病機(jī)為正氣虧虛，痰瘀阻絡(luò)的虛實夾雜?！督饏T要略·心典》曰：“蓋肺為嬌臟，熱則氣爍，故不用而痿;冷則氣沮，故亦不用而痿也”。紫檀芪為中藥龍血竭的有效組成成分，龍血竭有“活血之圣藥”美譽（明·李時珍《本草綱目》卷34），具有活血、化瘀、止血、補(bǔ)血的功效。Nichols等[10]評估劍龍血竭中有效成分發(fā)現(xiàn)為紫檀芪>白藜蘆醇>龍血素B>龍血素A?，F(xiàn)代研究提示龍血竭和白藜蘆醇等[11-12]可減緩肺纖維化進(jìn)展，減輕PF大鼠肺組織纖維化程度。肺纖維化是以彌漫性肺間質(zhì)改變?yōu)橹饕卣鞯姆渭膊。渲饕±碜兓癁槌衫w維細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多。紫檀芪是一種有效的抗炎抗氧化應(yīng)激的天然藥物，本炎性反應(yīng)采用博來霉素誘導(dǎo)大鼠制備肺纖維化模型，從上皮間質(zhì)標(biāo)志蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)以及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)等影響入手，探討紫檀芪抗肺纖維化作用于EMT的效應(yīng)機(jī)制。

肺纖維化是多種原因引起慢性肺疾病的共同結(jié)局，肺纖維化的發(fā)病—般認(rèn)為要經(jīng)歷損傷、炎性反應(yīng)變化、生理修復(fù)3個階段，首先是肺組織細(xì)胞受到內(nèi)在或外界的生物、化學(xué)、物理等不同方面的刺激，對肺臟組織逐漸造成傷害;其次受到傷害的肺組織細(xì)胞會產(chǎn)生自我防御措施，促使正常細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，形成具有收縮功能的肌成纖維細(xì)胞，同時促進(jìn)EMT的發(fā)生，使上皮細(xì)胞失去基底膜的連接支撐而遷移和侵入，成為間充質(zhì)干細(xì)胞，分泌產(chǎn)生EMC，促進(jìn)好轉(zhuǎn)或纖維化，同時相關(guān)炎性反應(yīng)信號通路被激活，引起創(chuàng)傷部位炎性反應(yīng);通過免疫應(yīng)答系統(tǒng)激活T淋巴細(xì)胞，增加膠原蛋白的分泌而起到修復(fù)受損肺組織的作用;最后由于有害因素的反復(fù)刺激，EMC的破壞與修復(fù)反復(fù)進(jìn)行，導(dǎo)致EMT不斷發(fā)生，炎性因子不斷表達(dá)分泌，最終導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度增殖和EMC蛋白代謝異常和膠原纖維的過度沉積，出現(xiàn)肺纖維化[13]。肌成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生大量ECM，如α-SMA，Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞重塑，從而放大纖維化的級聯(lián)反應(yīng)[14]。膠原在肺組織中含量豐富，是ECM的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其代謝失衡是ECM過度沉積的主要標(biāo)志，其中起主要作用的是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，主要存在于各級支氣管壁和血管壁。在致纖維化因素的作用下，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原合成代謝超過分解代謝，過多的膠原纖維在肺組織中不斷沉積，導(dǎo)致ECM的過度積累和進(jìn)行性纖維化形成，這是肺纖維化形成過程中最重要的病理改變，因此膠原含量變化是判斷肺纖維化程度的一個特征性指標(biāo)[15]。而在本次研究中天狼猩紅染色法顯示肺中模型組Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白增多，說明在肺纖維化過程中膠原纖維大量積聚，而在用藥組中其表達(dá)均有所下降，紫檀芪對膠原沉積的抑制作用與潑尼松組比較無差異，紫檀芪抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原為代表的ECM合成，推測其抗纖維化作用與延緩上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)換有關(guān)。

在EMT過程中[16]，上皮細(xì)胞標(biāo)記物如緊密連接蛋白-1和E-cadherin表達(dá)的減少，E-cadherin基因被抑制，E-cadherin生成減少使黏附連接點的不穩(wěn)定性增加;間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物如α-SMA、E-cadherin、Vimentin、膠原蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)增加，形成了“鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換”，與上皮細(xì)胞的聯(lián)系減弱，肌動蛋白應(yīng)力纖維形成;Vimentin基因得到活化，影響了E-cadherin與細(xì)胞膜之間的聯(lián)系，使中間纖維成分發(fā)生變化。E-cadherin是一種鈣依賴性黏附分子，在正常情況下將肺泡上皮細(xì)胞緊密地黏附在一起，參與調(diào)節(jié)上皮形成并維持它的完整過程，此外E-cadherin與Vimentin的表達(dá)與EMT具有緊密聯(lián)系，對組織結(jié)構(gòu)的形成與維持起著非常重要的作用[17]。肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblast，MFB）具有細(xì)胞增殖及合成ECM的功能，能導(dǎo)致組織器官由修復(fù)向纖維化轉(zhuǎn)變，是器官纖維化發(fā)展過程中最重要的效應(yīng)細(xì)胞，而α-SMA是肺纖維化過程中肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)對于肌成纖維細(xì)胞代謝和形態(tài)學(xué)特性維持起重要作用，增多可明顯增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞的遷移及收縮能力，進(jìn)而增強(qiáng)ECM的合成和分泌，表達(dá)量和肺纖維化程度成正相關(guān)，標(biāo)志EMT的發(fā)生，與肺纖維化患者存活率呈負(fù)相關(guān)[18]。Nagaraja SS等[19-20]研究表明，E-cadherin為上皮細(xì)胞標(biāo)志物，過量表達(dá)的α-SMA能抑制E-cadherin的表達(dá)，使上皮細(xì)胞黏附力減弱，相鄰細(xì)胞間連接變得疏松而出現(xiàn)遷徙增強(qiáng)，ColⅠ、α-SMA的表達(dá)量開始逐漸上升，ECM大量沉積，發(fā)生EMT過程，進(jìn)而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。本研究結(jié)果提示紫檀芪可能通過抑制EMT，使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，減少α-SMA、Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)，增加細(xì)胞黏附力，降低細(xì)胞侵襲能力，降低膠原蛋白的沉積，從而抑制肺泡壁增厚和肺泡損傷。

綜上所述，紫檀芪可以顯著抑制肺組織膠原蛋白的合成與沉積，降低大鼠纖維化肺組織中的α-SMA、Vimentin的表達(dá)能力，增加E-cadherin表達(dá)水平，有效的改善免疫平衡，降低ECM的合成，調(diào)控EMT過程而發(fā)揮抗肺纖維作用。

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（2020-07-20收稿 責(zé)任編輯：王楊）