FMR1基因突變與自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究

黃凌云，沈 曄，錢芳波

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市婦幼保健院計(jì)劃生育科，江蘇 無錫 214002)

自然流產(chǎn)是指在孕28周前，排除人為因素導(dǎo)致的妊娠終止；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)則是指同一位女性在短期內(nèi)連續(xù)發(fā)生至少2次自然流產(chǎn)[1]。流產(chǎn)發(fā)生在12周之前稱之為早期流產(chǎn)，若流產(chǎn)發(fā)生在12周之后則稱為晚期流產(chǎn)[2]。在全部的自然流產(chǎn)中，有80%發(fā)生在早期，多與解剖、遺傳、感染、內(nèi)分泌、自身免疫性疾病等諸多因素有關(guān)，其中遺傳因素中染色體異常最為常見[3]。脆性智力低下1號(hào)基因(Fragile X retardation-1，F(xiàn)MR1)5端非編碼區(qū)有一段以CGG為單位的三核苷酸動(dòng)態(tài)重復(fù)序列，該序列長(zhǎng)度(CGG的重復(fù)次數(shù))在傳代過程中表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化[4]。卵巢早衰、脆性-X綜合征、脆性X相關(guān)震顫-共濟(jì)失調(diào)綜合征是與之相關(guān)的各類疾病，這些疾病的特征與該序列擴(kuò)張的程度相關(guān)[5]。自然流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦其FRM1基因CGG重復(fù)數(shù)量是否高出普通人群，目前尚未見較多相關(guān)報(bào)道證實(shí)。本研究擬檢測(cè)早期自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者FRM1基因CGG重復(fù)序列數(shù)來了解FRM1基因與自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的相關(guān)性，旨在為未來自然流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因?qū)W研究提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年6月至2019年5月在我院計(jì)劃生育科就診的早期流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者144例作為試驗(yàn)組，同期在我院接受常規(guī)產(chǎn)檢的70例既往無自然流產(chǎn)或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的女性70例作為對(duì)照組，均在我院接受正常孕檢并順利分娩。納入標(biāo)準(zhǔn)：①試驗(yàn)組均為有不良孕產(chǎn)史者，包括早期自然流產(chǎn)史、≥2次流產(chǎn)史、≥2次稽留流產(chǎn)史；②對(duì)照組經(jīng)查無任何內(nèi)科合并癥及自身免疫性疾病，既往無不良孕產(chǎn)史，既往無流產(chǎn)史；③全部入組女性對(duì)本次研究實(shí)施的方法、目的等內(nèi)容均知情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并內(nèi)外科合并癥者；②既往接受腹腔手術(shù)治療史者；③心理疾病或精神障礙等無法很好的配合研究者。試驗(yàn)組年齡18～40歲[(30.70±4.71)歲]；孕次1～7次[(3.24±1.15)次]；產(chǎn)次0～2次[(0.89±0.24)次]；對(duì)照組年齡20～40歲[(31.02±4.81)歲]；孕次1～5次[(3.14±1.21)次]；產(chǎn)次0～2次[(0.87±0.25)次]。兩組年齡、孕次、產(chǎn)次等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。該研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法全部患者均接受FMR1基因檢測(cè)。①DNA提?。喝渴茉囌呔邮芡庵莒o脈采血2 ml，提取DNA，提取試劑盒為德國(guó) Qiagen公司提供的全血DNA試劑盒，嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，取溶解后DNA溶液1 μl，以相同蒸餾水作為空白對(duì)照組，在紫外分光光度儀上檢測(cè)DNA純度合格，稀釋DNA濃度至20 ng/ μl備用。②檢測(cè)FMR1基因CGG重復(fù)序列數(shù)：凍寸24 h內(nèi)統(tǒng)一快遞空運(yùn)至北京大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，每批次反應(yīng)均設(shè)有全突變、空白對(duì)照各1例，提取基因組DNA后使用美國(guó)Asuragen公司提供的FMR1基因Amplide試劑盒經(jīng)X檢測(cè)技術(shù)與熒光PCR技術(shù)，使用美國(guó)ABI公司提供的3730DNA分析儀毛細(xì)管電泳儀實(shí)施毛細(xì)管電泳，使用美國(guó)ABI公司提供的GeneMapper4.0軟件進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物分析，檢測(cè)FMR1基因CGG重復(fù)序列數(shù)。PCR反應(yīng)體系包括11.45 μl、GC-Rich Amp buffer、1.5 μl 6′-FAM-FMRI引物、0.5 μl FRM1CGG引物、0.5 μl無核酸酶的水、0.05 μl高GC的多聚酶混合物、30 ng的DNA模板。

1.3 觀察指標(biāo)記錄所有患者的各項(xiàng)資料，結(jié)合FRM1基因突變檢查結(jié)果，對(duì)有關(guān)數(shù)據(jù)及研究對(duì)象臨床資料進(jìn)行對(duì)比分析。使用國(guó)內(nèi)目前普遍采用的分類[6]：①正常重復(fù)范圍：n=5～44次；②中間型或灰區(qū)：n=45～54次；③前突變：n=55～200次、④全突變：n=200次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)組與對(duì)照組FMR1基因CGG重復(fù)序列分布規(guī)律比較試驗(yàn)組144例患者中自然流產(chǎn)者84例，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者60例。自然流產(chǎn)組與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組患者CGG重復(fù)最大頻率等位基因n=30，其次為n=29，再次為n=36、n=31，對(duì)照組最大頻率等位基因n=30，后頻率由高至低依次為n=29、36、31，三者高度一致。自然流產(chǎn)組與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組檢測(cè)到不同等位基因共35種，CGG重復(fù)次數(shù)變異范圍為n=21～133，最大頻率基因?yàn)閚=30，后依次為n=29、31。對(duì)照組檢測(cè)到不同等位基因25種，CGG重復(fù)次數(shù)范圍22～58，最大頻次等位基因?yàn)閚=30、36、31。三組CGG重復(fù)均數(shù)分別為(29.34±5.21)次、(30.34±5.32)次、(28.78±6.41)次，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.479，P=0.854)。3組FRM1基因CGG重復(fù)序列分布情況見表1。

表1 3組FRM1基因CGG重復(fù)序列分布情況比較

2.2 中間型分布情況本研究將中間型(灰色區(qū)域)的CGG重復(fù)次數(shù)擴(kuò)增范圍定義在45～54，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)組中間型FMR1基因檢出1例，中間型FMR1基因攜帶率為1∶84；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組中間型FMR1基因檢出1例，中間型FMR1基因攜帶率為1∶60；對(duì)照組未檢出中間型FMR1基因。3組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.282，P=0.744)。

2.3 基因突變情況比較試驗(yàn)組患者FMR1基因前突變攜帶者2例，攜帶頻率為1∶72，對(duì)照組中未檢出FMR1基因前突變者，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.055，P=0.452)。不論是試驗(yàn)組患者或是對(duì)照組女性均未檢出FMR1基因全突變。

3 討論

近來早期胚胎停育現(xiàn)象愈發(fā)多見，中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科分會(huì)《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識(shí)》明確提出妊娠12周前發(fā)生的早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)多因遺傳因素導(dǎo)致，但該指南中僅僅提到夫妻雙方全核型分析與胚胎絨毛染色體[7]。FMR1基因位于X染色體末端Xq23.7，編碼脆性-X智力障礙基因，會(huì)引起女性卵巢儲(chǔ)備功能下降，誘發(fā)卵巢早衰[9]。卵巢儲(chǔ)備功能直接與女性生育能力及妊娠結(jié)局相關(guān)，CGG重復(fù)序列為55～200已被研究證實(shí)與卵巢早衰息息相關(guān)[10]。給予上述論證，本研究主要分析CGG重復(fù)擴(kuò)增是否與自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)。

目前，CGG重復(fù)數(shù)量變化劃分標(biāo)準(zhǔn)被國(guó)際公認(rèn)的有兩個(gè)，分別由歐洲人類遺傳學(xué)會(huì)與美國(guó)醫(yī)學(xué)與遺傳學(xué)會(huì)制定[8]，后者在臨床上的應(yīng)用較常見。根據(jù)CGG擴(kuò)增頻率高低，會(huì)誘發(fā)不同的臨床癥狀，諸如脆性X相關(guān)原發(fā)性卵巢功能不全、脆性X綜合征及脆性X相關(guān)共濟(jì)失調(diào)等[9]。CGG重復(fù)數(shù)在5～44次的FMR1基因?yàn)楸欢x為正常型或未受累型，攜帶這類正常基因者其不會(huì)表現(xiàn)出顯著的臨床病癥，這類人群的CGG重復(fù)數(shù)以29、30次最常見，位于這個(gè)區(qū)段的CGG重復(fù)序列不會(huì)存在子代擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)；CGG重復(fù)數(shù)在45～54次的FMR1基因被定義為中間型或灰區(qū)FMR1基因，攜帶這類基因者無顯著臨床病癥，也無證據(jù)證明這個(gè)區(qū)段內(nèi)CGG重復(fù)序列可能會(huì)增加子代脆性X綜合征的風(fēng)險(xiǎn)；CGG重復(fù)序列次數(shù)在55～200之間的FMR1基因被定義為FMR1前突變型基因，其擴(kuò)增程度在母系遺傳中極其明顯，可能會(huì)導(dǎo)致后代的CGG重復(fù)數(shù)由前突變擴(kuò)增至完全突變，對(duì)于這類攜帶FMR1前突變型基因的攜帶者而言，其每次懷孕均應(yīng)該接受產(chǎn)前診斷[10～12]。目前尚無報(bào)道發(fā)現(xiàn)父系遺傳擴(kuò)增至完全突變的案例，故父親存在FMR1基因前突變者在生育后代時(shí)可不進(jìn)行產(chǎn)前診斷。經(jīng)上述論證可以認(rèn)為FMR1基因突變可能與自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)，這可能與以下機(jī)制有關(guān)：①FMR1基因前突變型、完全突變型的CGG序列超甲基化，故有發(fā)生脆性X綜合征的風(fēng)險(xiǎn)；②女性FMR1基因前突變型攜帶者有超過20%的幾率會(huì)出現(xiàn)卵巢早衰及早期閉經(jīng)的情況，故對(duì)生育能力產(chǎn)生明顯影響；③CGG重復(fù)數(shù)在200次以上的全突變型FMR1基因，其在臨床上會(huì)導(dǎo)致X脆性綜合征[13，14]。

本研究結(jié)果顯示，無論是自然流產(chǎn)組、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組還是對(duì)照組女性的CGG重復(fù)次數(shù)頻率最高的均為30、29，其次為36、31，這與國(guó)內(nèi)張有成等[15]報(bào)道結(jié)果高度一致。此外，結(jié)果顯示，3組FMRI基因中間型攜帶率比較未見明顯差異，試驗(yàn)組FMR1基因前突變攜帶率高于對(duì)照組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后未見差異，結(jié)果可以看出，F(xiàn)MR1基因突變可能會(huì)增加自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，而在本研究中未見差異可能與本次研究納入樣本量較少有關(guān)，結(jié)果的真實(shí)性與可靠性還應(yīng)在未來展開大樣本的研究加以證實(shí)。FMMR1等位基因大小在45～200，是減數(shù)分裂不穩(wěn)定的，可以遺傳為減數(shù)分裂的后代，F(xiàn)MR1基因也經(jīng)歷了異常甲基化，這些不穩(wěn)定的突變可能會(huì)導(dǎo)致與生命不相容的缺陷，并引起流產(chǎn)，且前突變型FMR1基因?qū)β殉补δ艿膿p害現(xiàn)已被醫(yī)學(xué)界廣泛接受，可以猜測(cè)該基因可能通過對(duì)卵巢的影響來增加女性流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[16]。但上述機(jī)制均未被循證醫(yī)學(xué)所證明，也尚無相關(guān)的報(bào)道能夠給予其理論支持，這就需要檢測(cè)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者流產(chǎn)物內(nèi)DNA表達(dá)來證明，尋找其擴(kuò)增等位基因或改變的FMR1基因。

綜上所述，F(xiàn)RM1基因突變可能與自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)，檢測(cè)自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的FRM基因突變情況，對(duì)給予下次妊娠優(yōu)生指導(dǎo)有著積極意義。