貴州青錢(qián)柳膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CpMTF9的基因克隆及功能鑒定

安銀 戴星 羅海霞 熊孟連

【摘?? 要】 ：NAC轉(zhuǎn)錄因子作為植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，當(dāng)植物遭到逆境時(shí)，會(huì)通過(guò)一系列應(yīng)激反應(yīng)將調(diào)控信號(hào)逐級(jí)放大，促進(jìn) NAC轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)細(xì)胞脅迫應(yīng)答能力。

【關(guān)鍵詞】 青錢(qián)柳;CpMTF9;基因克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：[Q37]?????????????? 文獻(xiàn)識(shí)別碼：A?????????????? 文章編號(hào)：2096-1073（2020）11-0054-55

[Abstract] NAC transcription factors， as one of the largest transcription factor families in plants， amplify the regulatory signals step by step through a series of stress responses， and promote the expression of related genes by binding NAC transcription factors to promoters to enhance the ability of cell stress response.

[Key words]? Qingqianliu; CpMTF9; gene cloning; bioinformatics analysis

當(dāng)植物遭到非生物脅迫之后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)會(huì)累積大量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。為了緩解惡劣環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，細(xì)胞會(huì)通過(guò)啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，去幫助錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)折疊[2]。NAC家族是目前發(fā)現(xiàn)最大的特異性轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一[3]。擬南芥NAC083，具有脫氧核糖核酸和蛋白結(jié)合活性[4]，可編碼一個(gè)NAC域轉(zhuǎn)錄因子。青錢(qián)柳（Cyclocarya Paliurus）是我國(guó)的瀕危樹(shù)種之一[5]。國(guó)內(nèi)現(xiàn)階段對(duì)于青錢(qián)柳的研討重點(diǎn)主要是藥用價(jià)值、青錢(qián)柳苗木的快速繁殖技術(shù)等方面，關(guān)于NAC基因抗逆方面的報(bào)道很少。

本研究通過(guò)青錢(qián)柳轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的隨機(jī)克隆測(cè)序分析，獲得與NAC家族膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因AtNAC083相似的一條cDNA序列（Cluster-29186.100002）。經(jīng)預(yù)測(cè)分析，該基因?yàn)槟そY(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)青錢(qián)柳CpMTF9進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果有助于加深對(duì)青錢(qián)柳內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫途徑的認(rèn)識(shí)。

1? 結(jié)果與分析

1.1? CpMTF9基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)與Motif搜索

用植物總RNA提取試劑盒提取青錢(qián)柳葉片的總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)青錢(qián)柳的cDNA進(jìn)行合成;以青錢(qián)柳葉片cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)CpMTF9進(jìn)行克隆，通過(guò)測(cè)序顯示成功得到含有一個(gè)完整開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為723bp的cDNA序列，共編碼形成240個(gè)氨基酸。利用在線工具ExPASy對(duì)CpMTF9的氨基酸序列展開(kāi)理化屬性分析，結(jié)果表明該基因序列所翻譯蛋白質(zhì)的分子量為26.86kD，等電點(diǎn)為9.65，蛋白質(zhì)分子式為C1182H1824N340O355S12;在組成蛋白的20種氨基酸中，該蛋白半衰期為30h，CpMTF9蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為41.04，所以該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用PROSITE在線工具對(duì)蛋白進(jìn)行Motif搜索，結(jié)果顯示該蛋白的Motif與其結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致，表明該蛋白具有NAC家族成員相關(guān)的序列模式（圖1）。

1.2?? CpMTF9結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)在線工具ExPASy對(duì)CpMTF9進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CpMTF9蛋白與擬南芥ANAC083蛋白的空間三級(jí)結(jié)構(gòu)相似（圖2）。

2? 結(jié)果與討論

生物信息分析技術(shù)目前已經(jīng)成為預(yù)測(cè)目的基因功能的基本方法，但由于只能通過(guò)預(yù)測(cè)來(lái)判斷基因的功能，因此要確定目的基因的功能就必須要對(duì)目的基因進(jìn)行驗(yàn)證。研究表明非生物脅迫會(huì)引發(fā)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，導(dǎo)致青錢(qián)柳減產(chǎn)。為了滿足市場(chǎng)對(duì)青錢(qián)柳的需求，本研究成功從青錢(qián)柳中克隆得到一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子CpMTF9，該基因是NAC家族成員中膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因。同源多序列比對(duì)顯示，CpMTF9基因與擬南芥ANAC083基因的序列、功能都具有很高的相似性。因此，推測(cè)CpMTF9基因在緩解惡劣環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響方面有著重要的作用。這對(duì)于未來(lái)研究CpMTF9基因在青錢(qián)柳內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫信號(hào)途徑中的作用具有重要意義。

3? 實(shí)驗(yàn)方法

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，依次加入RNA，Oligo-dT，dNTP，DTT，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和ddH2O后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板，使用PFU-KOD高保真酶進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。將得到的CpMTF9目的片段及PGBKT-7載體同時(shí)用BamH Ⅰ及ECOR I在37℃下進(jìn)行雙酶切。酶切回收的產(chǎn)物用連接酶進(jìn)行16℃過(guò)夜酶連。將過(guò)夜連接的產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于Kan+抗性培養(yǎng)基上、倒置在37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。挑單克隆進(jìn)行陽(yáng)性鑒定后提取質(zhì)粒，并送到公司進(jìn)行測(cè)序。

參考文獻(xiàn)：

[1] Liu J. X.， Howell S.H .， Endoplasmic Reticulum Protein QualityControl and Its Relationship to Environmental Stress Responsesin Plants，The Plant Cell， 2010， 22（9）：2930-2942.

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[3] Olsen A.N.，Ernst H. A.，Leggio L.L.， Skriver K. DNA-bindingspecificity and molecular functions of NAC transcription factors，Plant Science （Oxford）， 2005， 169（4）：0-797.

[4] Suyal G.，Rana V.S.，Mukherjee S. K.，Wajid S.， Choudhury N. R.，Arabidopsis thaliana NAC083 protein interacts with mungbeanyellow mosaic india virus （mymiv） rep protein，Virus Genes， 2014， 48（3）：486-493.

[5] 鄒榮燦，吳少錦.青錢(qián)柳的分布、化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房， 2017，28（31）：4449-4451.

（編輯：赫亮）