拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織AsA-GSH循環(huán)的影響

馬春英，王玉玲，尹藝臻，溫銀元，原向陽，趙娟

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801）

谷子（Setaria italicaBeauv.）是禾本科狗尾草屬最古老的作物之一［1］，在旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)中發(fā)揮重要作用，是新時期大眾食品消費多元化需求和畜牧業(yè)發(fā)展的特色和優(yōu)勢作物，其種植面積發(fā)展穩(wěn)定。但谷田雜草危害嚴(yán)重，導(dǎo)致減產(chǎn)，且谷子對除草劑較其它禾本科作物敏感，常用除草劑在谷田噴施時稍有不慎就會造成藥害，嚴(yán)重制約著谷子規(guī)?；a(chǎn)。因此，了解谷子抗除草劑響應(yīng)機(jī)制，對谷田除草及培育抗除草劑品種具有重要意義。

拿捕凈化學(xué)名稱烯禾啶（Sethoxydim），屬于環(huán)己烯酮類除草劑，是一種高活性、對多種一年生和多年生禾本科雜草有很強(qiáng)的選擇性的內(nèi)吸型莖葉處理劑，其除草效果明顯，施后被雜草莖葉迅速吸收，使雜草生命活性降低，失去競爭力，且在土壤中易分解成安全物質(zhì)，被較廣泛地使用到生產(chǎn)中［2］。田伯紅等［3］研究表明，谷子幼苗葉期噴施拿捕凈可有效防除禾本科雜草，平均株防效達(dá)88.63%。解麗麗等［4］發(fā)現(xiàn)，在拿捕凈脅迫下張雜谷5號葉片的SOD、POD酶活性增加，使谷子細(xì)胞免受活性氧造成的傷害。高愛保等［5］研究發(fā)現(xiàn)，拿捕凈脅迫后抗性品種葉綠素含量、抗氧化酶活性高于敏感品種。植物受到逆境脅迫時，細(xì)胞內(nèi)積累過量的活性氧（ROS），過量的ROS會引起植物細(xì)胞的氧化損傷，AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)是植物體內(nèi)清 除ROS的 重 要 途 徑［6］，在 此 循 環(huán) 中，APX以AsA為反應(yīng)底物，將H2O2還原成H2O，從而減弱或消除H2O2的毒性，與此同時，AsA被氧化形成DHA，DHA在脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的作用下，與GSH反應(yīng)恢復(fù)成AsA，在這個過程當(dāng)中，作為氫供體的GSH轉(zhuǎn)變成氧化型谷胱甘肽（GSSG），后者又在GR的催化作用下，被還原為GSH［7］。AsA-GSH循環(huán)中各組分的協(xié)調(diào)運作，使植物體內(nèi)積累的活性氧得到清除。

目前，有關(guān)谷子對除草劑脅迫生理響應(yīng)的研究中，多以抗氧化保護(hù)酶系、膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等為研究對象［8］，而對AsA-GSH循環(huán)這一防御系統(tǒng)的研究鮮有報道。本試驗以優(yōu)質(zhì)谷子品種晉谷21和抗拿捕凈品種豫谷35、冀谷42為試驗材料，研究了不同濃度拿捕凈脅迫處理對谷子萌發(fā)、愈傷誘導(dǎo)、生長的影響，以及對AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶APX、GR活性和抗氧化劑AsA、GSH等含量的影響，比較分析其在感抗性不同的谷子品種之間的差異，從細(xì)胞水平探究谷子對拿捕凈脅迫的生理響應(yīng)和抗性機(jī)制，為谷子抗除草劑相關(guān)研究和抗性品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室進(jìn)行。晉谷21種子由山西省農(nóng)科院經(jīng)作所提供，豫谷35、冀谷42種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子團(tuán)隊提供。拿捕凈乳油有效成分為12.5%，由中華立農(nóng)生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘導(dǎo)愈傷組織

以MS+2.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將滅菌后的谷子種子接種到添加不同濃度（0、0.5、1、2、3 mL·L-1）拿捕凈的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)20 d，溫度（25±1）℃。培養(yǎng)5 d時統(tǒng)計種子萌發(fā)率，20 d時統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，期間不斷觀察愈傷組織的生長情況。

1.2.2 測定生理指標(biāo)

以不添加拿撲凈的培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后的愈傷組織作為拿捕凈脅迫處理的材料。將誘導(dǎo)出的長勢均勻一致的谷子愈傷組織分別接種到添加了不同濃度（0、0.5、1、2、3 mL·L-1）拿捕凈的培養(yǎng)基中，在（25±1）℃下暗培養(yǎng)，2 d后取不同處理下的3個品種愈傷組織測定各項生理指標(biāo)。生理指標(biāo)：參照Nakano［9］的 方 法 測 定APX活 性，參 照Ma等［10］的方法測定GR活性；GSH含量的測定參照Ellman［11］的 方 法，AsA、AsA+DHA和DHA含量的測定參照Tanaka［12］等的方法。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與制圖，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拿捕凈對谷子種子萌發(fā)的影響

由表1可見，隨著拿捕凈脅迫濃度升高，谷子種子萌發(fā)率總體呈下降趨勢。與對照相比，抗性品種豫谷35和冀谷42種子萌發(fā)率下降幅度較敏感品種晉谷21小，可知高濃度拿捕凈脅迫降低了3種谷子的萌發(fā)率，且對晉谷21的抑制明顯大于豫谷35和冀谷42。比較豫谷35和冀谷42這2個抗性品種，在拿捕凈濃度為0.5～1 mL·L-1時，冀谷42種子萌發(fā)率高于豫谷35，當(dāng)拿捕凈脅迫濃度升高后，二者種子萌發(fā)率的差異不明顯。

表1 拿捕凈對谷子種子萌發(fā)的影響Table 1 The effect of sethoxydim on germination of foxtail millet seeds

2.2 拿捕凈對谷子種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響

隨著拿捕凈脅迫濃度的升高，3種谷子愈傷組織誘導(dǎo)率均顯著下降，但下降程度在品種間多有不同（表2）。與對照相比，抗性品種豫谷35和冀谷42愈傷組織誘導(dǎo)率下降幅度明顯小于敏感品種晉谷21，豫谷35和冀谷42平均下降幅度差異不顯著。此外，晉谷21愈傷組織褐化的速度也較豫谷35和冀谷42快，可見晉谷21愈傷組織的誘導(dǎo)率受拿捕凈影響的程度顯著大于豫谷35和冀谷42。

表2 拿捕凈對谷子種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 The effect of sethoxydim on callus induction of foxtail millet seeds

2.3 拿捕凈對谷子愈傷組織生長的影響

由圖1可見，不同濃度拿捕凈處理后，3個品種谷子愈傷組織的生長情況差異明顯。當(dāng)拿捕凈濃度為0.5～1 mL·L-1時，3個谷子品種的愈傷組織受損害程度不大，可正常生長，但晉谷21愈傷組織出現(xiàn)輕微褐化（圖1-c1）。當(dāng)處理濃度提高至1～3 mL·L-1時，3個品種谷子愈傷組織均出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象，晉谷21褐化死亡（圖1 d1-e1），豫谷35愈傷組織生長逐漸受到抑制，處理濃度為3 mL·L-1時，愈傷組織明顯褐化（圖1 d2-e2），冀谷42愈傷組織在3 mL·L-1拿捕凈脅迫后，愈傷組織才發(fā)生部分褐化（圖1-e3）?？梢?，拿捕凈對豫谷35和冀谷42愈傷組織生長的影響比對晉谷21小，這與其具有拿捕凈抗性相一致。

2.4 拿捕凈對愈傷組織細(xì)胞APX、GR活性影響

圖1 不同濃度拿捕凈對谷子種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of sethoxydim on callus induction in foxtail millet seeds

由圖2A可知，拿捕凈脅迫處理后，參試谷子愈傷組織APX活性變化趨勢不同。隨拿捕凈處理濃度的升高，抗性品種豫谷35的APX活性變化趨勢為先升后降，在處理濃度為0.5 mL·L-1時達(dá)到峰值隨后下降，冀谷42的APX活性呈波動趨勢，但其總體活性高于晉谷21，敏感品種晉谷21愈傷組織APX活性持續(xù)上升，尤其在處理濃度大于2 mL·L-1后，APX活性顯著大于豫谷35但小于冀谷42。在處理濃度為3 mL·L-1時，晉谷21和冀谷42的APX活性均達(dá)到最大值。

圖2 不同濃度拿捕凈處理下愈傷組織細(xì)胞抗氧化酶活性變化情況Fig.2 Changes of antioxidant enzyme activity in callus cells treated with different concentration of sethoxydim

由圖2B可以看出，隨著拿捕凈處理濃度的升高，谷子愈傷組織中GR活性總體呈下降趨勢?？剐云贩N豫谷35和冀谷42愈傷GR活性變化趨勢均為先升高后降低，豫谷35的GR活性在處理濃度為0.5 mL·L-1時達(dá)到峰值，且顯著高于其他2個品種，冀谷42的GR活性則在脅迫濃度為1 mL·L-1時達(dá)到峰值，敏感品種晉谷21愈傷組織GR活性持續(xù)降低。綜合分析，拿捕凈各濃度處理下，豫谷35和冀谷42的GR活性均顯著高于晉谷21。

2.5 拿捕凈對愈傷組織細(xì)胞抗壞血酸、還原型谷胱甘肽含量變化的影響

由圖3A可見，拿捕凈處理后，豫谷35愈傷組織AsA+DHA含量呈降低趨勢，冀谷42愈傷組織AsA+DHA含量變化呈先降低后升高再降低再升高的波動趨勢，在各濃度下2個抗性品種AsA+DHA含量始終高于晉谷21。晉谷21愈傷組織AsA+DHA含量變化趨勢與冀谷42一致，在拿捕凈濃度為3 mL·L-1時，二者含量均達(dá)到最大值。

由圖3B可見，隨著拿捕凈濃度的升高，豫谷35愈傷組織AsA含量呈上升趨勢，在拿捕凈處理濃度為3 mL·L-1達(dá)到最高，冀谷42愈傷組織AsA含量呈持續(xù)下降趨勢，二者的AsA含量始終高于晉谷21。晉谷21愈傷組織AsA含量變化趨勢與冀谷42一致，但下降幅度顯著大于冀谷42。

由圖3C可見，拿捕凈脅迫后，豫谷35愈傷組織DHA含量總體呈降低趨勢，冀谷42中DHA含量變化呈先降低后升高再降低再升高的趨勢，晉谷21愈傷組織DHA含量變化趨勢與冀谷42一致，在拿捕凈濃度為3 mL·L-1時，二者含量均達(dá)到最大值。在各濃度下，2個抗性品種中DHA含量始終高于敏感品種晉谷21。

由圖3D可見，隨著拿捕凈濃度的升高，豫谷35和冀谷42愈傷組織GSH含量均呈先升后降的變化趨勢，當(dāng)拿捕凈處理濃度為0.5 mL·L-1時豫谷35的GSH含量達(dá)到最高，處理濃度為2 mL·L-1時冀谷42的GSH含量達(dá)到最高，且豫谷35的峰值大于冀谷42，晉谷21愈傷組織GSH含量總體呈下降趨勢。無拿捕凈脅迫時晉谷21愈傷組織AsA含量高于其他2個抗性品種，在拿捕凈脅迫下，豫谷35和冀谷42愈傷組織GSH含量普遍高于晉谷21。

2.6 拿捕凈脅迫下3個品種谷子愈傷組織各項生理指標(biāo)的相關(guān)分析

分析比較3個品種谷子愈傷組織在不同濃度拿捕凈脅迫后所測定的各項生理生化指標(biāo)之間的相關(guān)性可知，感抗性不同的3個品種各個指標(biāo)間相關(guān)性均差異顯著（表3～表5）。

圖3 不同濃度拿捕凈處理下愈傷組織細(xì)胞抗氧化劑含量變化情況Fig.3 Changes of antioxidant content in callus cells treated with different concentration of sethoxydim

晉 谷21中，AsA含 量 與DHA含 量 和APX活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與GSH含量、GR活性呈正相關(guān)關(guān)系，GSH含量與GR活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。豫谷35中AsA含量與其他指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且與APX活性負(fù)相關(guān)程度較大，GSH含量與AsA之外的各項指標(biāo)均呈正相關(guān)，且與APX活性為極顯著相關(guān)，與GR活性為顯著相關(guān)。冀谷42各指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系與晉谷21相似，可推測在拿撲凈脅迫下，這2個谷子品種AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的防御機(jī)制一致。

3 討論

與對照相比，隨著拿捕凈處理濃度的升高，敏感品種晉谷21的萌發(fā)率和愈傷誘導(dǎo)率下降幅度較抗性品種大，這與其不具抗性相一致。本研究也發(fā)現(xiàn)參試谷子品種發(fā)芽率差異較大，可能與品種種子自身發(fā)芽率高低有關(guān)，另一方面可能由于離體培養(yǎng)時消毒劑滅菌對種子活力造成一定影響。

APX和GR是循環(huán)中的2個關(guān)鍵抗氧化酶，適度的脅迫環(huán)境能夠引起植物AsA-GSH循環(huán)中抗氧化酶活性的升高［13］。研究表明，APX是植物和藻類特有的清除過氧化氫（H2O2）的重要酶類［5］，APX對環(huán)境變化較敏感，通過氧化AsA來清除過量的H2O2。目前，關(guān)于鹽脅迫下APX活性升高的報道較多［14，15］，在本研究中，隨著拿撲凈濃度的升高，晉谷21和冀谷42愈傷中APX活性與對照相比出現(xiàn)不同程度的升高，這與汪月霞［16］研究在一定濃度的Na2CO3脅迫下，蘆薈幼苗可以通過提高APX等抗氧化酶的活性來降低細(xì)胞中活性氧的積累量，來增強(qiáng)植物體的耐鹽堿性結(jié)果基本一致。而抗性品種的增幅均顯著高于同期的敏感型品種，說明抗性品種通過維持較高APX活性抵御逆境。GR是植物在長期進(jìn)化過程中形成的一套代謝毒性物質(zhì)的解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分之一，在降低正常細(xì)胞代謝和氧脅迫條件下脂質(zhì)過氧化方面具有重要作用［17］。GR的主要功能是利用NADPH提供的還原H催化GSSG變成GSH，能夠促進(jìn)AsA和GSH的再生。其活性高低決定了AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的運行速率。宮維嘉等［18］認(rèn)為鹽脅迫下，GR活性不能一直升高，是由于活性氧的產(chǎn)量超出了抗氧化系統(tǒng)的清除能力、并危及

了GR的活性，導(dǎo)致GR活性降低，從而使植物受到傷害，在本研究中也出現(xiàn)類似情況。

表3 晉谷21種子愈傷組織各項生理指標(biāo)的相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis of physiological indexes of seeds callus in Jingu 21

表4 豫谷35種子愈傷組織各項生理指標(biāo)的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of physiological indexes of seeds callus in Yugu 35

表5 冀谷42種子愈傷組織各項生理指標(biāo)的相關(guān)分析Table5 Correlation analysis of physiological indexes of seeds callus in Jigu 42

AsA和GSH是AsA-GSH循 環(huán)途徑 中2種重要的抗氧化物質(zhì)，在清除植物體內(nèi)活性氧方面具有重要作用，通常兩者相協(xié)同起作用［19］。在此循環(huán)中APX以AsA為反應(yīng)底物，將H2O2還原成H2O，同時AsA可被氧化成單脫氫抗壞血酸（MDHA）和脫氫抗壞血酸（DHA），在完全氧化的DHA產(chǎn)生的情況下，GSH作為還原劑參與AsA的再生，同時GSH可以被氧化，產(chǎn)生的氧化型谷胱甘肽（GSSG）可以通過GR還原成GSH。本研究發(fā)現(xiàn)，谷子愈傷中AsA含量與APX活性呈負(fù)相關(guān)，晉谷21和冀谷42中AsA含量隨APX活性升高呈下降趨勢，這可能是由于植物體通過提升APX活性以清除過量活性氧，而AsA作為應(yīng)底物被大量消耗的緣故。豫谷35中AsA含量隨APX活性降低呈上升趨勢。Foyer和Noctor［20］認(rèn)為，GR活性的高低直接決定了GSH庫的水平，較高的GR活性對于植物體保持較高的GSH含量非常重要。高永生和陳集雙［21］發(fā)現(xiàn)低濃度鹽脅迫使小麥葉片AsA和GSH的含量有一定程度響應(yīng)性升高，而高鹽脅迫下兩者的含量都呈現(xiàn)出了下降趨勢。這與本研究結(jié)果基本一致。Shalata等［22］研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫使鹽敏感番茄根系中的AsA含量降低，DHA含量明顯升高，而耐鹽品種則與之相反。本研究中敏感型品種晉谷21，在拿撲凈脅迫下，愈傷中AsA含量降低的同時DHA含量明顯升高，抗性品種豫谷35則與之相反。

4 結(jié)論

拿捕凈脅迫對谷子種子的萌發(fā)、愈傷組織的誘導(dǎo)以及愈傷組織的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，且對晉谷21谷子的影響要明顯大于抗性品種豫谷35和冀谷42，萌發(fā)抑制率為晉谷21（58.86%）＞冀谷42（54.29%）＞豫谷35（33.15%），愈傷誘導(dǎo)抑制率為晉谷21（45.14%）＞冀谷42（41.71%）＞豫谷35（27.43%）。不同濃度拿捕凈脅迫處理后，抗性品種豫谷35和冀谷42各項指標(biāo)的變化幅度與感性品種晉谷21差異顯著。