11類菌種固態(tài)發(fā)酵對(duì)青蒿葉渣功效成分的影響

丁嘉偉，蘇新堯，馬婷玉，王晚晴，向麗，馮寶民*，王彩霞*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116622；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700；3.北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023）

隨著中藥行業(yè)快速發(fā)展，中藥加工企業(yè)數(shù)量不斷增加，加工生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量中藥渣，傳統(tǒng)處理方法有焚燒、填埋、固定區(qū)域堆放等，處理藥渣不僅需要投入大量資金，也造成中藥資源大量浪費(fèi)［1］。

黃花蒿，別稱青蒿（Artemisia annua），是我國傳統(tǒng)中藥，主要用于消腫、止汗、涼血等［2］。青蒿中除含有抗瘧成分青蒿素、青蒿酯鈉、蒿甲醚外，還含有青蒿酸、雙氫青蒿素、青蒿醇、青蒿乙素等功效成分。青蒿素等功效成分藥理作用的深入研究，促使相關(guān)青蒿原料制藥企業(yè)加大青蒿素等功效成分的提取，青蒿藥渣量逐漸增加，殘留功效成分和藥用價(jià)值得不到充分利用。因此積極探索青蒿葉渣新的應(yīng)用，增加青蒿產(chǎn)品種類及附加值［3］，有助于提升青蒿葉渣資源利用率。

目前中藥渣處理方式有重新提取藥渣中有效成分、制成無公害化肥、作為食用菌栽培基質(zhì)及飼料添加劑等。張順喜等人［4］針對(duì)中藥渣難處理的問題，以污水處理廠厭氧污泥為接種物，發(fā)酵中藥渣產(chǎn)生沼氣，為中藥渣的綜合利用提供新思路。動(dòng)物養(yǎng)殖方面，通過優(yōu)化菌種及配比方式，將中藥渣發(fā)酵生產(chǎn)功能性飼料，可以提高泌乳獺兔的生產(chǎn)性能［5］及斷奶仔豬的免疫力［6］。研究發(fā)現(xiàn)，中藥渣中含有豐富的粗脂肪、粗蛋白、多糖和多種微量元素，是一種可循環(huán)的生物質(zhì)資源和天然培養(yǎng)基。微生物分泌纖維素酶、蛋白酶及多種微量元素，可破壞植物細(xì)胞壁，大幅度提升發(fā)酵產(chǎn)物中功效成分含量。

綜上所述，本研究采用固態(tài)發(fā)酵的方式，探索開發(fā)青蒿葉渣作為動(dòng)物保健產(chǎn)品的可能性，為青蒿葉渣綜合處理提供新思路，具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)菌株見表1。

1.2 儀器

恒溫振蕩器THZ-98A；紫外分光光度計(jì)UV-5100B；GCMS-QP20（日本島津）；微量XPE/微量分析天平；漩渦震蕩器Vortex-1；真空濃縮機(jī)CONCENTRATOR PLUS（德國艾本德公司）；潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD；無氧發(fā)酵袋（28 cm×40 cm）。

1.3 試劑

氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、石油醚均購買自北京化工廠；青蒿乙素、雙氫青蒿酸標(biāo)品購自成都埃法生物科技有限公司；青蒿葉渣由廣西仙草堂有限責(zé)任公司提供。

2 方法

2.1 種子液制備

里氏木霉、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌B7、酵母菌和畢赤酵母菌按接種量2%接種于30 mL LB（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉）培養(yǎng)基并連續(xù)活化2次，取第二次活化菌液，再次按接種量2%接種于100 mL LB培養(yǎng)基，酵母菌和畢赤酵母菌30℃培養(yǎng)24 h，其余菌株37℃培養(yǎng)24 h，丁酸梭菌種子液培養(yǎng)在厭氧發(fā)酵瓶中進(jìn)行。

2.2 發(fā)酵

青蒿葉渣固體培養(yǎng)基成分：30 g青蒿葉渣、5 g玉米漿、20 g豆粕、3 g紅糖、2 g石粉，以上5種物質(zhì)混合粉碎過80目篩，每組重復(fù)3次。

單一菌株發(fā)酵：里氏木霉、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌B7、丁酸梭菌、酵母菌和畢赤酵母菌單一菌種種子液40 mL接種于固體培養(yǎng)基中，酵母菌和畢赤酵母菌30℃發(fā)酵7 d，其余菌株37℃培養(yǎng)7 d，丁酸梭菌在無氧發(fā)酵袋中發(fā)酵，每組重復(fù)3次。

優(yōu)選菌混合發(fā)酵：根據(jù)粗蛋白、雙氫青蒿酸和青蒿乙素試驗(yàn)結(jié)果，選取枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和酵母菌作為進(jìn)一步試驗(yàn)對(duì)象，各取13 mL種子液混合加入固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7 d，混合菌固態(tài)發(fā)酵，每組重復(fù)3次。

2.3 粗蛋白和功效成分測(cè)定方法

青蒿葉渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物處理采用余正文對(duì)青蒿的處理方法［10］；發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量測(cè)定采用雙縮脲法［11］；發(fā)酵產(chǎn)物功效成分檢測(cè)使用GC-MS測(cè)定，采用Tian的檢測(cè)方法［12］。

2.4 飼喂實(shí)驗(yàn)

選取日齡132天、4 800羽的羅曼灰雞，平均分為3組，每組重復(fù)3次。對(duì)照組飼喂全價(jià)料，試驗(yàn)組青蒿葉渣混合菌發(fā)酵產(chǎn)物按5%比例添加到全價(jià)料中飼喂雞群，15 d后觀察并比較2組雞蛋色澤及糞便顏色，并進(jìn)行篩糞處理。

表1 試驗(yàn)菌種及其特性Table 1 Bacterial strains and their characteristics used in the study

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間進(jìn)一步比較采用LSD-test，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株生長(zhǎng)曲線結(jié)果

如圖1所示，微生物固態(tài)發(fā)酵生長(zhǎng)曲線整體呈增長(zhǎng)-平穩(wěn)-下降趨勢(shì)。菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期主要集中在72～96 h。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分含量減少，不能滿足菌株生長(zhǎng)發(fā)育的需要，菌株數(shù)量不斷減少，生長(zhǎng)曲線逐漸降低。發(fā)酵菌株中混合菌，在72 h菌株數(shù)量達(dá)到峰值，生長(zhǎng)情況最好。干酪乳桿菌在120～144 h達(dá)到對(duì)數(shù)期，干酪乳桿菌較其他菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)間延后。

3.2 粗蛋白含量結(jié)果

蛋白質(zhì)是動(dòng)物新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等生理活動(dòng)必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，是動(dòng)物重要的營養(yǎng)源之一，對(duì)體組織、器官和細(xì)胞的形成、修補(bǔ)、增生以及酶類和激素功能的實(shí)現(xiàn)都是不可或缺的，其作用是其他營養(yǎng)物質(zhì)不可替代的［13］。

酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.102 3x?0.000 2，R2=0.999 5。如圖2所示，青蒿葉渣發(fā)酵后積累粗蛋白含量整體呈上升趨勢(shì)，青蒿葉渣發(fā)酵后與對(duì)照組比較，酵母菌發(fā)酵青蒿葉渣積累粗蛋白含量提高了71.15%（P＜0.05），提高程度最高，這可能與酵母菌含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸等有關(guān)；其次是植物乳桿菌B7，發(fā)酵后其粗蛋白含量提高了58.59%（P＜0.05）；瑞士乳桿菌發(fā)酵后其粗蛋白含量提高了55.45%（P＜0.05）。綜上，釀酒酵母菌適合應(yīng)用于發(fā)酵提高相關(guān)產(chǎn)品粗蛋白。

3.3 青蒿葉渣功效成分含量結(jié)果

雙氫青蒿酸和青蒿乙素標(biāo)準(zhǔn)品通過GC-MS檢測(cè)得到色譜圖和質(zhì)譜圖，通過對(duì)2種功效成分定量分析，比較發(fā)酵后雙氫青蒿酸和青蒿乙素功效成分含量變化。

由圖3可見，青蒿葉渣經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵，雙氫青蒿酸和青蒿乙素含量顯著提高，整體呈上升趨勢(shì)。數(shù)據(jù)顯示，青蒿葉渣經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后與對(duì)照組比較，雙氫青蒿酸和青蒿乙素含量分別提高了111.74%（P＜0.05）和71.15%（P＜0.05）；其次是瑞士乳桿菌，發(fā)酵后其雙氫青蒿酸含量提高了101.93%（P＜0.05）；青蒿葉渣經(jīng)丁酸梭菌發(fā)酵后，其青蒿乙素含量提高了82.67%（P＜0.05）。

圖1 青蒿葉渣固態(tài)發(fā)酵菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of solid fermentation strains of Artemisia annua leaf residue

3.4 混合菌發(fā)酵

根據(jù)上述單一菌種固態(tài)發(fā)酵青蒿葉渣后粗蛋白、雙氫青蒿酸、青蒿乙素含量變化結(jié)果，選擇酵母菌、植物乳桿菌及枯草芽孢桿菌組成混合菌，發(fā)酵青蒿葉渣。如圖4、圖5所示，青蒿葉渣經(jīng)混合菌固態(tài)發(fā)酵后，粗蛋白含量提高了61.73%（P＜0.05），雙氫青蒿酸含量提高了82.76%（P＜0.05），青蒿乙素含量提高了69.15%（P＜0.05）。混合菌固態(tài)發(fā)酵青蒿葉渣功效成分含量提升顯著，為探索青蒿葉渣作為動(dòng)物飼料添加劑的開發(fā)產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

圖2 青蒿葉渣固態(tài)發(fā)酵后粗蛋白含量Fig.2 Crude protein content of Artemisia annua leaf residue after solid-state fermentation

圖3 青蒿葉渣固態(tài)發(fā)酵后青蒿乙素、雙氫青蒿酸含量Fig.3 The content of artemisinin and dihydroartemisinic acid after solid-state fermentation of Artemisia annua leaf residue

3.5 飼喂試驗(yàn)結(jié)果分析

圖4 混合菌固態(tài)發(fā)酵青蒿葉渣后粗蛋白含量Fig.4 Crude protein content after solid-state fermentation of Artemisia annua leaf residue by mixed bac

圖5 混合菌固態(tài)發(fā)酵青蒿葉渣后雙氫青蒿酸、青蒿乙素含量Fig.5 The content of dihydroartemisinic acid and artemisinin after solid-state fermentation of Artemisia annua leaf residue by mixed bacteria

如圖6所示，青蒿葉渣混合菌發(fā)酵產(chǎn)物作為飼料添加劑飼喂羅曼灰雞群后，蛋殼的光澤度改善，亮度增加，顏色和蛋殼質(zhì)量改善不明顯（圖6A），紅糞情況明顯好轉(zhuǎn)，糞便成型，變細(xì)膩，羅曼灰雞的腸毒過料效果明顯（圖6B）。

圖6 青蒿葉渣混合菌固態(tài)發(fā)酵后雞蛋、糞便變化Fig.6 Changes of eggs and feces after solid fermentation of Artemisia annua leaf residue mixed bacteria

4 討論

中藥渣掩埋堆放不僅造成中藥資源浪費(fèi)，增加相關(guān)制藥企業(yè)支出［14］，開發(fā)中藥渣綜合利用新技術(shù)，提升中藥渣利用率。本研究選取里氏木霉、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌B7、酵母菌、畢赤酵母菌及復(fù)合菌株（釀酒酵母菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌）固態(tài)發(fā)酵青蒿葉渣，探索其作為動(dòng)物飼料添加劑的可能。粗蛋白含量是飼料添加劑的一個(gè)重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本研究結(jié)果顯示酵母菌固態(tài)發(fā)酵粗蛋白含量提高71.15%（P＜0.05），提高最大，適合用于發(fā)酵生產(chǎn)。

王梅等研究益生菌劑采用固態(tài)發(fā)酵模式發(fā)酵國產(chǎn)豆粕，以發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白與可溶性蛋白為指標(biāo)，與空白對(duì)照組比較，其中C（乳酸菌、釀酒酵母、母、中性蛋白酶）組粗蛋白含量提高47.11%，提升最高［15］。青蒿葉渣中未充分提取的功效成分含量影響著相關(guān)動(dòng)物保健產(chǎn)品的探索開發(fā)，青蒿藥渣經(jīng)地衣芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵雙氫青蒿酸和青蒿乙素分別提高了111.74%（P＜0.05）和71.15%（P＜0.05），功效成分提高最高，推測(cè)是地衣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，可對(duì)青蒿葉渣細(xì)胞壁降解，促進(jìn)功效成分釋放。但是地衣芽孢桿菌具有獨(dú)特的生物奪氧機(jī)制，不能和其他好氧微生物進(jìn)行混合發(fā)酵。綜合來看，釀酒酵母菌對(duì)蛋白提升最為顯著，在功效成分釋放上，枯草芽孢桿菌及植物乳桿菌提升顯著，也是常用益生菌，因此選擇釀酒酵母菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌作為混合菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行后續(xù)飼喂實(shí)驗(yàn)。

發(fā)酵青蒿渣產(chǎn)品的蛋雞飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛋殼亮度增加，雞群紅糞情況明顯好轉(zhuǎn)，糞便變得細(xì)膩，過料殘?jiān)黠@減少，推測(cè)與雙氫青蒿酸和青蒿乙素對(duì)雞腸道球蟲有明顯抑制作用，且益生菌分泌大量抑菌物質(zhì)，改善禽畜腸道內(nèi)環(huán)境有關(guān)。李姣清研究在雞的日料中按1 g·kg-1體重添加中藥復(fù)方制劑到半天的飲水中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方制劑對(duì)小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)有積極影響，可以增加腸道菌群多樣性，有效地改善腸道健康和功能，促進(jìn)雛雞的生長(zhǎng)［16］。周翠珍等用常山、青蒿、苦參、柴胡、地榆（炭）、白頭翁等組成的純中藥散劑，按照0.25%、0.5%、l%濃度給不同試驗(yàn)組雞混勻拌料飼喂，試驗(yàn)結(jié)果表明，l%純中藥散劑組0.5%純中藥散劑組的抗球蟲指數(shù)在160～180之間，為中效，2個(gè)劑量均能很好的控制人工感染柔嫩艾美耳球蟲病雞免于死亡，改善禽畜過料病癥，保護(hù)腸道健康［17］。所以青蒿葉渣采用微生物固態(tài)發(fā)酵模式，粗蛋白含量提高，殘留功效成分得到充分釋放，未來可作為動(dòng)物養(yǎng)殖飼料添加劑。

5 結(jié)論

本研究通過微生物固態(tài)發(fā)酵青蒿葉渣，發(fā)酵后粗蛋白、雙氫青蒿酸、青蒿乙素含量均較對(duì)照組有所提高。青蒿葉渣經(jīng)釀酒酵母菌發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量最高，經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后產(chǎn)物中雙氫青蒿酸、青蒿乙素含量最高。混合菌固態(tài)發(fā)酵青蒿葉渣使產(chǎn)物中功效成分含量得到較高提升，將其添加到動(dòng)物飼料中飼喂雞群，紅糞情況明顯好轉(zhuǎn)，尚不能明確益生菌和青蒿功效成分對(duì)雞腸道保健的作用機(jī)制。如將青蒿添加到動(dòng)物飼料目錄中，可使該研究結(jié)果為今后進(jìn)一步探索工廠化發(fā)酵生產(chǎn)青蒿動(dòng)物飼料添加劑提供參考依據(jù)。