鹽麩子對(duì)細(xì)胞氧化損傷及3T3-L1細(xì)胞分化的影響

蔡圣寶 張 璇 張成庭 胡小松 易俊潔*

（1 昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院 昆明650500 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

多酚類化合物是指化學(xué)結(jié)構(gòu)式中含有酚羥基的一類植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的總稱。多酚類物質(zhì)包括酚酸類、黃酮類、鞣酸單寧類和花色苷類[1]。在植物體中多酚的存在狀態(tài)主要有3 種：游離態(tài)多酚、酯化態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚[2]。游離態(tài)多酚中主要含有花色苷、原花青素和類黃酮類，酯化態(tài)多酚主要是酚酸類，結(jié)合態(tài)多酚則是與蛋白質(zhì)、葡萄糖、纖維素和木質(zhì)素等結(jié)合在一起的存在于植物初生壁和次生壁中[3]。研究表明多酚類物質(zhì)具有多種生物活性，例如，具有很強(qiáng)的活性氧和氧自由基的清除能力[4]，也具有抗菌、抗病毒和消炎的作用[5]。多酚類物質(zhì)還具有抗腫瘤和抗癌變的作用[6]，也可以降低心腦血管[7]和糖尿病等[8]疾病發(fā)生的可能性。

漆樹科鹽膚木屬包含250 多個(gè)植物種類[9]，主要分布于溫帶和熱帶地區(qū)，該屬植物在中國主要分布在云南、四川和貴州等地，在國外，絕大多數(shù)的鹽膚木屬分布在北美地區(qū)以及太平洋地區(qū)[9]。大多數(shù)鹽膚木屬植物常被用作植物園林景觀樹種[10]，除此之外，還有少部分被用來制作調(diào)味品[11]。鹽膚木屬植物適應(yīng)性非常強(qiáng)，耐干旱瘠薄，生長快，不占用其它農(nóng)作物用地[12]，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和較好的開發(fā)前景。鹽麩子是中國鹽膚木（Rhus chinensis Mill.）的果實(shí)，富含油脂，可以用來榨油，2013年1月4日衛(wèi)生部批準(zhǔn)中國鹽膚木的果油為新資源食品[13]。除此之外，鹽麩子也常常被當(dāng)?shù)厝擞米麽劥椎脑牧稀Ｓ醒芯勘砻鼷}麩子粕中含有13 種化合物，主要為槲皮素和原兒茶酸，其提取物能抑制PC12 細(xì)胞的凋亡[14]。段文昌[15]研究了鹽膚木不同生產(chǎn)期的果實(shí)中黃酮類化合物及其抗氧化作用，結(jié)果顯示，隨著果實(shí)成熟度的增加，鹽膚木果實(shí)中黃酮含量總體呈上升趨勢(shì)且其對(duì)羥自由基和O2-自由基有一定的清除效果。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹽麩子3 種溶劑提取物和3 種狀態(tài)多酚的提取物中主要組成成分為槲皮苷和楊梅苷[16-17]，另外，鹽麩子不同提取物還具有良好的DPPH 和ABTS 自由基清除能力以及抑制胰脂肪酶活性的作用。然而，對(duì)于這6 種提取物保護(hù)細(xì)胞免于H2O2損傷的作用以及抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的活性還未見報(bào)道。本文研究鹽麩子的不同酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用以及對(duì)前脂肪細(xì)胞3T3-L1-MBX 分化的抑制作用，以期為鹽麩子的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

成熟的鹽麩子采摘于云南騰沖 （2017年11月），貯藏在-20 ℃；2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、地塞米松、胰島素、MTT、胰蛋白酶-EDTA 消化液、羅格列酮、青霉素-鏈霉素、多聚賴氨酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、油紅O 染料，美國sigma-Aldrich 公司；凋亡試劑盒，北京四正柏公司；3T3-L1-MBX 前脂肪細(xì)胞，美國ATCC細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)、磷酸鹽緩沖溶液基，美國康寧公司；本研究中使用的所有標(biāo)準(zhǔn)品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。所有其它化學(xué)品和溶劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha 1-2 LD plus 冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；SpectraMax M5 多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司；Guava easyCyte 6-2L流式細(xì)胞儀，美國Millipore 公司；CCL-170B-8 CO2培養(yǎng)箱、AC2-6S1 Alrstream A2 生物安全柜，新加坡ESCO 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鹽麩子3 種溶劑提取物和3 種狀態(tài)多酚的提取 首先將鹽麩子用冷凍干燥機(jī)凍干，再用高速打粉機(jī)將其粉碎，過60 目篩，備用。不同溶劑提取步驟如下：鹽麩子粉（30 g）分別加入3 種提取溶劑（300 mL 80%甲醇、80%乙醇和80%丙酮）中，在25 ℃下，超聲提取30 min 后過濾，收集濾液，相同的提取條件下重復(fù)提取2 次。收集的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃下濃縮，除去有機(jī)試劑。將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥后獲得粉狀提取物，并保存在-20℃待用。

3 種狀態(tài)多酚的提取方法參考文獻(xiàn)[18-19]，并在此基礎(chǔ)上稍加修改。以料液比1∶5 加入正己烷，在室溫下振蕩15 min，重復(fù)3 次，對(duì)樣品進(jìn)行脫脂處理。脫脂的鹽麩子粉（30 g）中加入150 mL提取液（提取液為70%甲醇和70%丙酮按體積比1∶1 混合），于25 ℃條件下超聲提取30 min，過濾并收集濾液，此過程重復(fù)2 次。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)試劑，收集水相提取物，用于提取游離和酯化的餾分。游離態(tài)多酚的提取：采用6 mol/L 鹽酸將水相提取物的pH 值調(diào)至2，用乙醚和乙酸乙酯體積比為1∶1 的混合液萃取，直至萃取液無色為止。將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并凍干，得到游離態(tài)多酚，存儲(chǔ)在-20 ℃。酯化態(tài)多酚提?。涸谑覝叵?，向剩余水相中以1∶1 的體積比加入4 mol/L NaOH，水解4 h，隨后用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至2，剩余步驟與提取游離態(tài)多酚一致。結(jié)合態(tài)多酚提取：提取游離態(tài)多酚和酯化態(tài)多酚后，將剩余的固體殘?jiān)戳弦罕?∶1 加入4 mol/L NaOH 水解4 h，隨后用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至2，其余步驟同游離態(tài)多酚。這6 種提取物的酚類物質(zhì)組成及含量參考文獻(xiàn)[16-17]，主要組成成分為槲皮苷和楊梅苷。

1.3.2 鹽麩子對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

1.3.2.1 H2O2濃度選擇 用含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞，然后接種200 μL 濃度為1×104個(gè)/mL 的細(xì)胞于96 孔板中，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基后加入不同濃度的H2O2培養(yǎng)6 h。采用MTT 法檢測細(xì)胞存活率[20]，即向96 孔板中加入100 μL 的MTT 溶液（0.5 mg/mL）再培養(yǎng)4 h，去除MTT 溶液后加入200 μL 的DMSO 溶液，振蕩搖勻，于波長570 nm 處測定吸光值。

1.3.2.2 鹽麩子對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響 ROS 檢測方法參考文獻(xiàn)[21]，并稍加修改。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時(shí)，不存在細(xì)胞毒性，故在此質(zhì)量濃度下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的檢測。加入2 mL 濃度為2×104個(gè)/mL 的細(xì)胞于6 孔板中培養(yǎng)24 h，并設(shè)立空白組、氧化損傷模型組、樣品組和陽性對(duì)照組（VC）繼續(xù)培養(yǎng)24 h （其中空白組和氧化損傷模型組只加入新鮮培養(yǎng)基）。24 h 后，棄掉培養(yǎng)基，空白組加新鮮培養(yǎng)基，其余組加入選定濃度的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后用胰酶消化細(xì)胞，用含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，并用PBS 清洗細(xì)胞。加入1 mL 的DCFH-DA（10 μmol/L）于培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后用無血清培養(yǎng)基清洗掉多余探針，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平。

1.3.3 鹽麩子抑制H2O2誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡的檢測 細(xì)胞凋亡檢測參照文獻(xiàn)[22]以及試劑盒說明書，操作步驟同ROS 測定步驟。首先用H2O2處理6 h，之后用離心管收集培養(yǎng)基，并用胰酶消化細(xì)胞，吸入離心管中，混合均勻，離心收集細(xì)胞。用400 μL 的1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC，避光反應(yīng)15 min 后加入10 μL 的PI 染色液混勻，孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測各組的細(xì)胞凋亡水平。

1.3.4 鹽麩子對(duì)3T3-L1-MBX 前脂肪細(xì)胞的作用

1.3.4.1 前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 取1.5 mL 2×104個(gè)/mL 活力很好的3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞，接于經(jīng)多聚賴氨酸處理后的24 孔板中，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。當(dāng)細(xì)胞長滿后，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。向24 孔板中加入分化培養(yǎng)基（由1.0 μmol/L 的地塞米松，0.5 mmol/L 的IBMX，4 μg/mL 的胰島素，2 μmol/L的羅格列酮溶液，90% DMEM 以及10% FBS 構(gòu)成） 繼續(xù)培養(yǎng)3 d，隨后加入維持培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d（由4 μg/mL 的 胰 島 素，90% DMEM 以 及10%FBS 構(gòu)成）。誘導(dǎo)分化期間每隔2 d 換1 次培養(yǎng)基。

1.3.4.2 鹽麩子提取物抑制3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化 前期研究發(fā)現(xiàn)，鹽麩子的3 種溶劑提取物和3 種狀態(tài)多酚提取物中最主要的酚類成分為楊梅苷和槲皮苷，同時(shí)前期試驗(yàn)表明鹽麩子3種溶劑提取物和3 種狀態(tài)多酚提取物以及楊梅苷和槲皮苷在60 μg/mL 時(shí)，對(duì)3T3-L1-MBX 前脂肪細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性[16-17]。因此，將鹽麩子的3 種溶劑提取物，3 種狀態(tài)多酚提取物以及2 種主要酚類物質(zhì)——楊梅苷和槲皮苷分別加入分化培養(yǎng)基以及維持培養(yǎng)基內(nèi)，使得最終樣品質(zhì)量濃度均為60 μg/mL，并設(shè)立空白組 （只有含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基） 和對(duì)照組（不含樣品的分化培養(yǎng)基）。培養(yǎng)11 d 后，用油紅O 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并觀察脂肪細(xì)胞生長情況，最后用異丙醇對(duì)油紅O 染料進(jìn)行溶解，并在波長490 nm 下檢測各組吸光值，計(jì)算各樣品對(duì)抑制3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的抑制率。

1.3.4.3 對(duì)誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色油紅染色方法參考文獻(xiàn)[23]，并在此基礎(chǔ)上稍加修改。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用PBS 緩沖溶液清洗2 次后加入10%的甲醛溶液在室溫下將細(xì)胞固定30 min，采用PBS 緩沖溶液和純水清洗3 遍，洗掉剩余的甲醛溶液。加入1.2 mg/mL 的油紅O 染料（按水和異丙醇體積比4∶6 配制）在室溫下染色10 min。染色結(jié)束后吸出多余油紅O 液體，并用純水清洗3 遍，在顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞狀態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，每組試驗(yàn)做3 次平行。采用Tukey 單因素方差分析（P<0.05）。所有數(shù)據(jù)均用Origin 8.5 處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽麩子對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.1.1 H2O2濃度選擇 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞存活率影響的結(jié)果如圖1所示。由圖可知，隨H2O2濃度逐漸增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，均與空白組有顯著差異（P＜0.05）。根據(jù)文獻(xiàn)[22]報(bào)道，當(dāng)細(xì)胞存活率在50%左右時(shí)，氧化損傷模型構(gòu)建效果較好。本研究中，當(dāng)H2O2濃度在0.2～0.7 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率雖然在下降，但對(duì)細(xì)胞的損傷較輕，建模效果不好。當(dāng)H2O2濃度為0.8～0.9 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率為55%左右，而且細(xì)胞存活率在此濃度范圍內(nèi)沒有顯著差異（P＞0.05）。然而當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)增大到1 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率下降到48%左右，因此，最終選定采用1 mmol/L 的H2O2用于細(xì)胞損傷。雖然也有文獻(xiàn)報(bào)道[24]采用2 mmol/L 的H2O2，這可能是由于H2O2生產(chǎn)廠家批次以及細(xì)胞培養(yǎng)條件差異所致。

2.1.2 鹽麩子對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響 鹽麩子不同提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響結(jié)果如圖2、圖3所示。由圖可知，當(dāng)用1 mmol/L 的H2O2誘 導(dǎo)HepG2 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS 含量與空白組相比顯著增多（P＜0.05）。將空白組細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平定為100%，經(jīng)H2O2誘導(dǎo)過的HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量增至380%，增加了3.8 倍。經(jīng)過5 μg/mL 的VC處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS 含量為210%，顯著低于H2O2組（P＜0.05）。另外，經(jīng)過80 μg/mL 的鹽麩子乙醇提取物、甲醇提取物、丙酮提取物以及游離態(tài)多酚處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著低于H2O2組（P＜0.05），與空白組ROS 含量基本相當(dāng)，并且這4 種提取物處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS 含量之間也沒有顯著性差異（P＞0.05）。同樣經(jīng)過80 μg/mL 鹽麩子的酯化態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著低于H2O2組（P＜0.05），然而相比上述4 種提取物，酯化態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的抑制作用較弱，其含量分別為260%和350%。有研究報(bào)道，苦菊提取物也對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的氧化損傷引起的ROS 增高有改善作用[25]，然而保護(hù)作用最好的情況下，所用苦菊提取物的質(zhì)量濃度為100 μg/mL，高于本試驗(yàn)所用質(zhì)量濃度。

圖2 鹽麩子的6 種提取物對(duì)H2O2 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.2 The effects of six extracts of Rhus chinensis Mill.fruits on ROS level in the H2O2-induced HepG2

2.2 鹽麩子對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡率的影響

鹽麩子對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡的結(jié)果如圖4、圖5所示。由于在正常生長過程中也會(huì)有細(xì)胞凋亡，故空白組細(xì)胞的凋亡率為5.95%。當(dāng)HepG2 細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞凋亡率為空白對(duì)照組的3 倍（P＜0.05），并且由流式圖可知，H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡主要為中晚期凋亡。與氧化損傷模型組相比，陽性對(duì)照VC 對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡沒有顯著的保護(hù)作用，其細(xì)胞凋亡率同氧化損傷模型組沒有顯著性差異（P＞0.05），并且VC 組細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在早期凋亡。經(jīng)過鹽麩子80 μg/mL 乙醇提取物、甲醇提取物、丙酮提取物和游離態(tài)多酚處理，可以顯著抑制H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），并且這4 種提取物的抑制作用效果無顯著性差異 （P＞0.05）。同時(shí)，80 μg/mL 的酯化態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚也能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的凋亡，并且酯化態(tài)多酚的作用要強(qiáng)于結(jié)合態(tài)多酚，然而與上述4種提取物相比，其抑制凋亡作用較弱（P＜0.05）。有研究表明[22]，紫米多酚提取物在100 μg/mL 時(shí)能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，凋亡率減少了3 倍，而鹽麩子乙醇提取物、甲醇提取物、丙酮提取物和游離態(tài)多酚在80 μg/mL 時(shí)，也能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的凋亡（P＜0.05）。除此之外，鹽麩子的6 種提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡抑制作用的趨勢(shì)同其對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的抑制作用趨勢(shì)相同，表明鹽麩子不同提取物可能是通過減少細(xì)胞內(nèi)的ROS 生成，從而減少細(xì)胞的凋亡，由這些結(jié)果可以說明鹽麩子對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的氧化損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。因此，鹽麩子可以作為很好的天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)，應(yīng)用于食品和保健行業(yè)。

圖3 鹽麩子的6 種提取物（80 μg/mL）對(duì)H2O2（1 mmol/L）誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.3 The effects of six extracts of Rhus chinensis Mill.fruits （80 μg /mL） on ROS level in the H2O2-induced （1 mmol/L） HepG2

圖4 鹽麩子的6 種提取物（80 μg/mL）對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effects of six extracts of Rhus chinensis Mill.fruits （80 μg/mL） on the apoptosis in the H2O2-induced HepG2

圖5 鹽麩子6 種提取物（80 μg/mL）對(duì)H2O2（1 mmol/L）誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 The effects of six extracts of Rhus chinensis Mill.fruits （80 μg/mL） on the apoptosis in the H2O2-induced （1 mmol/L） HepG2

2.3 鹽麩子對(duì)3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的作用

鹽麩子不同提取物及楊梅苷和槲皮苷對(duì)3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的作用如圖6所示。由圖6可知，空白組的細(xì)胞基本沒有分化成脂肪細(xì)胞，而加了誘導(dǎo)分化液的對(duì)照組的3T3-L1 MBX前脂肪細(xì)胞很大一部分細(xì)胞都分化成了脂肪細(xì)胞，經(jīng)過油紅O 染色后顯示為紅色。甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物和游離態(tài)多酚處理后細(xì)胞分化率顯著降低。另外，相較于對(duì)照組來說，槲皮苷和結(jié)合態(tài)多酚對(duì)3T3-L1 MBX 的分化也有一定的抑制作用，然而與上述4 種提取物相比，其抑制作用較弱。酯化態(tài)多酚和楊梅苷對(duì)3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞的分化基本沒有抑制作用。

圖6 鹽麩子6 種提取物及楊梅苷和槲皮苷（60 μg/mL）對(duì)3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的影響（100×）Fig.6 The effects of six extracts of Rhus chinensis Mill.fruits，myricitrin and quercitrin （60 μg/mL）on differentiation of 3T3-L1 preadipocytes （100×）

圖7 分化的脂肪細(xì)胞的相對(duì)脂肪含量Fig.7 The relative fat content of differentiated adipocytes

利用異丙醇將細(xì)胞內(nèi)的油紅O 溶解后，在波長490 nm 處測定吸光值，進(jìn)一步確定各樣品對(duì)3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。將空白組的脂肪含量設(shè)為100%，檢測各樣品處理后的試驗(yàn)組分化細(xì)胞的相對(duì)脂肪含量，其結(jié)果如圖7所示。對(duì)照組的相對(duì)脂肪含量比空白組增加了約2.7 倍。而甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物和游離態(tài)多酚試驗(yàn)組之間，相對(duì)脂肪含量沒有顯著性差異（P＞0.05），含量約為空白組的1.25 倍，與對(duì)照組相比含量顯著下降（P＜0.05）。結(jié)合態(tài)多酚和槲皮苷試驗(yàn)組細(xì)胞中脂肪含量同空白組相比，存在顯著性差異（P＜0.05），含量約為空白組的2倍，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。而酯化態(tài)多酚和楊梅苷試驗(yàn)組的相對(duì)脂肪含量，同對(duì)照組相比沒有顯著性差異 （P＞0.05），與圖6觀察結(jié)果一致。結(jié)合圖6和圖7可知，甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物和游離態(tài)多酚試驗(yàn)組具有較好抑制3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的作用，而槲皮苷和楊梅苷對(duì)其抑制作用較弱。因此，推測提取物中可能存在其它對(duì)3T3-L1 MBX 分化存在抑制作用的活性物質(zhì)，也有可能是提取物中多種物質(zhì)協(xié)同作用，從而發(fā)揮出抑制3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的效果，這些推測需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

3 結(jié)論

本文以鹽麩子為原料，采用3 種溶劑（80%甲醇、80%乙醇和80%丙酮） 對(duì)其多酚組分進(jìn)行提取，并提取了鹽麩子中的游離態(tài)多酚、酯化態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚，系統(tǒng)地探討了鹽麩子不同酚類提取物對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用以及抑制3T3-L1MBX 前脂肪細(xì)胞分化的活性。結(jié)果表明，鹽麩子的3 種溶劑提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷具有良好的保護(hù)作用，能顯著降低細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量，減少細(xì)胞凋亡，并且這3 種提取物之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。鹽麩子的3 種狀態(tài)多酚提取物中，游離態(tài)多酚對(duì)HepG2 誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)，其次是酯化態(tài)多酚，最后是結(jié)合態(tài)多酚。鹽麩子的甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物和游離態(tài)多酚在60 μg/mL時(shí)具有較強(qiáng)的抑制3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的作用，而鹽麩子的結(jié)合態(tài)多酚以及主要多酚槲皮苷對(duì)3T3-L1 MBX 前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用較弱，酯化態(tài)多酚和楊梅苷幾乎沒有抑制作用。綜上所述，鹽麩子不同酚類提取物具有較好的生物活性，可進(jìn)行進(jìn)一步的研究和開發(fā)利用。