20批不同產(chǎn)地桂枝質(zhì)量研究

于天穎 周勁松 馬恩耀 羅文英 吳志堅(jiān) 黨院霞 孔箭

摘要：目的 對(duì)20批不同產(chǎn)地桂枝的質(zhì)量進(jìn)行比較與分析。方法 采用薄層色譜法對(duì)桂皮醛及桂枝對(duì)照藥材進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)依照2015年版《中國藥典》（一部）“桂枝”項(xiàng)下進(jìn)行顯微、水分、灰分檢查及浸出物含量測(cè)定。采用揮發(fā)油測(cè)定方法測(cè)定其含有的揮發(fā)油含量，采用高效液相色譜（HPLC）方法測(cè)定桂枝中含有的桂皮醛含量。并結(jié)合聚類分析及主成分分析方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 桂枝顯微特征明顯，薄層色譜斑點(diǎn)明顯，不同產(chǎn)地的桂枝其水分含量范圍在8.20%～10.83%;總灰分含量范圍在0.56%～2.56%;醇溶性浸出物含量范圍在6.14%～9.57%;揮發(fā)油含量范圍在0.95%～1.66%;桂皮醛含量范圍在1.01%～3.03%。結(jié)論 通過聚類分析得，可將20批不同產(chǎn)地的桂枝藥材分為3類，結(jié)合主成分分析結(jié)果，其中廣西平南的桂枝藥材質(zhì)量最好。

關(guān)鍵詞：桂枝;桂皮醛;揮發(fā)油;聚類分析;主成分分析

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-2349（2020）10-0057-06

桂枝，別名柳桂（Cinnamomum cassia Presl），是樟科植物肉桂的干燥嫩枝，主產(chǎn)于廣西、廣東、福建、云南等地[1]。味辛，溫，入肺、心、膀胱經(jīng)，是我國傳統(tǒng)常用中藥，藥用歷史悠久，在抗腫瘤、抗菌以及心腦血管保護(hù)、抗病毒等方面具有良好的藥理活性[2-6]。

桂枝除含有桂皮醛、桂皮酸等還含有其他豐富的化學(xué)物質(zhì)[7]。桂皮醛作為桂枝的基本化學(xué)成分，在去熱、消痛、抗菌、消炎及其它方面效果明顯[8]。由于桂枝的有效成分桂皮醛為揮發(fā)油，在儲(chǔ)存過程中有可能因儲(chǔ)存環(huán)境而損失，導(dǎo)致藥效無法達(dá)到理想效果。所以測(cè)定其含有的揮發(fā)油含量具有極為重要的意義。

楊松等[9]運(yùn)用高效液相色譜指紋圖譜法等方法對(duì)不同產(chǎn)地和不同采收季節(jié)的桂枝樣品，為桂枝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究打下基礎(chǔ)。國內(nèi)多為對(duì)桂枝合成藥物如栝樓桂枝滴丸[10]，栝樓桂枝顆粒[11]，桂枝茯苓膠囊[12]等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，對(duì)桂枝藥材做詳細(xì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究少見。

已有文獻(xiàn)研究中，對(duì)不同產(chǎn)地桂枝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全方面的研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)收集了廣東、廣西、安徽、四川以及福建等的20批桂枝藥材，采用定性及定量分析方法對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)合聚類分析及主成分分析比較不同產(chǎn)地的相關(guān)性，全面評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地桂枝的質(zhì)量，為桂枝藥材的產(chǎn)地選擇提供依據(jù)，同時(shí)為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BSA225S-CW分析天平（賽多利科學(xué)儀器（北京）有限公司），RHP-100型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康榮浩工貿(mào)有限公司），CX51RF型生物數(shù)碼攝影顯微鏡（JAPAN OLYMPUS CORPORATION），79-1磁力加熱攪拌器（常州澳華儀器有限公司），GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)習(xí)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），KSW型電阻爐溫度控制器（余姚金電儀表有限公司），HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司），HY-2調(diào)速多用振蕩器（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠），TC-15套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠），UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）。

1.2 試劑與試藥 水合氯醛、甘油（AR，均購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、乙醇、甲醇、石油醚、乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯（AR，均購自廣州化學(xué)試劑廠）。乙腈（色譜純，美國Fisher公司）;水為純水。

桂皮醛對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110710-201418，含量以98.9%計(jì)），桂枝對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：21191-201605）。

1.3 樣品 桂枝藥材共收集了20批，其批號(hào)和產(chǎn)地見下表1。經(jīng)高明教授鑒別確認(rèn)為樟科植物桂枝。

2 方法

2.1 顯微鑒別 照《中國藥典》2015版四步通則2001 顯微鑒別法檢測(cè)。

2.2 薄層鑒別 （1）取本品粉末0.5 g，加乙醇10mL，密塞，浸泡20 min，時(shí)時(shí)振搖，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取桂皮醛對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含1 μl的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μl～15μl、對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯（17：3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙紅色斑點(diǎn)。（2）取本品粉末2 g，加乙醚10mL，浸泡30 min，時(shí)時(shí)振搖，濾過，濾液揮干，殘?jiān)尤燃淄?mL使溶解，作為供試品溶液。另取桂枝對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各15μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使成條狀，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17：3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.3 水分 照《中國藥典》2015版四步通則0832 水分測(cè)定法之第四法測(cè)定。

2.4 總灰分 照《中國藥典》2015版四步通則2302 灰分測(cè)定法測(cè)定。

2.5 浸出物 照《中國藥典》2015年版四部通則2201 浸出物測(cè)定法之醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用95%乙醇作溶劑。

2.6 含量測(cè)定 照《中國藥典》2015年版四部通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法測(cè)定。

2.7 桂皮醛含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-水（32：68，v/v）;流速：1 mL·min-1;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長：290 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取桂皮醛對(duì)照品約20 μg，置2 mL容量瓶中，加入適量的甲醇使溶解并稀釋至刻度，振蕩均勻，用0.45微孔濾膜過濾，濾液即為對(duì)照品溶液（每1 mL含桂皮醛10 μg）。

2.7.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取過四號(hào)篩桂枝粉末約0.5 g，置錐形瓶中，嚴(yán)封，準(zhǔn)確量取甲醇25 mL，稱定重量，使用超聲波清洗器超聲提取30 min，冷卻后稱定重量，滴加甲醇至超聲提取前的重量，振蕩均勻倒入帶有濾紙的干凈漏斗中濾過，準(zhǔn)確吸取續(xù)濾液1 mL倒入規(guī)格為25 mL的容量瓶中，加甲醇把續(xù)濾液稀釋至刻度，振蕩均勻，用0.45微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。

2.7.4 方法學(xué)考察

2.7.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.7.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積并計(jì)算。

2.7.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為YPA3J00001的桂枝樣品3份，準(zhǔn)確稱量，按“2.7.3”項(xiàng)下辦法配制供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算其峰面積。

2.7.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為YPA3J00001的桂枝樣品0.5 g，準(zhǔn)確稱量，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并于0、2、4、6、8 h按“儀器與方法2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算其含量。

2.7.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為YPA3J00001的桂枝樣品0.5 g，精密稱量6份，計(jì)算樣品中桂皮醛含量。再分別加入桂皮醛對(duì)照品溶液1 mL，并按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液。測(cè)定并計(jì)算桂皮醛含量，計(jì)算回收率。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 顯微鑒別 顯微鏡下觀察，桂枝粉末有明顯的韌皮纖維、石細(xì)胞、木栓細(xì)胞、木纖維及油細(xì)胞明顯。由可以看出韌皮纖維多成束存在;石細(xì)胞壁厚，類橢圓形;木栓細(xì)胞多角形，含紅棕色物;木纖維條狀;油細(xì)胞橢圓形;導(dǎo)管為具緣紋孔導(dǎo)管。如圖1所示。

桂枝藥材橫切面能見明顯的表皮細(xì)胞、油細(xì)胞及石細(xì)胞，形成層明顯，髓部發(fā)達(dá)。如圖2所示。

3.2 薄層鑒別 如圖3所示。在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，各產(chǎn)地藥材顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

如圖4所示，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，各產(chǎn)地藥材顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

3.3 水分、浸出物、總灰分及含量測(cè)定 對(duì)20批不同產(chǎn)地桂枝進(jìn)行水分檢查，對(duì)20批樣品進(jìn)行水分含量測(cè)定，其水分含量在8.26%～10.83%之間，其灰分含量在0.56%～2.56%之間，其浸出物含量在6.14%～9.57%之間，其揮發(fā)油含量在0.95%～1.66%之間，其桂皮醛含量在1.01%～3.03%之間，結(jié)果如表3所示。20批桂枝供試品及其對(duì)照品高效液相色譜圖如圖5～6所示。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度試驗(yàn) 根據(jù)“2.7.4.1項(xiàng)”下測(cè)得峰面積結(jié)果為：3.6074、3.5942、3.6088、3.6122、3.5953、3.5933。測(cè)定桂皮醛峰面積RSD為1.0%。表明含量測(cè)定的樣品溶液進(jìn)樣的精密度良好。

3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)“2.7.4.2項(xiàng)”下測(cè)得峰面積結(jié)果為：5.8462、5.8493、5.8541。得到桂皮醛峰面積RSD為0.4%。表明該方法的重復(fù)性良好。

3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)“2.7.4.3項(xiàng)”下計(jì)算得含量為：2.29%、2.28%、2.29%。得到桂皮醛含量RSD為0.5%。表明樣品在8 h內(nèi)性質(zhì)保持穩(wěn)定。

3.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)“2.7.4.4項(xiàng)”下計(jì)算加樣回收率。結(jié)果如表4。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.5 主成分分析 運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25軟件，對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行主成分分析，首先得出其特征值和貢獻(xiàn)率，結(jié)果如下。

由表5可得，主成分1的貢獻(xiàn)率最高，為75.565%，主成分2的貢獻(xiàn)率為20.790%。主成分1的特征值大于1，表明主成分1基本可以包含20批不同產(chǎn)地的桂枝藥材所檢測(cè)指標(biāo)的大部分信息，因此用這1個(gè)主成分代替原來4個(gè)指標(biāo)，用來評(píng)價(jià)20批不同產(chǎn)地桂枝藥材的質(zhì)量水平。

由表6可得，主成分1中各成分的貢獻(xiàn)均為正值。浸出物、揮發(fā)油和桂皮醛的指標(biāo)差異不大，且貢獻(xiàn)最大。

由表7可得，Y1為主成分1的分析得分值，Y為綜合評(píng)分值。在主成分1中，負(fù)評(píng)分和正評(píng)分的桂枝藥材產(chǎn)地基本各占一半，除廣西桂平外，其他差異不大。而廣西平南的主成分1最高，說明其桂枝藥材的主成分1占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。且由表10得，主成分1對(duì)總體的貢獻(xiàn)率更大。最終得出結(jié)論：廣西平南的桂枝藥材質(zhì)量最好，安徽合肥的評(píng)分最低，質(zhì)量在20批桂枝藥材中質(zhì)量最次。

3.6 聚類分析結(jié)果 運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25軟件，得到聚類分析樹狀譜系圖，由圖7可得，將20批不同產(chǎn)地的桂枝藥材分為3類，交點(diǎn)以左即為各類的主成成分。其中1-9為第一類，10-12為第二類，13-20為第三類。

4 討論

目前已報(bào)道文獻(xiàn)中對(duì)桂枝藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)較為單一，更多的是根據(jù)藥典對(duì)其含量測(cè)定條件的優(yōu)化。選取單一指標(biāo)并不能很好的評(píng)價(jià)桂枝藥材質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)增加樣品批數(shù)，選取20批不同產(chǎn)地桂枝藥材，對(duì)其進(jìn)行定性及定量等全方面考察，以此來考察不同產(chǎn)地桂枝藥材的質(zhì)量，同時(shí)為桂枝藥材產(chǎn)地的選擇提供很好的依據(jù)。

對(duì)20批不同產(chǎn)地桂枝藥材進(jìn)行水分含量測(cè)定可知，含水量在8.26%～10.83%之間，均符合藥典規(guī)定[13]?；曳址从乘幉闹心嗷曳滞梁蜕笆牧?，以及生理灰分的量，20批不同產(chǎn)地桂枝藥材的灰分在0.56%～2.56%之間，均也符合藥典規(guī)定。桂枝藥材在儲(chǔ)存和運(yùn)輸中揮發(fā)油很容易損失，因此揮發(fā)油含量可以很好的評(píng)價(jià)桂枝藥材的質(zhì)量，對(duì)20批不同產(chǎn)地桂枝藥材進(jìn)行揮發(fā)油測(cè)定可知，含量在0.95%～1.66%之間，以廣西平南所含揮發(fā)油含量最高。HPLC測(cè)定可知，其桂皮醛含量在1.01%～3.03%之間，均符合藥典規(guī)定。采用聚類分析將20批產(chǎn)地桂枝藥材分為3類，其廣西平南的桂枝藥材質(zhì)量最好。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)20批不同產(chǎn)地桂枝藥材進(jìn)行全面質(zhì)量評(píng)價(jià)，確定不同產(chǎn)地桂枝藥材質(zhì)量優(yōu)劣，不同產(chǎn)地桂枝藥材含量差異較大，在聚類分析中，未發(fā)現(xiàn)含量與地域相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)為不同產(chǎn)地桂枝藥材的選擇提供了理論依據(jù)。

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