基于同步熒光光譜與化學計量學快速分析花生油氧化規(guī)律

張微微，孫艷輝，顧海洋，呂日琴，王文政

滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000

引 言

花生油營養(yǎng)豐富，氣味芬芳，深受人們喜愛[1]?；ㄉ驮趦Σ嘏c使用過程中的品質(zhì)優(yōu)劣與食品工業(yè)的發(fā)展和人們的健康息息相關。油脂中不飽和脂肪酸的氧化是引起油脂酸敗的主要原因。油脂氧化產(chǎn)物除了影響食用油風味、色澤等，還會縮短貨架期、降低油脂品質(zhì)[2]。氧化穩(wěn)定性是衡量油脂品質(zhì)的重要質(zhì)量指標[3-4]。目前油脂氧化穩(wěn)定性的研究主要有烘箱法和Rancimat法(氧化酸敗法)。烘箱法主要通過化學滴定、高效液相色譜法或氣相色譜法測定常規(guī)化學組分，例如過氧化值、酸值、對苯胺值等代謝揮發(fā)性化合物[4]； Rancimat法直接通過在線測量食用油氧化穩(wěn)定性而被用于評價油質(zhì)[5]。然而，由于這些方法的低靈敏度、樣品的預處理復雜、耗時長與獲取信息的單一性使得測定方法受到限制。

熒光光譜技術是一種具有高靈敏度和快速高效分析的技術。食用油中存在的熒光物質(zhì)使得熒光技術在油脂氧化程度監(jiān)控和鑒別應用方面得到迅速發(fā)展[6-7]。與常規(guī)熒光技術相比，同步熒光光譜技術在激發(fā)與發(fā)射波長之間保持波長間距(Δλ)條件下同時進行掃描，獲取涵蓋更多有效信息的三維熒光光譜[8]，更有利于多組分混合物的定性分析和物質(zhì)鑒別。Sikorska等利用同步熒光光譜技術量化了食用蔬菜籽油中的生育酚物質(zhì)[9]。數(shù)學統(tǒng)計研究發(fā)現(xiàn)熒光強度與脂質(zhì)氧化產(chǎn)物存在高度相關性，因此化學計量學結合光譜技術快速評價油脂品質(zhì)效果顯著[10]。平行因子分析法(PARAFAC)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析法(ANN)、主成分分析法(PCA)等是光譜數(shù)據(jù)處理與相關化學指標間關系最常用的計量學工具，并被廣泛應用在油脂領域[4,11]。

本研究目的是結合化學計量工具與同步熒光法建立模型，獲取一種簡捷的油脂氧化過程檢測方法，實時監(jiān)控食用油在氧氣影響下貯藏過程中的氧化歷程，為油質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

OXITEST油脂氧化穩(wěn)定性測定儀： 意大利VELP公司； Cary Eclipse熒光分光光度計(美國瓦里安有限公司)； ZJ-609型冷熱雙用榨油機(東莞市房太電器有限公司)。

冷榨花生油： 紅皮花生(購自本地超市)不經(jīng)過炒制，采用微波處理后直接螺旋壓榨制??； 熱榨花生油： 直接購自市場糧油店； 乙醚、三氯甲烷、冰乙酸： 國藥集團化學試劑有限公司； 超純水： 實驗室超純水機制取(UP300-E UAF，上海和泰儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 花生油加速氧化試驗

通過OXITEST油脂氧化測定儀測定花生油90 ℃下氧化曲線。稱取5.0 g樣品置于托盤中，空氣流量為 6 bar，達到設定溫度后開始測定。設定加熱溫度90 ℃，測定氧化誘導期(induction period，IP)，采集不同氧化時間點的樣本三維同步熒光光譜信息和理化指標。

1.2.2 花生油品質(zhì)指標測定

酸價測定參照GB 5009.229—2016，過氧化值測定參照GB 5009.227—2016。

1.2.3 同步熒光光譜采集

利用熒光分光光度計采集同步熒光光譜數(shù)據(jù)。將油樣品放置在1 cm的石英比色皿中，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm。激發(fā)波長200～800 nm，Δλ10～180 nm，間隔10 nm，同步掃射，繪制熒光強度、Δλ、激發(fā)波長三維圖譜顯示氧化程度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗重復3次。三維熒光光譜數(shù)據(jù)利用平行因子法對數(shù)據(jù)進行降維信息解析，對物質(zhì)組分以及組分類型進行有效識別。為避免一些缺點，PARAFAC模型組分數(shù)N的選擇通過殘差平方和來進行[4,11]。二維熒光光譜數(shù)據(jù)和氧化指標(過氧化物或酸值)分別作為輸入數(shù)據(jù)和輸出數(shù)據(jù)，分別按照比例被設計成測試數(shù)據(jù)，剩余數(shù)據(jù)選擇作為訓練數(shù)據(jù)，通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(ANN)建立回歸模型。PARAFAC和ANN方法由Matlab R2010(MathWork,Inc.,Natick,MA,USA)軟件運行分析。

2 結果與討論

2.1 花生油90 ℃下的氧化穩(wěn)定性

通過測定油脂樣品氧化誘導期能快速表明油脂樣品的氧化穩(wěn)定性。同一環(huán)境條件下氧化誘導時間越長說明該油脂氧化穩(wěn)定性越好，反之，油脂樣品氧化穩(wěn)定性越差。通過VELP型油脂氧化穩(wěn)定性測定儀器測定90 ℃下花生油氧化誘導期，結果見圖1。由圖1可知，冷榨花生油的氧化誘導期低于熱榨花生油，表明冷榨花生油對溫度較為敏感，氧化穩(wěn)定性較熱榨花生油差，更容易被氧化，主要原因在于熱榨花生油中VE含量較高，而且花生熱榨時由于梅拉德反應分解產(chǎn)物產(chǎn)生抗氧化作用，進一步提高了其氧化穩(wěn)定性[12-13]。熱榨方式中花生經(jīng)過高溫焙炒，可以有效提高油脂的氧化穩(wěn)定性，延長貨架期[14]。

圖1 90 ℃下不同工藝花生油氧化誘導期Fig.1 Induction period of Peanut oil under differentprocess at 90 ℃

2.2 花生油氧化誘導曲線

食用油氧化要經(jīng)過一個誘導期，該過程反應緩慢，之后進入反應比較迅速的氧化期，隨后曲線平緩即進入氧化靜止期[15]。OXITEST油脂氧化分析儀主要一般給予樣品較高的溫度和壓力進行加速試驗，曲線平滑的區(qū)段稱之為誘導期，是該儀器表征油脂或含油食品最主要的參數(shù)。OXITEST法所配備的軟件能夠自動處理數(shù)據(jù)得到誘導期，圖2是不同工藝花生油氧化誘導曲線。由圖2可知，在自然氧化過程中，不同工藝花生油在氧氣充足條件下氧化初期經(jīng)歷時期較長，一旦到達誘導期(冷榨花生油為16.5 h，熱榨花生油為19.8 h)后，快速進入氧化期直至靜止期，油脂徹底變質(zhì)，氧化狀態(tài)趨于穩(wěn)定。而隨著時間的延長，冷榨花生油進入氧化期早于熱榨花生油，主要原因在于本實驗室冷榨花生油原料紅皮花生本身品質(zhì)和微波處理。油脂氧化過程理想評價方法是能夠提供油脂氧化歷程和不同產(chǎn)物變化動態(tài)信息，并具備一定靈敏度和準確度，且適合于較長時間的固定檢測。由此，氧化過程中需要同時獲取光譜及相關氧化指標，以便更好地了解氧化過程。

圖2 不同工藝花生油氧化誘導曲線Fig.2 Oxidizing induction curve of Peanut oilunder different process

2.3 不同氧化歷程花生油三維熒光光譜圖

圖3主要顯示不同工藝下制取花生油的不同氧化歷程在激發(fā)波長為200～800 nm，Δλ為10～180 nm的三維熒光光譜圖。圖3表明兩種花生油在氧化過程中，激發(fā)波長300～400 nm處的強熒光峰位置紅移。冷榨花生油該處熒光峰在氧化誘導期變?nèi)?，之后逐漸增強，而熱榨花生油該處強熒光峰在氧化誘導期峰寬增加，之后強熒光區(qū)域熒光強度減弱，峰寬變窄，且600～700 nm處熒光峰消失。從圖3可知，冷榨和熱榨花生油原油三維熒光圖譜存在顯著差異。冷榨花生油原油只有一個熒光峰，波峰波長在344 nm附近，該區(qū)域主要表征蛋白質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)； 而熱榨花生油原油有3個熒光峰，其波峰位置分別在400，600和670 nm附近，對應區(qū)域分別是生育酚、色素等具有熒光基團物質(zhì)和葉綠素a和b。兩者光譜的差異主要是由于原料樣品處理及不同工藝引起[16-18]。在氧化誘導期，冷榨花生油波峰位置向長波方向移動，其熒光強度明顯減弱。熱榨花生油在氧化誘導期峰寬變寬，強度減弱，而進入氧化期后，600～700 nm熒光峰消失，峰位置在420 nm附近，峰變窄； 進入靜止期后，峰位置不變，熒光強度增強。隨著氧化時間增長，油脂營養(yǎng)物質(zhì)被分解產(chǎn)生共軛雙烯、醛等小分子氧化產(chǎn)物，致使熒光光譜產(chǎn)生斯托克位移(Stocks shift)，而且氧化程度越深，其熒光基團物質(zhì)含量隨之急劇增加，熒光強度增強[19]，直至進入靜止期，氧化徹底，油脂徹底腐敗，該結論與圖3后期兩者光譜圖呈現(xiàn)一致性相統(tǒng)一。

圖3 不同氧化階段下花生油三維熒光光譜圖Fig.3 Three-dimensional landscapes from the synchronous fluorescence spectra of peanut oil with different oxidation treatments

2.4 平行因子解析與二維熒光光譜分析

圖4為應用平行因子法分析獲取不同組分數(shù)的殘差平方和。從圖4中清晰發(fā)現(xiàn)組分數(shù)6殘差平方和(2.41×106)比組分數(shù)5(3.0×106)和7(4.06×106)的殘差平方和都要小。而組分數(shù)8，9和10殘差平方和(分別為1.92×106，1.85×106，1.8×106)都比組分數(shù)6小，但是通常情況下，相對較小的組分數(shù)比較適合用來作為平行因子分析中成分數(shù)的選擇。圖5是6組分不同Δλ激發(fā)波長載荷得分。從圖5中明顯看出在Δλ為70 nm下載荷得分最高，因此Δλ為70 nm可以作為花生油熒光光譜特征波長。根據(jù)前人的研究證明，載荷得分與樣品濃度相符合，因此需要降維進行更進一步的分析[20]。

圖6(a)和(b)是Δλ為70 nm的不同工藝花生油二維熒光光譜圖。不同區(qū)域的光譜代表不同的物質(zhì)組分。從圖6中不難發(fā)現(xiàn)，兩種不同工藝下的花生油其熒光物質(zhì)呈現(xiàn)顯著差異。冷榨花生油僅有一個熒光峰，在氧化期間熒光光譜區(qū)域紅移，氧化時間越長，現(xiàn)象越明顯，其峰位置分別在340，394，416和434 nm附近處，熒光強度先變?nèi)踉僦饾u增強； 熱榨花生油在氧化初期呈現(xiàn)三個熒光峰，主熒光峰(300～400 nm處)位置分別在406，400和420 nm處，峰寬先增大再減小，熒光強度先變?nèi)踉僭鰪?，而次熒光?600～700 nm)在氧化期消失，與三維熒光光譜圖結果相一致。表明該平行因子模型降維效果很好地反應了油脂不同氧化歷程的差異。

圖4 不同組分數(shù)平方和對比圖Fig.4 Sum of squared error at different components

圖5 Δλ載荷得分圖Fig.5 Loading score for the excitationwavelength at different Δλ

2.5 ANN分析

為了驗證同步熒光光譜判斷不同工藝下花生油氧化狀態(tài)模型的合理性，采用PARAFAC和ANN法。通過PARAFAC法選取Δλ為70 nm光譜數(shù)據(jù)作為輸入層神經(jīng)元，酸價和過氧化值分別作為輸出層神經(jīng)元。所有的數(shù)據(jù)按照2∶1分別作為訓練集與測試集，得到模型參數(shù)見表2。從表2可知，ANN模型相關系數(shù)R值為0.999 9，接近1，均方誤差MSE值較小，表明該方法建立模型預測效果越好。說明三維熒光光譜技術結合PARAFAC及ANN法能快速準確判定油脂不同氧化狀態(tài)。

圖6 花生油二維熒光光譜(Δλ=70 nm)Fig.6 Two-dimensional fluorescence spectrum of peanut oil

表2 ANN模型分析Table 2 Analysis of ANN

3 結 論

通過PARAFAC法獲取Δλ為70 nm的熒光光譜作為ANN模型輸入層，以氧化過程化學指標酸價或過氧化值作為輸出層建立氧化階段預測模型。模型相關系數(shù)r均接近1.0，均方根誤差均較小，說明該模型能較好反映油脂氧化過程狀態(tài)。本研究結果表明同步熒光光譜結合化學計量學能快速反映花生油氧化進程，進一步豐富油脂氧化理論，為形成完整的油脂氧化理論體系提供理論基礎，同時為不同氧化階段具體物質(zhì)深入研究提供支持。