光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)研究石墨烯量子點(diǎn)與胰蛋白酶的相互作用

張秋蘭,朱 智,溫子健,倪永年

南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330031

引 言

熒光石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)具有良好的化學(xué)惰性和生物相容性,以及熒光發(fā)光可調(diào)和熒光上轉(zhuǎn)換等特性,已成為生物成像、藥物運(yùn)輸、疾病檢測(cè)和熒光探針等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。因GQDs在靶向藥物遞送和改變血腦屏障等方面的應(yīng)用受到了極大的關(guān)注,人們對(duì)評(píng)估GQDs在生物系統(tǒng)中的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越感興趣[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道石墨烯納米材料可能導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性和肺部疾病[3],但有關(guān)GQDs毒性研究或生物學(xué)效應(yīng)的報(bào)道較少。Huang等[4]和Lu等[5]分別研究了GQDs與人血清白蛋白和DNA的相互作用,為評(píng)價(jià)GQDs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的毒性和生物學(xué)效應(yīng)提供了依據(jù)。然而,有關(guān)GQDs的毒理學(xué)研究還有待深入。

胰蛋白酶(trypsin,Tryp)是胰腺分泌的一種絲氨酸蛋白酶,其分子為23 300,由223個(gè)氨基酸殘基組成,在脊椎動(dòng)物的消化、蛋白質(zhì)成熟、凋亡、凝血、免疫反應(yīng)等生理過(guò)程中起著重要的作用。近年來(lái),胰蛋白酶得到了廣泛的應(yīng)用,對(duì)胰蛋白酶的研究也時(shí)有報(bào)道,例如藥物分子和納米粒子與胰蛋白酶的相互作用[6-7],谷胱甘肽包裹的CdTe量子點(diǎn)和CdSe量子點(diǎn)與胰蛋白酶的作用[8-9]。然而,在分子水平上GQDs對(duì)胰蛋白酶的毒性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

納米材料與生物大分子作用以紫外可見(jiàn)分光光度法、熒光和紅外光譜、圓二色譜法等為主要技術(shù),由于生命作用體系都比較復(fù)雜,需要利用和發(fā)展化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,把能對(duì)生命現(xiàn)象做出解釋的有用信息盡可能地從測(cè)量數(shù)據(jù)中挖掘出來(lái)。繼以往將化學(xué)計(jì)量學(xué)方法用于銀納米粒子與血清蛋白作用后研究[10],本工作將多維數(shù)據(jù)解析用于GQDs與胰蛋白酶的研究,為GQDs對(duì)人體健康的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)提供有價(jià)值的信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots,GQDs,南京先豐納米材料科技有限公司,純度～90%,量子點(diǎn)<10 nm,量子產(chǎn)率～5%,分子量78)用二次蒸餾水配成1.0×10-2mol·L-1的溶液備用,4 ℃以下冰箱保存。胰蛋白酶(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分子量23 800,干燥失量≤10.0%,酶活力(μ·g-1)25 000,淡黃色粉末用二次蒸餾水溶解成2.5×10-3mol·L-1的溶液備用。N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(上海生工,白色結(jié)晶或粉末,溶于水,純度大于98%,分子量342.82)用二次蒸餾水溶解成1.0×10-3mol·L-1的溶液備用。日立F-7000(日本日立公司)熒光分光光度計(jì)(配備1.0 cm熒光比色皿),狹縫寬度Ex=5 nm,Em=10 nm,掃描電壓為700 V,掃描速度2 400 nm·min-1; Agilent 8453紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司); 圓二色譜儀(法國(guó)Bio-Logic公司); 超級(jí)恒溫水槽ZC-10(寧波天恒儀器廠)。

1.2 方法

將3.0 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液加入比色皿中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要依次加入適量的GQDs和Tryp溶液。

實(shí)驗(yàn)1: 固定Tryp的濃度(4.00×10-6mol·L-1),再加入不同量的GQDs,使其濃度分別為0,1.67,3.33,…,13.33×10-5mol·L-1(濃度間隔1.67×10-5mol·L-1),放置5 min以達(dá)平衡,在298 K測(cè)其熒光光譜。

實(shí)驗(yàn)2: 固定Tryp的濃度(3.33×10-6mol·L-1),加入不同量的GQDs,使[GQDs]∶[Tryp]=0,5,10,15,20,在298 K測(cè)其圓二色譜。所得到的CD(circular dichroism,CD)譜為三次掃描的平均值,并通過(guò)緩沖信號(hào)進(jìn)行校正。

實(shí)驗(yàn)3: 固定Tryp的濃度(4.17×10-6mol·L-1),再加入GQDs,使[GQDs]∶[Tryp]=10,在298 K下測(cè)其三維熒光。

1.3 酶活性

實(shí)驗(yàn)4： N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)在波長(zhǎng)253 nm下的紫外吸收遠(yuǎn)小于其水解產(chǎn)物N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)的紫外吸收[11]。在胰蛋白酶的催化下,BAEE酯鍵水解產(chǎn)物BA逐漸增多,體系的紫外吸收也隨之增加。胰蛋白酶的活性以ΔA253 nm計(jì)算。在3.0 mL Tris-HCl緩沖溶液中固定Tryp的濃度(4.17×10-6mol·L-1),然后加入不同量的GQDs(0～8.33×10-5mol·L-1,間隔8.33×10-6mol·L-1),在37 ℃孵化2 h后,再加BAEE(1.67×10-4mol·L-1),測(cè)GQDs存在和不存在下的紫外吸收光譜。

1.4 擴(kuò)展矩陣數(shù)據(jù)的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)5： (UV-Vis(ultraviolet visible,UV-Vis)法,DTryp): 固定Tryp的濃度(1.67×10-5mol·L-1),加入不同濃度的GQDs(0～3.33×10-4mol·L-1,間隔1.67×10-5mol·L-1)。

實(shí)驗(yàn)6： (UV-Vis法,DGQDs): 固定GQDs的濃度(1.67×10-5mol·L-1),加入不同濃度的Tryp(0～2.22×10-6mol·L-1,間隔1.11×10-7mol·L-1)。

以上紫外光譜數(shù)據(jù)采集范圍均為200～500 nm(間隔1 nm,301個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)),見(jiàn)表1。

表1 不同實(shí)驗(yàn)條件下得到的2個(gè)波譜數(shù)據(jù)矩陣Table 1 The experimental conditions to build up the extension matrixes

1.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法: 多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)

經(jīng)典的多元曲線分辨-交替最小二乘法(multivariate curve resolution-alternating least squares,MCR-ALS)法在處理體系測(cè)量數(shù)據(jù)時(shí)所得到的信息相對(duì)簡(jiǎn)單孤立,Tauler對(duì)其進(jìn)行了拓展和改進(jìn)[12]。本工作通過(guò)UV-Vis技術(shù)采用兩種滴加方式獲得2個(gè)波譜數(shù)據(jù)矩陣(見(jiàn)表1)后,將這2個(gè)矩陣Dtrypsin(實(shí)驗(yàn)5)和DGQDs(實(shí)驗(yàn)6)在列的方向組成一擴(kuò)展矩陣,再用MCR-ALS解析; 多維數(shù)據(jù)解析方法最大的優(yōu)勢(shì)在于可獲得多維陣唯一的分解結(jié)果,即分辨出體系中感興趣組分的相對(duì)濃度和光譜趨勢(shì)圖。

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 GQDs與胰蛋白酶作用的熒光光譜

酶的熒光性質(zhì)來(lái)自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸殘基。固定胰蛋白酶,加入不同濃度的GQDs。表明GQDs可改變胰蛋白酶所處的微環(huán)境,使其疏水性增加[14]。與此同時(shí),GQDs濃度越高,胰蛋白酶熒光變化越明顯(1→9,下降了近16%),說(shuō)明GQDs可與胰蛋白酶作用并改變大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。

圖1 GQDs與胰蛋白酶作用的熒光光譜圖Fig.1 The fluorescence spectra of the interactionof GQDs with trypsin

2.2 GQDs對(duì)胰蛋白酶構(gòu)象的影響

2.2.1 圓二色譜法

圓二色譜是一種準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法。利用遠(yuǎn)紫外(200～260 nm)可測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在沒(méi)有和存在GQDs的情況下,胰蛋白酶的CD譜如圖2所示。胰蛋白酶在210 nm左右呈負(fù)譜帶,不存在正峰。在胰蛋白酶溶液中加入GQDs后,CD信號(hào)出現(xiàn)小幅下降,但峰的形狀和位置沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明與GQDs結(jié)合時(shí)胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi),但基本結(jié)構(gòu)保持完整。用公式[16]計(jì)算得到胰蛋白酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)由19.12%下降至16.23%,進(jìn)一步說(shuō)明GQDs加入可誘導(dǎo)胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使胰蛋白酶骨架松弛[17]。

2.2.2 三維熒光光譜法

三維熒光光譜可證明蛋白質(zhì)構(gòu)象特征的變化。圖3(a)和(b)是胰蛋白酶和石墨烯量子點(diǎn)的三維熒光光譜。峰1和峰2是瑞利散射峰(λex=λem)和二階散射峰(2λex=λem)[19]。峰a(λex=280 nm,λem=344 nm,I=1 548)與色氨酸和酪氨酸殘基從π→π*躍遷的熒光特性有關(guān),加入石墨烯量子點(diǎn)后[λex=280 nm,λem=337 nm,IF(fluorescence intensity)=1 529]反映了胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。峰b(λex=225 nm,λem=322 nm,I=1 474)是胰蛋白酶多肽骨架結(jié)構(gòu)的熒光特征,主要是由n→π的躍遷引起的,表明石墨烯量子點(diǎn)存在下胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化(λex=225 nm,λem=318 nm,I=366)。加入GQDs后,胰蛋白酶峰a和峰b的熒光強(qiáng)度值明顯下降并出現(xiàn)藍(lán)移,這些數(shù)據(jù)表明GQDs與胰蛋白酶作用使胰蛋白酶構(gòu)象的變化[19]。

圖2 GQDs與胰蛋白酶作用的CD圖

圖3 GQDs與胰蛋白酶作用的三維熒光圖(a): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1;(b): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1; cGQDs=4.17×10-5 mol·L-1Fig.3 Three dimensional fluorescence spectra ofthe interaction of GQDs with trypsin(a): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1;(b): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1; cGQDs=4.17×10-5 mol·L-1

2.3 GQDs對(duì)胰蛋白酶活性的影響

隨著GQDs的加入,胰蛋白酶活性降低,但不能被完全抑制(圖4,縱坐標(biāo)為相對(duì)活性)。通過(guò)GQDs酶活性下降的半抑制濃度IC50為4.35×10-6mol·L-1,說(shuō)明GQDs對(duì)胰蛋白酶活性相對(duì)較弱的抑制作用。這可能是GQDs在酶中有較高的高生物利用度,胰蛋白酶的活性位點(diǎn)被GQDs穩(wěn)定和保護(hù)[20]。

2.4 MCR-ALS解析結(jié)果分析

紫外-可見(jiàn)吸收是測(cè)定小分子與生物分子相互作用的一種簡(jiǎn)單而常用的技術(shù)。如圖5(a)所示,胰蛋白酶在大約215和276 nm處呈現(xiàn)出兩個(gè)吸收峰,在215 nm處的吸收峰隨著GQDs的加入逐漸向220 nm移動(dòng)直至平衡,而在276 nm處的吸收峰基本保持不變。從圖5(b)可知,隨著胰蛋白酶的加入,GQDs的峰強(qiáng)度明顯增加,峰位移不明顯。圖5(a)和(b)的光譜重疊嚴(yán)重,難以區(qū)分GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物的光譜而無(wú)法分析反應(yīng)過(guò)程。通常利用化學(xué)計(jì)量學(xué)擴(kuò)展多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)可從復(fù)雜系統(tǒng)的重疊波譜信號(hào)中提取較多的額外信息,例如組分的濃度分布、純光譜、特別是確定GQDS-胰蛋白酶復(fù)合物等方面的信息。

圖4 不同濃度GQDs存在下Tryp的活性

圖5 Tryp與GQDs反應(yīng)的紫外吸收光譜

圖6 由MCR-ALS解析紫外光譜得到的GQDs與胰蛋白酶 作用體系光譜圖(a)和濃度趨勢(shì)圖(b)和(c)Fig.6 Recovered UV-Vis spectra (a) andconcentration profiles (b) and (c)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)5和實(shí)驗(yàn)6得到擴(kuò)展光譜數(shù)據(jù)矩陣[Dtrypsin,DGQDs],然后利用奇異值分解(SVD)方法計(jì)算矩陣,得到與化合物相關(guān)重要因子個(gè)數(shù),得到的前4個(gè)特征值分別為113.6，30.7，10.3和1.4,說(shuō)明反應(yīng)體系中有3個(gè)主要因素可能與3個(gè)化合物有關(guān),分別為胰蛋白酶、GQDs和GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物。MCR-ALS法提取的胰蛋白酶和GQDs的光譜[虛線,圖6(a)]與實(shí)測(cè)圖(實(shí)線)吻合較好。此外,還得到了GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(虛線)。計(jì)算與實(shí)測(cè)光譜曲線吻合較好,說(shuō)明MCR-ALS解析得到的濃度曲線合理可靠。如圖6(b)所示,隨著GQDs的加入,GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物濃度逐漸升高,同時(shí)胰蛋白酶濃度下降,在[GQDs]∶[胰蛋白酶]=15時(shí),體系趨于平衡; 從圖6(c)可知,隨著胰蛋白酶的加入,GQDs濃度呈逐漸下降趨勢(shì),GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物濃度增加直至體系基本平衡。MCR-ALS法的解析結(jié)果為進(jìn)一步了解GQDs與胰蛋白酶相互作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程提供了依據(jù),說(shuō)明GQDs可以與胰蛋白酶相互作用,并形成GQDs15-胰蛋白酶復(fù)合物。

3 結(jié) 論

采用光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法研究GQDs與胰蛋白酶的相互作用。三維熒光光譜法和圓二色譜實(shí)驗(yàn)說(shuō)明GQDs的存在不僅改變了胰蛋白酶所處的微環(huán)境并使胰蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生變化。運(yùn)用多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)解析擴(kuò)展光譜數(shù)據(jù)矩陣,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)GQDs與胰蛋白酶在作用中達(dá)到平衡時(shí)各組分的狀態(tài)和整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。而酶活性實(shí)驗(yàn)表明GQDs會(huì)影響胰蛋白酶的活性。該研究從分子水平研究GQDs與生物大分子的作用機(jī)制,并為GQDs的毒副作用研究提供了有價(jià)值的信息。下一步計(jì)劃研究不同尺寸和層數(shù)的石墨烯量子點(diǎn)對(duì)生物大分子構(gòu)象和蛋白酶活性的影響。