干細(xì)胞分泌因子凝膠劑對老化皮膚創(chuàng)傷愈合的影響

馮琳，王媛，范春桃，王寶奇，賀鑫梅，于楠楠，毛瑩瑩，練旭冬，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

隨著年齡的增長，人體皮膚的修復(fù)能力會逐漸減弱，這一現(xiàn)象在老年人上尤為明顯。老年人皮膚傷口常常出現(xiàn)愈合速度慢，愈后結(jié)疤瘢等現(xiàn)象，嚴(yán)重減低著老年人的生活質(zhì)量[1-3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的 EGF、FGF2、IGF、PDGF、VEGF、IL-1、IL-10等多種細(xì)胞因子能夠明顯促進(jìn)傷口愈合，這些細(xì)胞因子通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、血管生成、抑制炎癥反應(yīng)等幾個方面參與皮膚組織生成[4-5]。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子不僅可繞過與細(xì)胞治療有關(guān)的免疫相容性、疾病傳染性等問題，還可以批量生產(chǎn)，長期保存，降低細(xì)胞培養(yǎng)所需的時間和成本，因此間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子對于創(chuàng)傷、腦缺血、心肌梗塞等疾病的治療更具優(yōu)勢。但間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子成分復(fù)雜，各細(xì)胞因子通過何種方式發(fā)揮促進(jìn)老化皮膚創(chuàng)傷愈合的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制目前尚不可知，這在一定程度上抑制間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子的臨床應(yīng)用。因此，探究真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子治療老化皮膚創(chuàng)傷的相關(guān)分子機(jī)制具有十分重要的意義。

成纖維細(xì)胞是皮膚創(chuàng)傷中主要的修復(fù)細(xì)胞，當(dāng)皮膚發(fā)生創(chuàng)傷時，成纖維細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的刺激下，會大量增殖，遷移并分泌膠原蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)填補(bǔ)創(chuàng)傷部位，從而達(dá)到促進(jìn)傷口愈合的目的。實驗采用卡波姆為凝膠基質(zhì)，添加富含真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子的條件培養(yǎng)液，制成分泌因子凝膠劑，治療老化小鼠皮膚創(chuàng)傷，闡明真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子通過激活細(xì)胞內(nèi)ErK1/2信號通路，加快真皮成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)老化皮膚創(chuàng)傷愈合，不僅為干細(xì)胞相關(guān)制劑的研發(fā)提供技術(shù)手段，也為干細(xì)胞相關(guān)制劑的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為SPF級野生型129/SvJ小鼠，購自韓國生命工學(xué)院。8月齡野生型小鼠12只，雌雄各半，自由飲食，室溫控制在25℃左右，12 h暗/光周期飼養(yǎng)。所有的動物程序都是按照KRIBB機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會的規(guī)定進(jìn)行的。

1.2 主要試劑

蘇木精試劑，購買自上海蘭秀公司；伊紅試劑，購買自天津大茂化學(xué)公司；硫酸鐵銨、酸性品紅、磷鉬酸、苯胺藍(lán)試劑，購買自阿拉丁化學(xué)公司；高熔點石蠟，購買自德國Leica公司；卡波姆940，購買自麥克林公司；蛋白免疫印跡相關(guān)試劑，購買自Amresco公司；PCNA、Cyclin-D1、ErK、p-Erk 抗體，購買自美國Santa Cruz公司；DMEM，購買自索萊寶公司；胎牛血清，購買自索萊寶公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備

將真皮間充質(zhì)干細(xì)胞從液氮罐中取出，復(fù)蘇至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，使用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和鏈霉素（P/S）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，放入37℃、含5%二氧化碳（CO2）的恒溫培養(yǎng)箱中。6 h后觀察細(xì)胞貼壁情況。當(dāng)細(xì)胞生長至細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時，棄去原來培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并加入100μL NEAA以及10μL B27，培養(yǎng)12 h后收集真皮間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將回收的真皮間充質(zhì)干細(xì)胞上清液以2 000 rpm，離心10 min，0.22μm濾膜過濾去除細(xì)胞碎片。即獲得真皮間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，以每管1 mL進(jìn)行分裝，儲存在-80℃冰箱用于后續(xù)實驗。

1.3.2 卡波姆凝膠劑的制備

首先用電子天平稱取0.04 g卡波姆加入4 mL濃度為0.1 mol·L-1的NaOH溶液，再加入11 mL蒸餾水，溶脹過夜。第二天呈膠凍狀，加入真皮間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基5 mL攪拌均勻，進(jìn)行分裝，分裝后置于冰箱4℃保存，用于后續(xù)實驗。

1.3.3 老化小鼠皮膚創(chuàng)傷實驗

采用8月齡老齡鼠12只，采用0.25%Avertin進(jìn)行腹腔注射，用于麻醉小鼠，對小鼠背部皮膚5 cm×5 cm區(qū)域進(jìn)行脫毛處理，先用推子剃去長毛發(fā)，再涂抹脫毛膏去除短的毛發(fā)，擦去多余脫毛膏，采用酒精、碘伏對脫毛區(qū)進(jìn)行消毒，選取距脊柱1 cm的腰后部位置，制作直徑為5 mm的圓形傷口。分泌因子組小鼠每天定時定量涂抹制作的真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凝膠，空白對照組小鼠不進(jìn)行處理，將每只小鼠單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，連續(xù)9 d拍照觀察，對創(chuàng)面面積進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.4 組織切片及H&E染色

組織切片：脫頸處死小鼠，取背部傷口處皮膚1 cm×1 cm固定于硝酸纖維膜上，按如下流程進(jìn)行處理，10%福爾馬林液固定24 h，流水沖洗1.5 h，進(jìn)行脫水處理，70%酒精浸泡40 min，80%酒精浸泡50 min，90%酒精浸泡1 h，95%酒精浸泡1 h，100%酒精浸泡1 h，100%酒精浸泡 1 h，100%二甲苯浸泡 30 min，100%二甲苯浸泡30 min，100%二甲苯浸泡1 h，高熔點石蠟浸泡30 min，高熔點石蠟浸泡30 min，高熔點石蠟浸泡1 h 30 min。共計9.5 h后對樣品進(jìn)行石蠟包埋，放在冷凍機(jī)上將石蠟進(jìn)行冷凍，去除周圍多余的蠟片，將蠟塊從包埋盒中起下來，將蠟塊修成平整梯形，用切片機(jī)先以厚度為10μm進(jìn)行修片，再以厚度為0.5μm進(jìn)行切片，于42℃攤片機(jī)上攤片，用載玻片將其挑起，室溫晾片12 h后進(jìn)行染色。

H&E染色：切片后按照如下流程進(jìn)行染色處理，100%二甲苯（10 min）-100%二甲苯（10 min）-100%酒精（1 min 30 s）-100%酒精（1 min）-90%酒精（1 min）-80%酒精（1 min）-50%酒精（1 min）-水洗（3 min）-蘇木精（5 min）-水洗（3 min）-1%酸酒精（0.2 s）-水洗（3 min）-0.8%氨水（0.2 s）-水洗（5 min）-伊紅（1 min）-95%酒精（1 min）-95%酒精（1 min）-100% 酒精（1 min）-100%酒精（30 s）-100% 二甲苯（30 s）-100%二甲苯（30 s）-100%二甲苯（1 min）。用中性樹膠進(jìn)行封片處理，室溫風(fēng)干12 h。用熒光顯微鏡觀察傷口部位皮膚厚度，肉芽組織填充情況，以及上皮組織完整程度，統(tǒng)計學(xué)分析皮膚厚度和傷口大小。

1.3.5 MTT assay分析

將離心后的真皮成纖維細(xì)胞加入培養(yǎng)液，吹打混勻，以1×104個/mL的濃度種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，將空白對照組與真皮間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基組分別更換含2%FBS的DMEM以及之前制備好的真皮間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，每孔加入100μL。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL MTT，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉培養(yǎng)液后每孔加入100μL DMSO混勻，避光孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度值，并對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

收集細(xì)胞置于1.5 mL離心管內(nèi)。每組加入0.05 mL細(xì)胞裂解液，于冰上裂解，每 5 min敲打一次，共5次，然后在4℃下8 000 rpm離心30 min，離心結(jié)束，將1.5 mL的Tube放在裝有冰的盒子里，小心吸取管中液體，移至1.5 mL的Tube中，回收上清。根據(jù)800μL DDW，200μL考馬斯亮藍(lán)，1μL蛋白樣品的比例配制定量體系，檢測溶液中蛋白質(zhì)濃度，并在495 nm處用分光光度計進(jìn)行檢測，統(tǒng)計數(shù)值。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線計算蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品定量為30μg，沸水浴5 min，使上清液中的蛋白質(zhì)變性，放入-20℃冰箱備用。將膠板與模具進(jìn)行清洗后，放到架子上晾干。將膠板安裝在模具上，加入DDW進(jìn)行檢驗是否漏水。未發(fā)現(xiàn)漏水現(xiàn)象后，配制下層膠。用旋渦振蕩器混勻后，加入到膠板內(nèi)，再加入DDW進(jìn)行壓平。下層膠（分離膠）成形后，開始配制上層膠（濃縮膠），根據(jù)樣本的數(shù)量，選擇合適的梳子，在上層膠未成形以前插入。拔去梳子后，將膠板取下，清洗膠板表面的膠，安裝到電泳槽中，并加入電泳液（Electron Buffer）留以備用。蛋白質(zhì)經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將膠從電泳槽中取出，按照陰極—海綿墊—濾紙—分離膠—NC膜（美國Millipore公司）—濾紙—海綿墊—陽極的順序安裝轉(zhuǎn)膜夾，將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜桶，倒入轉(zhuǎn)膜液。在4℃條件下通電，130 mA過夜轉(zhuǎn)膜。用0.1%麗春紅染色并進(jìn)行剪膜，用1×TBST含有15 mmol·L-1的NaCl（Tris-HCL，TBS）、0.2%Tween-20、10 mmol·L-1的Tris-HCl洗滌直到麗春紅洗凈為止，脫脂乳封閉1 h，用 1×TBST 洗 5 次，每次 5 min，加入 α-tubulin、ErK、p-ErK、cyclinD1、PCNA 單克隆抗體于 4℃冰箱中孵育過夜，回收一抗，用1×TBST洗滌5次，每次5 min，脫脂乳封閉10 min，使用1×TBST將一抗洗凈，在搖床上快搖，每5 min更換一次，共洗滌30 min。按照一抗對應(yīng)加入1μL二抗（山羊抗小鼠、山羊抗兔）室溫孵育1 h，用TBST洗滌5次，每次5 min。配制ECL超敏發(fā)光液，避光保存。利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）技術(shù)，用辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗檢測結(jié)合抗體，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間差異采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.001為有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，所有數(shù)據(jù)Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。每組實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凝膠劑能促進(jìn)老化皮膚創(chuàng)傷愈合

為研究真皮間充質(zhì)干細(xì)胞（DMSCs）分泌因子對衰老小鼠創(chuàng)傷愈合的影響，采用DMSCs分泌因子凝膠劑處理衰老小鼠皮膚全層切除模型，觀察衰老小鼠創(chuàng)傷愈合的情況。結(jié)果表明，分泌因子凝膠組在愈合過程中傷口面積明顯小于空白對照組（圖1A），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，分泌因子組的傷口面積顯著低于空白對照組（圖1B），H&E染色結(jié)果表明，第9 d時，各組均有肉芽組織填埋傷口，分泌因子凝膠組創(chuàng)面已被填埋，上皮完整，愈合基本完成；空白對照組上皮較薄，再生不完全（圖1C）。表明真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凝膠劑能夠促進(jìn)老化皮膚創(chuàng)傷愈合。

2.2 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖

為了探究DMSCs分泌因子促進(jìn)老化皮膚創(chuàng)傷愈合的機(jī)制，采用含有DMSCs分泌因子的條件培養(yǎng)基處理真皮成纖維細(xì)胞，利用MTT法檢測真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力；利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1表達(dá)水平。結(jié)果表明，與空白對照組相比，DMSCs條件培養(yǎng)基組處理后的真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著增加（圖2A），增殖相關(guān)蛋白PCNA、Cyclin D1表達(dá)水平顯著上升（圖2B）。表明DMSCs條件培養(yǎng)基能促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖。

圖1 DMSCs分泌因子凝膠劑對老化小鼠皮膚傷口愈合的影響Fig.1 Effect of DMSCs secretory factor gel on wound healing of skin in aging mouse

圖2 DMSCs-CM能促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖Fig.2 DMSCs-CM promoting the dermal fibroblasts proliferation

2.3 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子通過Er K1/2信號通路促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖

ErK1/2是MAPK信號通路的重要成員，通過磷酸化其底物，參與細(xì)胞增殖、應(yīng)激、分化、凋亡和炎癥的調(diào)控[6]。為了探究DMSCs分泌因子促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，在分子水平上檢測真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)ErK1/2，p-ErK1/2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與空白對照組相比DMSCs條件培養(yǎng)基組p-ErK1/2表達(dá)水平顯著上升，ErK1/2表達(dá)水平基本不變（圖3）。這說明，真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子可以通過調(diào)節(jié)真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)的ErK1/2信號通路促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖。

圖3 DMSCs分泌因子通過Er K1/2信號通路促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖Fig.3 DMSCs secretion factor promoting dermal fibroblasts proliferation by ErK1/2

3 討論

隨著全世界老齡化人口數(shù)量的不斷增加，老年群體創(chuàng)傷發(fā)生率越來越高，值得關(guān)注的是常規(guī)治療創(chuàng)傷的方法對于老年創(chuàng)傷患者治療效果并不明顯。因此，探究有效治療老化皮膚創(chuàng)傷的方法具有重要意義。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞對皮膚創(chuàng)傷具有良好的治療效果，無論是內(nèi)源性干細(xì)胞還是移植的外源性干細(xì)胞均能起到促進(jìn)傷口愈合的作用。起初人們認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞治療傷口愈合主要是通過自身的增殖、分化來替代和補(bǔ)充受損傷的細(xì)胞，但最新的研究表明，移植的外源性間充質(zhì)干細(xì)胞在傷口部位存活率較低，也極少會分化成其他的細(xì)胞，同時發(fā)現(xiàn)即使植入的間充質(zhì)干細(xì)胞遠(yuǎn)離實際損傷部位，但仍可以促進(jìn)傷口愈合[7-8]，因此研究人員認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞是可能通過旁分泌的方式發(fā)揮治療效果。

在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中，真皮成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是參與皮膚組織再生的主要細(xì)胞，它參與了皮膚創(chuàng)傷愈合一些關(guān)鍵的過程[9-11]。在炎癥階段結(jié)束增殖階段開始時，真皮成纖維細(xì)胞會快速增殖，然后分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶來膨脹和降解纖維蛋白凝塊，并將其替換為細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白IIV、XVIII、糖蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、糖胺聚糖（GAGs）、透明質(zhì)酸（HA）和硫酸肝素[12]。這種復(fù)雜的基質(zhì)支持并調(diào)控成纖維細(xì)胞的遷移和活性，同時也為血管生成、肉芽組織生成和上皮化提供支持和信號[13-14]，進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。研究表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（ASCs-CM）中bFGF、EGF均可顯著促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖[15]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌特殊的細(xì)胞因子如VEGF，igf-1，EGF等對傷口愈合很重要的細(xì)胞因子促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖和遷移[16]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）條件培養(yǎng)液能夠促進(jìn)皮膚組織損傷修復(fù)，且經(jīng)ELISA測定，條件培養(yǎng)液中含有高濃度VEGF、IL-8、MCP-1生物活性因子[17]。這與實驗的結(jié)果相一致，研究采用真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凝膠劑治療老化皮膚創(chuàng)傷，結(jié)果顯示分泌因子凝膠組傷口愈合率顯著高于空白對照組；采用MTT法檢測真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因?qū)φ嫫こ衫w維細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示分泌因子組真皮成纖維細(xì)胞的增殖速度明顯高于空白對照組。這表明，真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凝膠劑通過干細(xì)胞分泌的多種分泌因子促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖加快老化皮膚創(chuàng)傷愈合。研究顯示FGF和TGFβ-1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，并均能夠被ErK1/2特異性抑制劑所消除[18]，同時，實驗的研究結(jié)果也表明干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理真皮成纖維細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的P-ErK1/2表達(dá)水平明顯升高。綜合以上的結(jié)果表明，真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子可能是通過激活成纖維細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號通路，加快細(xì)胞增殖，促進(jìn)老化皮膚傷口愈合。同時實驗推測ErK1/2信號通路可能是多種細(xì)胞因子調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖的共同下游信號通路，這將是下一步研究的重點。

由于含有間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子的條件培養(yǎng)基為液體，不能長時間停留在傷口表面，嚴(yán)重抑制干細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品的治療效果。因此，需要選用一種能夠承載干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的藥物，使得培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞因子更好的進(jìn)入皮膚傷口部位，發(fā)揮治療效果。實驗采用卡波姆為凝膠基質(zhì)，卡波姆是主要用于皮膚治療劑的藥物輔料，是國家藥典中規(guī)定的藥物輔料，是多種凝膠基質(zhì)生物黏附材料、控緩釋制劑的骨架材料等。以卡波姆為基質(zhì)制作的凝膠劑易涂展、無油膩性，附著性和均勻性良好，對皮膚和黏膜無刺激性且使藥物呈零級或近似零級釋放[19-21]，能最大限度維持藥物療效。因此，研究通過制備真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凝膠劑，探究干細(xì)胞分泌因子對老化皮膚創(chuàng)傷愈合的影響，闡明真皮間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子通過ErK1/2信號通路促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖加速老化皮膚創(chuàng)傷愈合的作用，為治療老化皮膚創(chuàng)傷提供新思路。