煙薯多糖的提取·鑒定及其抗氧化活性研究

鄧甜 田小鵬 馮艷麗

摘要 多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老以及降血糖等多種生物活性，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。該研究利用熱水浸提法從煙薯25中提取到多糖，多糖得率為0.6%。所提取的多糖能夠被α-淀粉酶和變聚糖酶水解，表明該多糖主要含有α-1，3-糖苷鍵與α-1，4-糖苷鍵;不能被右旋糖酐酶水解。經(jīng)紅外光譜分析，該多糖屬于α型吡喃糖。該多糖具有良好的抗氧化作用，能夠清除DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基，其IC50分別為2.09、1.27、2.47 ?mg/mL，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 煙薯;多糖;抗氧化活性

中圖分類號(hào) S531 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）19-0170-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.044

Abstract Polysaccharides have a variety of biological activities such as immuno regulation，antitumor，antiaging，and hypoglycemia，which have been widely used in many fields.In this study，we extracted polysaccharides from Yanshu 25 by the method of hot water extraction.The yield of polysaccharides was 0.6%.The oligosaccharides could be produced after incubated with αamylase and mutanas.The polysaccharides were comprised with α1，3 and α1，4glycosidic bonds.According to infrared spectrum analysis，the polysaccharide belonged to αpyranose.The polysaccharide could scavenge DPPH，hydroxyl radical and superoxide radical，and the IC50 was 2.09，1.27，2.47 mg/mL，respectively.The polysaccharides from Yanshu 25 had good application prospect.

Key words Yanshu;Polysaccharide;Antioxidant activity

基金項(xiàng)目 江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYCX18_2573;KYCX18_2586）。

作者簡(jiǎn)介 鄧甜（1994—），女，貴州銅仁人，在讀碩士，從事海洋微生物及活性物質(zhì)研究。*通信作者，呂明生，教授，碩士生導(dǎo)師，從事海洋微生物、生物技術(shù)研究;王淑軍，教授，碩士生導(dǎo)師，從事海洋微生物及其活性物質(zhì)研究。

收稿日期 2020-03-16

甘薯在世界各地的熱帶、亞熱帶均有廣泛種植，中國甘薯的種植面積及產(chǎn)量位居世界第一。甘薯中富含膳食纖維、花青素、胡蘿卜素、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)和多糖等多種活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。煙薯25是由煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院通過雜交技術(shù)選育而成，具有較好的耐貯性、抗病性，可溶性糖含量較高，是優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病性好的食用型新品種，利用灰色多維綜合分析評(píng)價(jià)食用型甘薯品種，結(jié)果表明煙薯25產(chǎn)量和綜合評(píng)估均排在第一位[2]。

多糖是指由醛糖或者酮糖以糖苷鍵鏈接形成的天然高分子聚合物，廣泛存在于自然界的許多生物中，是維持生命活動(dòng)的基本物質(zhì)[3]。20世紀(jì)50年代就發(fā)現(xiàn)來源于真菌的多糖具有抗癌效果，之后越來越多的研究者對(duì)多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究[4]。目前已報(bào)道有300多種天然多糖化合物來源于動(dòng)物、植物以及微生物[5]。多糖不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等生物活性，還具有毒副作用小、不易造成殘留等特點(diǎn)，越來越多的人研究其在食品、保健品中的應(yīng)用[6]。該研究以煙薯25為材料，從中提取出多糖，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究，并研究其體外抗氧化活性，從而提高煙薯25的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 煙薯25購買自冠縣暢享貿(mào)易有限公司;變聚糖酶（Mutanase）與右旋糖酐酶（Dextranase）為江蘇省海洋資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，α-淀粉酶（α-Amylase）購買自Aladdin; 60F254 硅膠板購買自Sigma;其他試劑均為國藥化學(xué)分析純。

1.2 方法

1.2.1 煙薯多糖的提取。將1 kg煙薯25清洗干凈，去皮后切塊自然晾干，然后粉碎得煙薯粉末，加入無水乙醇浸泡48 h 脫脂，取出后自然晾干。將脫脂后的煙薯粉末加入10倍質(zhì)量的蒸餾水置于燒杯中，在85 ?℃下采用熱水浸提2 h，并不斷用玻璃棒攪拌，然后離心收集上清得提取液。將提取液進(jìn)行減壓濃縮得到濃縮液，然后加入3倍體積的無水乙醇，在4 ℃下浸泡24 h，然后離心取沉淀使用真空干燥。將干燥后的粉末使用蒸餾水溶解至濃度為10 mg/mL，使用Sevage法脫蛋白后，再使用0.45 μm纖維濾膜過濾，然后使用規(guī)格為3 500 Da 透析袋在蒸餾水中透析48 h，期間不斷更換蒸餾水，然后將透析液真空干燥得到煙薯粗多糖。

1.2.2 煙薯多糖含量測(cè)定。

將提取的多糖稱取1 g，溶于100 mL 蒸餾水中，使用0.45 μm濾膜過濾，然后使用硫酸苯酚法測(cè)定其總糖含量[7]，使用DNS法測(cè)定其還原糖含量[8]，使用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定其蛋白含量，計(jì)算所提取物質(zhì)中多糖含量及提取率。

1.2.3 TLC分析煙薯多糖酶解產(chǎn)物。將提取的煙薯多糖分別與變聚糖酶、右旋糖酐酶以及α-淀粉酶在35 ℃、pH 6.5下反應(yīng)24 h后，沸水浴1 min滅活，1 000 r/min離心1 min，然后各取0.5 μL使用型號(hào)60F254硅膠板進(jìn)行薄層層析（thinlayer chromatograph，TLC）分析水解產(chǎn)物。其展開劑為5 mL正丙醇、2 mL乙酸乙酯、8 mL乙腈、1 mL乙酸、4.5 mL去離子水;顯色劑為0.2 g地衣酚、10 mL濃硫酸、80 mL無水乙醇、10 mL去離子水，在85 ℃下顯色5 min。以葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。

1.2.4 紅外光譜分析煙薯多糖。

使用FT-IR光譜對(duì)煙薯多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。將多糖與溴化鉀在90 ℃烘箱中干燥12 h，然后將干燥的多糖樣品1 mg與100 mg溴化鉀粉末混合，研磨并壓片，然后在波數(shù)4 000～400 cm-1內(nèi)記錄IR光譜。

1.2.5 煙薯多糖的抗氧化活性分析。

1.2.5.1 DPPH清除率。

1.2.5.4 還原力測(cè)定。200 μL多糖+200 μL PBS（0.2 mmol/L，pH6.6）+200 μL K3[Fe（CN）6]，50 ℃溫育20 min，然后加入200 μL 10%TCA，混合后5 000 r/min離心10 min，取500 μL上清+2.5 mL蒸餾水+100 μL 0.2%FeCl3，室溫放置10 min后測(cè)OD700，制作曲線，并以VC為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙薯多糖提取

從2 000 g煙薯中提取到10.2 g煙薯粗多糖，其中總糖含量為6.1 mg/mL，還原糖含量為0.217 mg/mL，得到6 g多糖，其多糖得率為0.60%。而蘇瑞麗等[9]使用熱水浸提法從市售的紅皮白心紅薯、紅皮紅心紅薯、白皮紅心紅薯和紅皮紫心紅薯中提出的多糖得率分別為0.22%、0.28%、0.26%和0.40%，煙薯多糖的含量遠(yuǎn)高其他甘薯。

2.2 TLC分析煙薯多糖酶解產(chǎn)物 由圖1可知，煙薯多糖能夠被變聚糖酶水解產(chǎn)生少量麥芽七糖，不能夠被右旋糖酐酶水解，能夠被淀粉酶水解產(chǎn)生不同分子量的麥芽糖。變聚糖酶能夠水解α-1，3-糖苷鍵[10]，右旋糖酐酶是專一性水解α-1，6-糖苷鍵[11]，α-淀粉酶能夠水解淀粉、糖原或多糖中的α-1，4-糖苷鍵[12]。該多糖能夠被淀粉酶水解以及少量被變聚糖酶水解，表明該多糖中主要含有α-1，4-糖苷鍵以及α-1，3-糖苷鍵，但不能被右旋糖酐酶水解，表明該多糖含有α-1，6-糖苷鍵很少，或是所含的α-1，6-糖苷鍵的支鏈較短，右旋糖酐酶無法結(jié)合水解。

2.3 FT-IR分析煙薯多糖

在波數(shù)3 000～2 800 cm-1處出現(xiàn)較寬的吸收峰是C—H鍵的拉伸振動(dòng)，這是多糖物質(zhì)的特征吸收峰[13]。由圖2可知，該多糖具有典型的多糖特征吸收峰。在2 930 cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，為CH3、CH2、CH的C—H伸縮振動(dòng)引起的[14]。在1 023 cm-1處的吸收峰為吡喃型糖環(huán)特征吸收峰[14]。1 081 cm-1處的吸收峰是由糖醛上的C—OH伸縮振動(dòng)引起的[15]。在846 cm-1處的吸收峰為α型的C—H角變振動(dòng)吸收峰，說明該多糖為α型多糖[16]。趙國華等[17]曾從甘薯中提取到甘薯多糖 SPPS-I-Fr-Ⅱ組分，是一種含有α-1，6-糖苷鍵的α型吡喃糖。

2.4 煙薯多糖抗氧化活性 由圖3可知，從煙薯中提取到的多糖能夠有效清除DPPH、羥自由基以及超氧陰離子自由基。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子與羥自由基的清除率分別為33.8%和54.0%，與田春宇等[18]從甘薯PST一號(hào)提取的多糖相比，其在相同濃度下對(duì)超氧陰離子自由基與羥自由基的清除率僅為22.5%和25.4%。當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL時(shí)，能夠清除49.0%DPPH、49.2%超氧陰離子自由基以及61.0%羥自由基。當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時(shí)，能夠清除81.6%的DPPH、85.6%羥自由基以及64.1%超氧陰離子自由基。當(dāng)多糖濃度為8 mg/mL時(shí)，其羥自由基的清除能力比相同濃度下的香菇多糖與黑木耳多糖高12.8%與34.27%[19];其DPPH清除能力是陳安徽等[20]從蛹蟲草中提取的多糖的2.06倍;其對(duì)DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由

基清除能力是蕨麻多糖的2.62、11.14、2.06倍[21];其對(duì)超氧陰離子自由基及羥自由基的清除能力是山藥多糖的1.25、7.32倍[22]。該多糖還具有一定的還原能力，當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí)，其還原能力相當(dāng)于0.002 mg/mL VC的還原能力。來源于煙薯25的多糖是良好的天然抗氧化活性藥物，在保健品及食品中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

該研究使用熱水浸提法從煙薯25中提取到一種煙薯多糖，多糖得率為0.6%。該多糖能夠被α-淀粉酶水解為不同分子量的寡聚糖，以及變聚糖酶水解產(chǎn)生麥芽七糖，該多糖中以α-1，3-糖苷鍵與α-1，4-糖苷鍵為主。該多糖在紅外光譜中具有多糖特征吸收峰，多糖為α型吡喃糖。多糖在體外具有良好的抗氧化作用，對(duì)DPPH、羥自由基以及超氧陰離子自由基具有很好的清除作用，IC50分別為2.09、1.27、2.47 ?mg/mL。煙薯多糖有良好的抗氧化活性，具有良好的應(yīng)用前景。

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