枯芩與子芩醇提物對LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷保護(hù)作用比較研究

胡江慧 劉艷菊 張方蕾? 許 靜 林 雄 朱天翔

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 湖北 武漢430065； 2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心， 湖北 武漢430065）

黃芩是唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根［1］，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，且具有抗炎、抗菌等多種藥理作用，臨床常用于治療急性感染性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩水提取物對脂多糖（LPS）所致ALI 大鼠具有保護(hù)作用［2?3］。黃芩首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［4］，分為子芩和枯芩。子芩質(zhì)地堅實(shí)，枯芩質(zhì)輕腐朽。據(jù)古籍記載子芩瀉下焦大腸之火，枯芩善清上焦肺胃之熱。目前市場上已不區(qū)分子芩和枯芩，統(tǒng)稱黃芩。對兩種規(guī)格飲片的藥效差異課題組前期進(jìn)行了研究。實(shí)驗結(jié)果［5］表明，體外實(shí)驗提示子芩與枯芩對肺炎鏈球菌有抑菌作用，體內(nèi)實(shí)驗表明兩種飲片對肺炎模型大鼠有較好治療作用，且枯芩明顯優(yōu)于子芩，初步明確兩飲片的藥效差異。為了進(jìn)一步驗證枯芩與子芩對上焦肺經(jīng)的藥效作用差異，擬以急性肺損傷小鼠為模型進(jìn)行研究。

目前，脂多糖（LPS）已成為建立炎癥反應(yīng)的經(jīng)典試劑，LPS 誘導(dǎo)鼠肺損傷已成為評價抗炎癥反應(yīng)藥物的常用動物模型［6］。本文擬通過LPS 造模建立急性肺損傷模型，以地塞米松為陽性藥，比較不同劑量的枯芩及子芩醇提物對該模型的藥效，以期確定枯芩的臨床作用，為精準(zhǔn)用藥、最大發(fā)揮其藥效提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 搖擺式高速粉碎機(jī)（型號DFY?800C，溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；艾柯實(shí)驗室超純水機(jī)（型號AKSW?V?08，成都艾柯水處理設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（型號RE?5205，上海亞榮生化儀器廠）；SCIENTZ?12N 冷凍干燥機(jī)（型號16?0071，寧波新芝生物科技股份有限公司）；醫(yī)用低溫保存箱（-80 ℃）（型號MDF?86V340E，安徽中科都菱商用電器股份有限公司）；酶標(biāo)儀（型號EPOCH2，上海玉博生物科技有限公司）；奧林巴斯倒置顯微鏡［型號CKX53，成貫儀器（上海）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 子芩飲片（產(chǎn)地河南，批號20161217）、枯芩飲片（產(chǎn)地河南，批號20161207）均購自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張秀橋教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。地塞米松片［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，批號L8880］。脂多糖（LPS）（北京索萊寶科技有限公司，批號813Q0312）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0012）；丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號A003?1）；髓過氧化物酶（MPO）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號A044）；白介素1β（IL?1β）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號E?EL?M 0037c）；白介素6（IL?6）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號E?EL?M0044c）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF?α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號E?EL?M0049c）；白細(xì)胞稀釋液（南京建成生物工程研究所，批號C025?1?1）。

1.3 動物 C57BL／6 小鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量（20±2）g，由湖北省三峽大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，實(shí)驗動物使用許可證號SYXK（鄂）2017?0067。

2 方法

2.1 藥液制備 分別稱取枯芩、子芩飲片，打粉，用10倍量70%乙醇加熱回流提取2 次，第1 次2 h，第2 次1 h，合并2 次濾液，旋蒸，冷凍干燥，枯芩得率為39.82%；同法制備子芩醇提物，得率為43.48%。取2 種醇提物凍干粉適量至量瓶中，加入蒸餾水，定容，混勻，即得。

2.2 造模、分組及給藥 112 只雄性C57BL／6 小鼠在相對濕度（55±5）%、溫度（23±2）℃的實(shí)驗室環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組（地塞米松，10 mg／kg）、枯芩醇提物低劑量組（3.28 g／kg）、枯芩醇提物高劑量組（6.56 g／kg）、子芩醇提物低劑量組（3.58 g／kg）、子芩醇提物高劑量組（7.16 g／kg），每組16只，給藥劑量為0.2 mL／10 g，正常組和模型組用蒸餾水灌胃。給藥7 d 后進(jìn)行造模，造模前24 h 禁食不禁水。第7天當(dāng)天灌胃2 h 后實(shí)驗組用LPS（10 mg／kg）滴鼻造模6 h，正常組滴鼻給予相同容量0.012 5 mL／10 g 磷酸鹽緩沖液。

2.3 樣品采集與處理 每組小鼠均分為2 批，1 批用于眼球取血及取肺組織，1 批用于肺泡灌洗［7］，眼球取血用于全血白細(xì)胞計數(shù)。采集小鼠肺組織，用PBS 沖洗干凈，右肺上葉置于4%多聚甲醛固定，用于常規(guī)石蠟包埋，制作石蠟切片，HE 染色，顯微鏡下觀察肺組織炎性細(xì)胞浸潤程度；右肺中葉稱濕重（wetweight，W），然后在干燥箱中以80 ℃烘48 h，測定干重（dryweight，D），以W／D評估肺組織的水腫程度［8］。左肺上葉用于MPO 活性測定和MDA水平測定，組織勻漿液于4 ℃、3 500 r／min 條件下離心10 min，取上清液，按照BCA、MPO 以及MDA 各試劑盒說明方法［9］測定蛋白濃度及MPO、MDA 水平。小鼠用水合氯醛麻醉后，剪開頸部皮膚，鈍性分離頸部氣管上方的肌肉，找到總氣管，用剪刀剪一個T 形小口，插管結(jié)扎，用預(yù)冷的0.1 mol／L 磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行全肺肺泡灌洗3 次，第1 次0.8 mL，第2 次0.5 mL，第3 次0.2 mL，每次抽洗都要勻速進(jìn)行，灌洗液（BALF）在4 ℃、1 500 r／min條件下離心10 min，取上清液，采用ELISA 試劑盒對BALF 中IL?6、IL?1β、TNF?α 水平進(jìn)行測定［10］。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS21.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織濕干比重（W／D）如圖1 所示，與正常組相比，LPS 誘導(dǎo)后小鼠肺組織W／D增大（P＜0.05），出現(xiàn)肺水腫；與模型組相比，枯芩、子芩醇提物高劑量組對小鼠急性肺損傷有改善作用，W／D下降（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組小鼠的肺組織濕干比重

3.2 小鼠肺組織病理切片 HE 染色（圖2）顯示，正常組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁較薄且無滲液，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增寬增厚，肺間質(zhì)出現(xiàn)水腫，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；各給藥組情況都有所改善，枯芩醇提物高劑量組優(yōu)于子芩醇提物各劑量組；枯芩醇提物高劑量組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡壁較模型組更薄，接近正常組。

圖2 各組小鼠肺組織病理切片（×200）

3.3 全血白細(xì)胞計數(shù) 如圖3 所示，與正常組比較，模型組全血白細(xì)胞計數(shù)增多（P＜0.01），說明出現(xiàn)炎癥；與模型組比較，枯芩醇提物各劑量組、子芩醇提物高劑量組全血白細(xì)胞計數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），說明小鼠急性肺損傷有所改善。

圖3 各組小鼠全血白細(xì)胞計數(shù)

3.4 丙二醛（MDA）水平 如圖4 所示，LPS 誘導(dǎo)后模型組的MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，枯芩、子芩醇提物各劑量組MDA 水平降低（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠MDA 水平

3.5 髓過氧化物酶（MPO）水平 如圖5 所示，LPS 誘導(dǎo)后模型組MPO 水平升高（P＜0.01），給藥組除子芩醇提物低劑量組外，MPO 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），對小鼠急性肺損傷均有顯著改善作用。

3.6 肺泡灌洗液（BALF）中IL?1β、IL?6、TNF?α 水平測定 如圖6 所示，LPS 誘導(dǎo)后模型組肺泡灌洗液（BALF）中IL?1β、IL?6、TNF?α 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，枯芩、子芩醇提物各劑量組IL?1β、TNF?α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），兩者高劑量組IL?6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

4 討論

圖5 各組小鼠MPO 水平

據(jù)文獻(xiàn)記載，在古代及現(xiàn)代上世紀(jì)七十年代前，臨床上習(xí)將黃芩分為子芩和枯芩使用，子芩主瀉大腸濕熱，枯芩主清肺胃上焦之熱，藥效確切。課題組前期研究已表明，枯芩在抑制肺炎鏈球菌以及抗炎的藥理作用上效果均明顯優(yōu)于子芩，與文獻(xiàn)相符。

急性肺損傷［11］（acute lung injury，ALI）是以低氧血癥和呼吸窘迫為臨床表現(xiàn)的危重癥，嚴(yán)重時呈急性呼吸窘迫綜合征，死亡率高達(dá)35%～55%，是呼吸內(nèi)科危重病，病勢迅猛。ALI 發(fā)病是由于肺內(nèi)過度、失控的炎性反應(yīng)所致?；邳S芩對肺部炎癥良好的治療作用，本實(shí)驗進(jìn)一步研究黃芩兩種規(guī)格飲片對急性肺損傷的改善作用，以期用新的病癥模型驗證枯芩對肺部病癥作用優(yōu)于子芩的科學(xué)性。

本研究以C57BL／6 雄性小鼠為研究對象，通過LPS 建立急性肺損傷模型，LPS 是革蘭陰性菌的主要致病成分［12］，是引起ALI 并最終導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一，LPS 刺激下，炎癥細(xì)胞迅速浸潤肺組織，引起中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤等炎癥細(xì)胞聚集［13］。根據(jù)LPS 造模后小鼠HE 病理切片所呈現(xiàn)的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，W／D升高，肺水腫，MDA、MPO 水平升高，小鼠肺組織發(fā)生了過氧化反應(yīng)，且過氧化降解產(chǎn)物水平升高，IL?6、IL?1β、TNF?α 和全血白細(xì)胞計數(shù)等指標(biāo)均增多，小鼠肺組織發(fā)生炎癥，炎癥細(xì)胞浸潤聚集肺組織。說明LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的癥狀與臨床上觀察到的病理癥狀相似，可見LPS 滴鼻誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型有效［14］。

本研究結(jié)果表明，陽性藥地塞米松、枯芩和子芩醇提物均對由LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷有改善作用，使模型組小鼠癥狀減輕，可抑制肺組織過氧化，減少M(fèi)PO、MDA等的生成和釋放，進(jìn)而減輕肺組織脂質(zhì)過氧化損傷。在生理條件下，IL?1β、IL?6、TNF?α 等炎癥因子水平非常低，但在病理條件刺激下會大量分泌及釋放［15］，本實(shí)驗表明用藥后可使炎癥因子IL?1β、IL?6、TNF?α 水平降低，并使全血白細(xì)胞數(shù)量生成減少，W／D降低，使肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤等情況得到改善。組間比較發(fā)現(xiàn)，枯芩組作用優(yōu)于子芩組，枯芩醇提物高劑量組改善效果最佳，接近正常組，進(jìn)一步驗證了枯芩相較子芩對肺部炎癥作用更有優(yōu)勢。綜上所述，本實(shí)驗可為黃芩在臨床應(yīng)用中有必要區(qū)分為子芩和枯芩提供實(shí)驗依據(jù)。

圖6 各組IL?1β、IL?6、TNF?α 水平