非瓣膜性心房顫動并發(fā)缺血性腦卒中病人NLRP3炎性小體與病情程度及預后的相關性分析

馬春茂，蘭德彬

非瓣膜性心房顫動(NVAF)是臨床常見的心律失常之一，同時也是誘發(fā)缺血性腦卒中發(fā)作的重要獨立危險因素[1]。近年來，相關研究顯示，炎癥可能參與了心房顫動引起的心房附壁血栓的形成，進而導致相關血栓栓塞事件的發(fā)生[2]。炎性小體NLRP3是免疫炎癥反應的重要組成部分，其通過激活炎性通路，促進炎癥反應的級聯(lián)放大，有研究顯示其參與了眾多炎癥性疾病如慢性阻塞性肺疾病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[3-4]。NLRP3炎性小體的激活可導致促炎細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)的合成與分泌，同時激活半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)凋亡通路，導致組織器官損傷及纖維化[5]。但NLRP3炎性小體能否有效預測NVAF并發(fā)缺血性腦卒中病人的病情嚴重程度及預后，相關臨床研究尚未闡明。本研究通過分析NVAF及NVAF并發(fā)缺血性腦卒中病人外周血單核細胞NLRP3炎性小體水平的變化情況，探討NLRP3炎性小體與NVAF并發(fā)缺血性腦卒中病人疾病嚴重程度及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月—2018年9月彭州市人民醫(yī)院收治住院的NVAF并發(fā)缺血性腦卒中病人160例作為觀察組，其中男96例，女64例，年齡58.4～83.2(71.1±10.27)歲。納入標準：24 h動態(tài)心電圖提示持續(xù)或永久性心房顫動；超聲心動圖排除瓣膜性疾病；缺血性腦卒中的診斷滿足第四屆全國腦血管病學術(shù)會議制定的診斷標準。排除標準：心臟瓣膜性疾病、甲狀腺功能亢進性心臟病、先天性心臟病等病人；嚴重肝腎功能不全病人；合并嚴重感染、自身免疫性疾病等可能對NLRP3炎性小體產(chǎn)生影響的病人。另選取同期160例NVAF無腦卒中病人為對照組。依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分對觀察組病情嚴重程度進行評分。根據(jù)觀察組病人臨床轉(zhuǎn)歸情況將其分為存活組(136例)與死亡組(24例)。該研究獲得了四川省彭州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，病人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 詳細記錄入選病人臨床資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)，記錄吸煙史、既往是否患有高血壓、糖尿病、冠心病、心房顫動類型及心房顫動病程等。根據(jù)CHADS2及腦卒中風險評分(CHA2DS2-VASc評分)標準，計算其評分情況。

1.2.2 相關實驗室指標檢測 所有病人入院后次日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，采用羅氏全自動生化分析儀檢測血常規(guī)、凝血常規(guī)、腎功能、生化常規(guī)等。

1.2.3 分離外周血單核細胞(PBMCs) 分別取觀察組和對照組病人靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管，按照1∶1比例與人外周血淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)混勻后離心，分離外周血單抗細胞，將1 mL Trizol加入外周血單抗細胞中混勻后備用。

1.2.4 qRT-PCR檢測炎性小體NLRP3及Caspase-1 mRNA水平 運用Trizol法提取兩組外周血單抗細胞總RNA，測定RNA濃度，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(Takara公司)進行逆轉(zhuǎn)錄。其中qPCR引物由上海生工公司設計合成，NLRP3上游引物：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物：5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′；Caspase-1上游引物：5′-ATCGCTTTCTGCTCTTCCAC-3′，下游引物：5′-TCCTCCACATCACAGGAACA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。依據(jù)TaKaRa公司提供的熒光定量PCR試劑盒說明書建立20 μL反應體系。結(jié)果分析以GAPDH為內(nèi)參，計算兩組相應基因的ΔΔCT值。

1.2.5 神經(jīng)功能缺損程度評分 采用NIHSS評分，由專業(yè)神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生對缺血性腦卒中病人神經(jīng)功能缺損程度進行評分，依據(jù)NIHSS評分將觀察組分為3組，NIHSS評分≤4分為低危組(56例)；NIHSS評分5～15分為中危組(54例)；NIHSS評分≥16分為高危組(50例)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓病、糖尿病、冠心病、心房顫動類型及心房顫動病程等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，觀察組CHADS2和CHA2DS2-VASc評分水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組外周血單核細胞NLRP3和Caspase-1 mRNA水平比較 與對照組比較，觀察組外周血單核細胞NLRP3和Caspase-1 mRNA水平升高(t=0.566，P<0.001；t=15.254，P<0.001)。詳見圖1。

圖1 兩組外周血單核細胞NLRP3和Caspase-1 mRNA水平比較

2.3 觀察組不同危重組間外周血NLRP3 mRNA及NIHSS評分水平比較 低危組、中危組及高危組間外周血NLRP3 mRNA及NIHSS評分比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高危組外周血NLRP3 mRNA及NIHSS評分水平最高，中危組次之，低危組最低，其中，兩兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3組間病死率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中高危組病死率最高，中危組次之，低危組最低。詳見表2。

2.4 觀察組不同預后組間外周血NLRP3 mRNA和NIHSS評分比較 死亡組外周血NLRP3 mRNA和NIHSS評分水平高于存活組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表2 不同危重組病人NLRP3mRNA、NIHSS評分及病死亡率比較

表3 不同預后組外周血NLRP3 mRNA和NIHSS評分比較 (±s)

2.5 相關性分析 觀察組病人外周血NLRP3 mRNA水平與NIHSS評分(r=0.761，P=0.019)、CHADS2評分(r=0.695，P=0.025)及CHA2DS2-VASc評分(r=0.720，P=0.022)呈正相關。將外周血NLRP3 mRNA與病人死亡率進行等級相關分析，結(jié)果顯示兩者呈正相關(r=0.670，P=0.00)。

2.6 外周血NLRP3 mRNA水平對NVAF并發(fā)缺血性腦卒中病人預后診斷的ROC曲線分析 通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，外周血NLRP3 mRNA的曲線下面積(AUC)為0.842(0.751～0.932)，其最佳工作點(OOP)為1.43，敏感性為87.50%，特異性為81.03%。詳見圖2。

圖2 外周血NLRP3 mRNA水平的ROC曲線

3 討 論

隨著我國人口老齡化進程的加快，NVAF已成為臨床最常見的心律失常之一，并且其發(fā)生率正呈逐年上升趨勢，相關研究顯示，其發(fā)生率在0.4%～1.0%[6]。心房顫動是血栓栓塞事件發(fā)生的最重要危險因素之一，有研究顯示，NVAF并發(fā)腦卒中的發(fā)生率是正常人的5～6倍，嚴重影響人們的健康及生活質(zhì)量[7]。外周血NLRP3 炎性小體與NVAF并發(fā)缺血性腦卒中病人病情及預后的關系如何，目前的相關研究報道還不很充分。

NLRP3炎性小體是由胞漿內(nèi)多種蛋白質(zhì)組成的復合體，含有凋亡相關微粒蛋白、Caspase-1等。在機體正常情況下，機體NLRP3炎性小體活性處于抑制狀態(tài)，但一旦機體處于炎癥狀態(tài)時，NLRP3炎性小體被激活，表達水平明顯上調(diào)[8]。在本研究中，通過檢測NVAF病人外周血NLRP3炎性小體水平，結(jié)果顯示NVAF并發(fā)腦卒中病人外周血NLRP3炎性小體水平較普通NVAF病人明顯升高，表明外周血NLRP3炎性小體可能與NVAF并發(fā)腦卒中的發(fā)生密切相關。通過相關性分析顯示，外周血NLRP3炎性小體水平與病人NIHSS評分具有相關性，即外周血NLRP3炎性小體水平與NIHSS評分呈正相關，提示NVAF并發(fā)腦卒中病人外周血NLRP3炎性小體水平越高，其病情越危重。外周血NLRP3炎性小體水平升高引起NVAF并發(fā)腦卒中的發(fā)生，可能與多種因素相互作用有關。有研究證實，外周血NLRP3炎性小體可直接促進低密度脂蛋白的氧化及脂質(zhì)的過氧化，引起氧自由基生成增加，損傷內(nèi)皮細胞，造成內(nèi)皮素及炎性因子的釋放，促進動脈粥樣硬化的形成，導致卒中發(fā)生[9]。其次，外周血NLRP3炎性小體可激活體內(nèi)血小板，促進血小板的黏附與聚集，導致血栓形成[10]。

本研究進一步分析外周血NLRP3炎性小體與NVAF并發(fā)腦卒中病人預后的關系，根據(jù)臨床結(jié)局，將病人分為存活組與死亡組，分析兩組外周血NLRP3炎性小體水平的差異。結(jié)果顯示，NVAF并發(fā)腦卒中死亡組外周血NLRP3炎性小體水平高于存活組，同時外周血NLRP3炎性小體與病人病死率呈正相關，提示外周血NLRP3炎性小體水平可有效反映NVAF并發(fā)腦卒中病人臨床預后。通過進一步做外周血NLRP3炎性小體水平ROC曲線分析判斷NVAF并發(fā)腦卒中病人預后，其曲線下面積較大，可作為判斷預后的有效指標。針對NVAF并發(fā)腦卒中病人，通過檢測外周血NLRP3炎性小體水平，不僅可作為評估病情嚴重程度及臨床預后的有效指標，還可在一定程度上為臨床治療提供靶點。

綜上所述，NVAF并發(fā)腦卒中病人外周血NLRP3炎性小體水平可有效反映病情嚴重程度及預后。但本研究也存在一定的局限性，由于NVAF并發(fā)腦卒中病人樣本量偏小，需要進一步加大樣本量，采取多中心分析外周血NLRP3炎性小體在評估NVAF并發(fā)腦卒中病人病情嚴重程度及預后的臨床價值。