38例胎兒心臟腫瘤的超聲、病理及遺傳學(xué)特點(diǎn)分析

陳 健，谷孝艷，韓 玲，郝曉艷，劉曉偉，張 燁，韓建成，何怡華

原發(fā)性心臟腫瘤是一種罕見(jiàn)疾病，嬰幼兒發(fā)病率約為0.25%，而尸檢結(jié)果其發(fā)病率更低，約為0.002%[1]。隨著產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)越來(lái)越多的胎兒心臟腫瘤被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，其中絕大部分為超聲檢出，尤其是胎兒超聲心動(dòng)圖(fetal echocardiography，F(xiàn)E)[2]。大多數(shù)原發(fā)性心臟腫瘤都是良性，其中最常見(jiàn)為橫紋肌瘤，其次為畸胎瘤、纖維瘤、血管瘤、嗜酸性細(xì)胞心肌增生(癥)、黏液瘤等；極少數(shù)為惡性腫瘤，如橫紋肌瘤肉瘤、纖維肉瘤等[2-3]。多數(shù)心臟腫瘤對(duì)心臟本身的影響較小，常見(jiàn)的心臟腫瘤并發(fā)癥為心臟雜音、心包積液、心律失常、瘤體引起的機(jī)械梗阻及心力衰竭等，其治療措施在妊娠期比較有限，少數(shù)位于胎兒心包腔的腫瘤如畸胎瘤可以在妊娠期手術(shù)切除，多數(shù)需要在產(chǎn)后進(jìn)行處理，通常預(yù)后良好[4]。

心臟腫瘤也可以是一些系統(tǒng)性遺傳疾病的首發(fā)癥狀，如結(jié)節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex，TSC)、家族性黏液瘤綜合征(呈多系統(tǒng)黏液瘤樣表現(xiàn)，可累計(jì)皮膚、羊膜、心臟、乳房、腎上腺、垂體及睪丸等)、痣樣基底細(xì)胞癌綜合征和Beckwith-Wiedemann綜合征(巨大兒、巨舌癥、臍膨出)等[5]，其中與TSC密切相關(guān)的腫瘤最常見(jiàn)的為心臟橫紋肌瘤[6]。TSC是一種常染色體顯性遺傳疾病，累及多系統(tǒng)，常常預(yù)后不良，目前發(fā)現(xiàn)TSC1和TSC2基因與其存在密切的關(guān)系，2012年國(guó)際TSC大會(huì)已經(jīng)將TSC1和TSC2基因的致病性突變作為一項(xiàng)單獨(dú)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。

本研究的目的是篩選臨床通過(guò)超聲心動(dòng)圖檢出的胎兒心臟腫瘤病例，對(duì)其超聲心動(dòng)圖及其對(duì)應(yīng)的病理檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行家系遺傳學(xué)檢測(cè)，深入探討胎兒心臟腫瘤的發(fā)病特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 入選2015年9月—2018年2月38例因胎兒心臟腫瘤來(lái)北京安貞醫(yī)院母胎醫(yī)學(xué)會(huì)診中心就診的孕婦及其家系入組。所有胎兒均在本中心接受了胎兒超聲心動(dòng)圖檢查，均診斷出單發(fā)或多發(fā)心臟腫瘤。同時(shí)經(jīng)知情同意，所有家系均選擇在產(chǎn)前或產(chǎn)后接受家系TSC目標(biāo)基因檢測(cè)。根據(jù)2012年國(guó)際TSC協(xié)會(huì)發(fā)布的TSC診斷修訂標(biāo)準(zhǔn)，入選的胎兒及父母均需要完善相關(guān)檢查，對(duì)其臨床表型進(jìn)行確認(rèn)。

1.2 知情同意 本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有接受基因檢測(cè)的病人或監(jiān)護(hù)人均需要簽署知情同意書(shū)，胎兒病理解剖需要家屬簽署病理解剖知情同意書(shū)，對(duì)于無(wú)法簽署上述知情同意的家系將不納入本研究。

1.3 胎兒超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 使用GE-E8超聲診斷儀，RAB 4-8-D三維容積探頭，F(xiàn)etal Heart模式，根據(jù)2013國(guó)際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)(International Society of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology，ISUOG) FE指南采集各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)切面圖像，主要包括：心尖或肋下四腔心切面、主動(dòng)脈長(zhǎng)軸切面、肺動(dòng)脈長(zhǎng)軸切面、心室短軸切面、大血管短軸切面、主動(dòng)脈弓切面、導(dǎo)管弓切面、上下腔靜脈切面和三血管切面；重點(diǎn)觀(guān)察心腔及心肌內(nèi)有無(wú)占位性病變[9]。

1.4 樣本采集 對(duì)孕婦及其家屬采集外周血進(jìn)行基因檢測(cè)，用4 mL乙二胺四乙酸(ethylene diaminete traacetic acid，EDTA)抗凝管采集血樣，每人兩管；通過(guò)羊水穿刺/臍帶血管穿刺抽取胎兒羊水/臍帶血來(lái)進(jìn)行疑似TSC的胎兒目標(biāo)基因檢測(cè)，羊水采集量為20 mL，臍帶血采集量為4 mL。對(duì)于選擇終止妊娠的孕婦，對(duì)胎兒進(jìn)行病理解剖并取樣送檢基因，取樣部位為胎兒皮膚、心肌及臍帶組織，每個(gè)部位大小為5 mm×5 mm。

血液樣品使用冰盒運(yùn)輸，24 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。羊水樣品要求采集后2 h內(nèi)進(jìn)行離心處理，然后使用冰盒運(yùn)輸，24 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.5 基因檢測(cè) 使用標(biāo)準(zhǔn)程序從組織、羊水/臍帶血、外周血樣里提取DNA。本測(cè)試采用自主研發(fā)的探針捕獲試劑，針對(duì)引起多發(fā)性結(jié)節(jié)硬化癥的TSC1、TSC2基因，進(jìn)行全基因序列捕獲，覆蓋區(qū)域約為368 kb。富集后在Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，平均覆蓋深度大于100X。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量的過(guò)濾，然后利用標(biāo)準(zhǔn)生物信息分析流程對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行檢出、過(guò)濾和注釋。

變異位點(diǎn)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)包括人群數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率(ExAC或千人基因組)<5%、最小覆蓋深度為20X，變異功能變化(非同義突變、剪切位點(diǎn)變化、無(wú)義突變、移碼突變等)等。使用BWA將測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)基因組序列(hg19)比對(duì)，通過(guò)samtools和pindel軟件工具找出相關(guān)突變；接著結(jié)合dbSNP、OMIM及swissVar數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢出突變進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾；最后使用Provean和SIFT軟件對(duì)突變的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)。所有被檢出的致病突變和疑似致病突變均再次進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 臨床醫(yī)生與基因分析專(zhuān)員會(huì)對(duì)檢出突變的生物信息、病人臨床表型、臨床癥狀以及就診治療情況進(jìn)行綜合分析，基于以上信息綜合做出遺傳學(xué)診斷和預(yù)后分析。

2 結(jié) 果

2.1 胎兒及其家系檢測(cè)分析 共檢測(cè)分析了38例胎兒及其家系(見(jiàn)表1)。入選孕婦年齡19～42歲，中位數(shù)為28歲；孕齡23～38周，中位數(shù)為27周。所有胎兒均經(jīng)胎兒超聲心動(dòng)圖檢出心臟腫瘤，其中多發(fā)腫瘤30例，單發(fā)腫瘤8例。所有38例胎兒均成功接受了基因檢測(cè)，其中產(chǎn)前羊水穿刺或臍帶血穿刺取樣6例，32例為引產(chǎn)后提取胎兒相關(guān)DNA樣本。最終38例孕婦及家屬均決定終止妊娠，并且接受了胎兒病理解剖。

表1 38例胎兒心臟腫瘤一般資料、超聲及臨床特點(diǎn)

(續(xù)表)

2.2 胎兒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果 38例胎兒心臟腫瘤中，多發(fā)性腫瘤30例，單發(fā)性腫瘤8例。腫瘤以多發(fā)為主，最常累及的位置是左室，累及次數(shù)為33次，其次是右室，累及次數(shù)為23次；腫瘤最大徑約為33.0 mm，最小徑為4.6 mm；大多數(shù)腫瘤位于心腔內(nèi)或心肌，與正常心肌組織分界尚清，僅有1例出現(xiàn)向外生長(zhǎng)累及心包腔的情況。8例(15%)胎兒出現(xiàn)心臟腫瘤并發(fā)癥，其中，4例瘤體引起的機(jī)械梗阻，3例心包積液，1例心律失常。其中12號(hào)家系胎兒的心臟腫瘤與主動(dòng)脈瓣關(guān)系緊密，并有輕度的粘連，導(dǎo)致明顯的左室流出道梗阻。這8例存在心臟腫瘤并發(fā)癥的家系均選擇終止妊娠，病理結(jié)果顯示其心臟腫瘤均為橫紋肌瘤。典型胎兒超聲心動(dòng)圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 胎兒超聲心動(dòng)圖四腔心切面(一)

圖2 胎兒超聲心動(dòng)圖四腔心切面(二)

2.3 胎兒心臟腫瘤病理及基因檢測(cè)結(jié)果 38例胎兒心臟腫瘤家庭均選擇終止妊娠，并接受了胎兒心臟病理檢查，結(jié)果顯示其中36例為橫紋肌瘤(其中多發(fā)橫紋肌瘤29例，單發(fā)橫紋肌瘤7例，見(jiàn)圖 3)，1例為多發(fā)性血管瘤，1例為單發(fā)性纖維瘤(見(jiàn)表2)。TSC基因檢測(cè)結(jié)果顯示，除1例血管瘤和1例纖維瘤外，橫紋肌瘤病例中，29例多發(fā)橫紋肌瘤TSC基因陽(yáng)性27例(93%，27/29)，7例單發(fā)橫紋肌瘤TSC基因檢測(cè)陽(yáng)性5例(5/7)。4例胎兒橫紋肌瘤家系基因檢測(cè)結(jié)果均為陰性，其中單發(fā)和多發(fā)橫紋肌瘤各2例。

圖3 胎兒大體解剖圖

表2 38例胎兒心臟腫瘤病理類(lèi)型與基因?qū)φ?單位：例

2.4 TSC1和TSC2基因家系檢測(cè)結(jié)果 38例胎兒及父母均接受了TSC1和TSC2目標(biāo)基因檢測(cè)，其中通過(guò)32例為引產(chǎn)后提取胎兒相關(guān)DNA樣本，4例為產(chǎn)前臍帶血管穿刺取樣，2例為通過(guò)產(chǎn)前羊水穿刺取樣。共有32例胎兒TSC基因檢測(cè)陽(yáng)性，TSC1突變5例，TSC2突變27例，均為致病或疑似致病的突變，在基因?qū)W方面可確診TSC。在上述32個(gè)突變中，新發(fā)突變20例，家系遺傳突變12例(見(jiàn)表3)。少數(shù)胎兒在影像學(xué)及病理檢查中被發(fā)現(xiàn)有其他系統(tǒng)病變：1例胎兒尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)存在明顯的多發(fā)皮膚白斑；5例胎兒在晚孕期胎兒頭部核磁檢查顯示出現(xiàn)室管膜下多發(fā)結(jié)節(jié)。

表3 38例胎兒心臟腫瘤TSC基因檢測(cè)結(jié)果 單位：例

3 討 論

橫紋肌瘤是胎兒期最常見(jiàn)的心臟腫瘤[10]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，尸檢胎兒中橫紋肌瘤占比為95%。胎兒的孕周對(duì)于胎兒心臟腫瘤的發(fā)現(xiàn)有較大的影響，本研究中超聲心動(dòng)圖檢出心臟腫瘤的孕周中位數(shù)達(dá)27周，最小孕周為23周。在合適的孕齡，所有心臟腫瘤均能被FE檢出，主要使用切面為四腔心切面。對(duì)于高危家系，孕期FE篩查時(shí)間越早越好，但最佳檢測(cè)時(shí)間為孕中期，但對(duì)于直徑小于3 mm的腫瘤，超聲心動(dòng)圖可能會(huì)出現(xiàn)漏診，對(duì)于可疑病例推薦有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生連續(xù)多次掃查[11]。總體來(lái)說(shuō)，權(quán)衡檢出率、病人接受度和經(jīng)濟(jì)適用性等方面的因素，F(xiàn)E檢測(cè)是目前最適合的篩查方式。

心臟橫紋肌瘤的生長(zhǎng)具有雙向性，在孕32周左右部分橫紋肌瘤開(kāi)始出現(xiàn)退化的趨勢(shì)，并持續(xù)至出生后一年[5]。而引起心臟橫紋肌瘤出現(xiàn)自限性表現(xiàn)的主要因素就是腫瘤里的“蜘蛛樣細(xì)胞”，其并非真正的腫瘤細(xì)胞，而是富含糖原的異型心肌細(xì)胞，其不斷增大的糖原空泡會(huì)使細(xì)胞質(zhì)絲退化，最終結(jié)局為凋亡、壞死和黏液樣變性[1]。腫瘤的退化與腫瘤的大小、數(shù)目及位置并沒(méi)有明顯的關(guān)系。約80%的心臟橫紋肌瘤會(huì)在兒童期退化直至自行消失[12]，因此，胎兒期是檢出心臟橫紋肌瘤的最佳時(shí)間段。本研究中大多數(shù)心臟腫瘤局限于心腔內(nèi)，并且生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，僅有8例(21%)胎兒出現(xiàn)心臟并發(fā)癥，且沒(méi)有出現(xiàn)影響胎兒生命的嚴(yán)重并發(fā)癥。

胎兒心臟橫紋肌瘤在TSC的眾多臨床表現(xiàn)中，可能是其最早的表現(xiàn)之一[13]。因此，F(xiàn)E對(duì)于胎兒心臟橫紋肌瘤的識(shí)別具有重要的診斷意義，本研究中93%(27/29)的多發(fā)橫紋肌瘤胎兒基因檢測(cè)陽(yáng)性，這也證實(shí)了多發(fā)的心臟橫紋肌瘤是TSC強(qiáng)有力預(yù)測(cè)因子[14]。而單發(fā)的心臟橫紋肌瘤情況則略有不同，既往的研究顯示約50%的單發(fā)橫紋肌瘤合并TSC[2]，但本研究中共有7例單發(fā)心臟橫紋肌瘤經(jīng)病理證實(shí)，其中5例TSC1或TSC2基因檢測(cè)陽(yáng)性，4例為新發(fā)突變，1例為家系遺傳突變。本研究結(jié)果顯示單發(fā)心臟橫紋肌瘤與TSC也有著較高的相關(guān)性，其原因可能是本研究依據(jù)病理結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，而不是僅僅根據(jù)FE，排除了非橫紋肌瘤病例的影響，但病例數(shù)較少，仍需增加病例進(jìn)一步證實(shí)。

FE難以對(duì)非TSC的心臟橫紋肌瘤與合并TSC的心臟橫紋肌瘤進(jìn)行鑒別，2012年國(guó)際TSC大會(huì)對(duì)TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂，將基因診斷作為一個(gè)單獨(dú)診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此，F(xiàn)E聯(lián)合基因診斷可將產(chǎn)前診斷TSC變?yōu)榭赡躘8]。TSC1基因和TSC2基因分別位于染色體9q34和16p13.3，分別參與編碼形成錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白和馬鈴薯蛋白，形成TSC蛋白復(fù)合體，對(duì)雷帕霉素靶蛋白(mTOR1)信號(hào)通路起到關(guān)鍵的抑制調(diào)控作用[15]。常規(guī)外周血外顯子測(cè)序，約有85%的TSC病人檢測(cè)出明確的TSC1或TSC2致病突變[16]；通過(guò)改進(jìn)檢測(cè)方法如增加測(cè)序深度等和增加樣本取材部位等，剩余病人中2/3能夠被檢測(cè)出非常規(guī)位置的TSC1或TSC2突變，包括內(nèi)含子區(qū)域突變或嵌合體形成[17]。目前研究顯示沒(méi)有證據(jù)支持存在新的TSC致病基因[18]。因此，基因診斷對(duì)于TSC的臨床診斷是一個(gè)重要的補(bǔ)充，尤其是對(duì)于臨床表型不明顯的胎兒。

隨著對(duì)胎兒心臟病圍生期管理的關(guān)注以及多學(xué)科協(xié)作醫(yī)療模式的廣泛開(kāi)展，越來(lái)越關(guān)注的不僅是產(chǎn)前胎兒心臟疾病的檢出，更多的是對(duì)每一種疾病給予正確的預(yù)后咨詢(xún)和圍生期管理。對(duì)于胎兒橫紋肌瘤而言，預(yù)后咨詢(xún)指導(dǎo)中不單純向孕婦及家屬介紹腫瘤本身的預(yù)后，還要注重交代橫紋肌瘤與TSC的關(guān)系及TSC的預(yù)后，并為可能的早期治療做好準(zhǔn)備。