基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法研究六堡茶干預(yù)COVID-19的活性成分

周丹水，陳小雪，吳志敏，倪維鞠，邱瑞瑾，于翠平，藍(lán)倫禮，王穎芳，陳守登，曾 宇*

（1廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院廣東省生物醫(yī)學(xué)影像重點實驗室，珠海519000；3梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，梧州市六堡茶研究院，梧州543002；4桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林541199）

世界衛(wèi)生組織于2020年2月11日將新型冠狀病毒感染引起的肺炎命名為“COVID-19”（coronavirus disease 2019），其病毒被命名為SARS-CoV-2［1］。在我國及日本、韓國、意大利、美國等國家流行，此次引起流行的病原為一種新發(fā)現(xiàn)的β屬冠狀病毒，感染患者會出現(xiàn)以下主要臨床癥狀：發(fā)熱、咳嗽、乏力及呼吸困難等，重癥感染患者則出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征及膿毒性休克等，甚至造成死亡［2］。截至2020年3月31日，全球流行病病例報告，累計確診病例1 033 666例，累計死亡病例54 360例。目前，臨床治療尚無特效的藥物與疫苗，其治療方案主要采用抗病毒藥物，如洛匹那韋、利托那韋及利巴韋林等，尚無循證依據(jù)支撐。相比之下中醫(yī)具有整體觀與辨證論治的特點及優(yōu)勢。中醫(yī)各名家分析COVID-19屬于“疫病”范疇，其病機(jī)涉及寒濕郁肺、濕熱蘊(yùn)肺、濕毒郁肺?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行）》第3～7版中，中藥以及成方制劑均發(fā)揮了較好的療效。《神農(nóng)本草經(jīng)》中有“神農(nóng)嘗百草，一日遇七十二毒，得茶而解之”的記載。六堡茶原料為山茶科植物茶樹（Camellia sinensis L.O.Kunts）的鮮葉，屬黑茶類，選用蒼梧縣群體種、廣西大中葉種及其分離、選育的品種、品系茶樹的鮮葉為原料，按特定的工藝進(jìn)行加工，具有獨特品質(zhì)特征的后發(fā)酵茶。六堡茶具有消暑祛濕、明目清心、幫助消化的功效?！皾瘛笔荂OVID-19病機(jī)中的關(guān)鍵因素，對于濕邪內(nèi)生所致疫病的治療應(yīng)以兼顧清熱與化濕為要，并強(qiáng)調(diào)固護(hù)中焦脾胃［3］，與六堡茶獨特的清熱祛濕功效具有一定聯(lián)系。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，作為系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)等多學(xué)科交叉的新興學(xué)科，其整體性和系統(tǒng)性與中醫(yī)藥理論高度貼切，也符合了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的主題［4-5］。分子對接技術(shù)融合了結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)和計算機(jī)輔助藥物設(shè)計，通過對接配體-蛋白預(yù)測配體與已知三維結(jié)構(gòu)蛋白的主要結(jié)合方式以及結(jié)合親和力，已經(jīng)被廣泛用于篩選活性結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化潛在先導(dǎo)化合物等藥物設(shè)計方面［6］。上?？萍即髮W(xué)饒子和、楊海濤團(tuán)隊快速解析了SARS-CoV-2 3CL水解酶（Mpro）的晶體結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是SARSCoV-2病毒的有效靶點，為篩選抗SARS-CoV-2的活性成分提供了基礎(chǔ)。Mpro在新冠病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄周期中起關(guān)鍵作用，是冠狀病毒的潛在作用靶點［7-8］，尋找 Mpro抑制劑成為 COVID-19 干預(yù)的關(guān)鍵。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)聯(lián)合分子對接實驗驗證，系統(tǒng)探討了六堡茶中干預(yù)COVID-19的核心藥效成分、關(guān)鍵靶標(biāo)及信號通路，為后期六堡茶的藥理作用機(jī)制研究及其開發(fā)提供參考，同時為COVID-19提供新的預(yù)防及治療方案。

1 材 料

1.1 試劑

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、三羥基甲基氨基甲烷［Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris base］、氯化鈉、咪唑、2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，BME）、LB培養(yǎng)基（美國西格瑪奧德里奇公司）；熒光底物MCA-AVLQ↓SGFR-Lys（Dnp）-Lys-NH2、苯甲 基磺酰（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 儀器

鎳離子金屬螯合色譜柱（Ni sepharose 6 fast flow）、Hitrap Q FF column陰離子交換色譜柱、HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝膠過濾色譜柱（美國思拓凡公司）；發(fā)光板（廣州潔特生物過濾有限公司）；EnVision多模式微孔板檢測儀（美國珀金埃爾默儀器有限公司）。

1.3 軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）［9］（http：//tcmspw.com/）；化 學(xué) 專 業(yè) 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www. organchem. csdb. cn/scdb/default.asp）；UniProt數(shù)據(jù)庫［10］（https：//www.uniprot.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫［11］（http：//www.genecards.org/）；DAVID 數(shù) 據(jù) 庫［12］（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）；Metascape 數(shù) 據(jù) 庫［13］（http：//metascape.org/gp/）；STRING 數(shù) 據(jù) 庫［14］（https：//string-db.org/）；PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）；PubChem 數(shù)據(jù) 庫［15］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Cytoscape 3.7.1 軟件［16］；AutoDock Vina 1.1.2［17］軟件；Pymol軟件；Chem3D軟件；Graphpad Prism 8軟件；Omishare在線繪圖（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）；Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）。

2 方 法

2.1 六堡茶相關(guān)化合物的收集與篩選

本研究通過相關(guān)文獻(xiàn)閱讀結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫對六堡茶的化學(xué)成分進(jìn)行收集與整理。根據(jù)ADME原理，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是指藥物經(jīng)口服給藥后吸收進(jìn)入全身血液循環(huán)的相對量，一般認(rèn)為高口服生物利用度是衡量生物活性分子成藥性的重要參數(shù)；類藥性（druglikeness，DL）指的是體現(xiàn)化合物與已知藥物的相似性，是評價化合物是否可作為藥物的重要指標(biāo)［18］?；衔锏腛B、DL越高，說明該化合物越有臨床藥用的價值。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的推薦，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為六堡茶活性化合物的篩選條件，篩選出符合條件的活性化合物。

2.2 “六堡茶－成分－靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“2.1”項中篩選出的六堡茶活性化合物借助TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測各活性化合物作用靶標(biāo)，然后將靶標(biāo)蛋白名導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫，以“reviewed”“human”作為篩選條件進(jìn)行靶標(biāo)蛋白與對應(yīng)人源物種標(biāo)準(zhǔn)基因名的轉(zhuǎn)化。將六堡茶活性成分的預(yù)測作用靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“六堡茶－成分－靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)并對此進(jìn)行可視化展示和拓?fù)鋮?shù)分析。

2.3 COVID-19疾病靶點的獲取

通 過 GeneCards數(shù) 據(jù) 庫 ，以“coronavirus”“pneumonia”為關(guān)鍵詞對新冠肺炎的靶點進(jìn)行收集，將兩個關(guān)鍵詞檢索出來的疾病靶點取并集，剔除重復(fù)基因后作為COVID-19疾病靶點集以用于后續(xù)分析。使用Venny 2.1網(wǎng)站將六堡茶活性成分的作用靶標(biāo)與所得的疾病靶點集進(jìn)行匹配取兩者的交集基因，得到六堡茶潛在干預(yù)COVID-19的靶點集。

2.4 六堡茶潛在干預(yù)COVID-19的作用靶標(biāo)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點的篩選

STRING數(shù)據(jù)庫是一個在線搜索已知蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫。將六堡茶潛在干預(yù)COVID-19的靶點集導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“Homo sapiens”，設(shè)置高置信度（“high confidence（0.700）”），獲得蛋白相互作用關(guān)系（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，并隱藏在該網(wǎng)絡(luò)中與其他靶標(biāo)無互作關(guān)系的靶標(biāo)。隨后利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“network analysis”功能對靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析。以節(jié)點連接度（degree）、中心節(jié)點介度（betweenness centrality）、中心節(jié)點緊密度（closeness centrality）為篩選條件篩選出核心靶標(biāo)，并將多重篩選的過程進(jìn)行可視化。將篩選出來的核心靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，并使用該軟件的mcode插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析。

2.5 對核心靶點進(jìn)行GO（gene ontology）富集分析和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析

為了進(jìn)一步挖掘六堡茶干預(yù)COVID-19的核心靶點在生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）、細(xì)胞組成（cellular component）以及KEGG通路中發(fā)揮的作用。本研究將“2.4”項中篩選出來的核心靶標(biāo)分別導(dǎo)入DAVID和Metascape數(shù)據(jù)庫中，將所有靶標(biāo)基因校正為官方標(biāo)準(zhǔn)基因名，選定物種為“Homo sapiens”。對核心靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析后，將上述兩個數(shù)據(jù)庫的富集結(jié)果綜合并進(jìn)行可視化處理。

對自我羞恥控制條件和羞恥條件的親社會行為評分進(jìn)行配對樣本t檢驗(見表2)，結(jié)果顯示，羞恥條件的親社會行為評分顯著高于控制條件的評分，t(29)=3.44，p<0.01，Cohen’d=0.62，說明羞恥情緒的誘發(fā)促進(jìn)了大學(xué)生的親社會行為。個體體驗到羞恥情緒后想要從負(fù)性情緒中逃離出來，而親社會傾向能夠與他人建立良好的關(guān)系，注意力得到轉(zhuǎn)移。因而在體驗到羞恥情緒后，個體具有做出親社會行為的傾向。

2.6 分子對接驗證

從PubMed數(shù)據(jù)庫獲取六堡茶活性化合物小分子配體結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入到Chem3D軟件進(jìn)行能量最小化，保存為*pdb格式。通過PDB數(shù)據(jù)庫下載SARS-CoV-2 3CL水解酶（Mpro，PDB ID：6LU7）*pdb格式的蛋白結(jié)構(gòu)（該結(jié)構(gòu)由上?？萍即髮W(xué)饒子和、楊海濤課題組解析）。采用Pymol軟件對受體蛋白進(jìn)行加氫、移除溶劑分子、分離原配體等預(yù)處理，再借助Autodock tool對蛋白質(zhì)受體進(jìn)行原子類型定義、電荷計算、非極性氫合并，最后輸出為*pdbqt格式。將Mpro自帶的配體視為活性結(jié)合位點，根據(jù)該位點設(shè)置grid box大小和坐標(biāo)最后運用Autodock Vina 1.1.2進(jìn)行對接。根據(jù)親和力（affinity）篩選出最佳構(gòu)象后用Pymol軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化以及分析。

2.7 SARS-CoV-2 3CL水解酶的異源重組表達(dá)與純化

根據(jù)文獻(xiàn)［19］報道，將野生型全長Mpro（Gen-Bank，MN908947.3）構(gòu)建至 pGEX-6p-1表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。選取單克隆接種于含氨芐（100 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL）的LB培養(yǎng)基100 mL中，于37℃過夜培養(yǎng)，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至含有含氨芐（100 μg/mL），氯霉素（34 μg/mL）LB培養(yǎng)基1 L的搖瓶中，37℃培養(yǎng)至A6000.7～1.0，于4℃靜置降溫30～60 min加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，16℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜。18℃，5 000 r/min，12 min離心培養(yǎng)液收集菌體，用裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L NaCl，30 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L BME）重懸，低溫超高壓細(xì)胞破碎儀裂解。4℃，18 000 r/min，50 min高速離心裂解液，上清液用0.2 μm的濾膜過濾，將上清液進(jìn)行鎳離子金屬螯合色譜，用洗滌液（20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L NaCl，30 mmol/L 咪 唑 ，2 mmol/L BME）去除雜蛋白，再以洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，2 mmol/L BME）洗脫目標(biāo)蛋白。以人鼻病毒3C蛋白酶切6×His標(biāo)記的Mpro，去除6×His標(biāo)簽，用SDS-PAGE鑒定酶切結(jié)果。隨后進(jìn)行Hitrap Q FF column陰離子交換色譜及HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝膠過濾色譜［20］。純化的蛋白保存于50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.3），1 mmol/L EDTA，通過SDS-PAGE檢測蛋白純度后將其分裝并于-80℃保存。

2.8 （-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對SARS-CoV-2 3CL水解酶的酶活性抑制試驗

酶活性抑制實驗在過往研究中已有報道［21］。本實驗的熒光底物為MCA-AVLQ↓SGFR-Lys（Dnp）-Lys-NH2，其中↓為Mpro酶切位點，反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.3），1 mmol/L EDTA）。用反應(yīng)緩沖液配制和稀釋1 mmol/L EGCG和4 μmol/L的Mpro母液，用二甲基亞砜配制400 μmol/L熒光底物母液。在發(fā)光板中加入終濃度為0～40 μmol/L的EGCG，再加入終濃度0.2 μmol/L Mpro。30℃振蕩孵育2 min，隨后于冰上靜置5 min。快速加入終濃度為20 μmol/L多肽底物，30℃振蕩孵育5 s后，立即以激發(fā)光320 nm，發(fā)射光405 nm進(jìn)行熒光檢測。每個濃度進(jìn)行3次平行檢測，因EGCG自身有熒光，故設(shè)定只含EGCG（不含Mpro和底物）為空白組，進(jìn)行實驗結(jié)果校正。抑制率（%）=（1-實驗組的反應(yīng)初速率/不含EGCG的對照組的反應(yīng)初速率）×100。通過對各濃度的時間-熒光強(qiáng)度曲線中的前400 s進(jìn)行線性擬合，所得斜率即為各組濃度的酶反應(yīng)初始速率，從而計算不同濃度EGCG對Mpro的抑制率。實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié) 果

3.1 六堡茶有效成分的篩選結(jié)果

通過相關(guān)文獻(xiàn)以及結(jié)合TCMSP，共整理得到468種六堡茶成分。按照OB≥30%、DL≥0.18篩選條件以及剔除無預(yù)測靶點的化合物，得到6個活性成分，其中有3種屬于兒茶素類（表1）。

Table 1 Active ingredients of Liupao tea

（Continued）

3.2 “六堡茶－成分－靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)的分析

通過排除無對應(yīng)人源物種標(biāo)準(zhǔn)基因名的靶標(biāo)蛋白及刪除重復(fù)基因靶點，得出的6個六堡茶活性成分對應(yīng)靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，所得共同靶點112個。在“六堡茶－成分－靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果中，節(jié)點（node）表示有效成分和靶點基因，邊數(shù)（edge）表示節(jié)點與節(jié)點之前的連接，連接度（degree）是在網(wǎng)絡(luò)分析中刻畫節(jié)點中心性（centrality）的最直接度量指標(biāo)。一個節(jié)點的連接度越大就意味該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。中心節(jié)點介度（betweenness centrality）是以經(jīng)過某個節(jié)點的最短路徑數(shù)目來刻畫節(jié)點重要性的指標(biāo)。中心節(jié)點緊密度（closeness centrality）反映在網(wǎng)絡(luò)中某一節(jié)點與其他節(jié)點之間的接近程度。如圖1可知，該網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點163個，其中紫色方形代表六堡茶活性成分，綠色圓形代表作用靶標(biāo)，淺黃色菱形代表六堡茶。從圖中可知，六堡茶中存在一個化合物對應(yīng)多個靶點及多個化合物共同作用于一個靶點，體現(xiàn)了藥物多成分多靶點共同作用的復(fù)雜體系。

Figure 1 Compound-Target network diagram of active compounds of Liupao tea

3.3 核心靶標(biāo)的篩選及其蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

六堡茶潛在干預(yù)COVID-19的靶點集導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，并運用Cytoscape 3.7.1軟件中的“network analysis”功能對靶點PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析后，將節(jié)點連接度、中心節(jié)點介度、中心節(jié)點緊密度作為篩選條件對112個靶標(biāo)進(jìn)行篩選，篩選出MAPK1、IL-6、TP53、TNF等38個核心靶標(biāo)。從圖2中可以看到，彼此兩個蛋白之間的連線不止一條，這表示蛋白之間存在多種相互作用關(guān)系。對這38個核心靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龊?，其中?jié)點連接度排名前五的核心靶標(biāo)分別為STAT3、MAPK1、RELA、EGFR和MAPK3。然后運用 Cytoscape 3.7.1軟件對38個核心靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分解，識別到網(wǎng)絡(luò)中有4個連接緊密的子模塊，這種子模塊代表某些功能密切相關(guān)的蛋白之間相互作用而完成某種特定的分子功能。

3.4 關(guān)鍵靶點的GO富集分析和KEGG通路富集分析

從本研究的GO富集分析結(jié)果（圖3）可知，根據(jù)顯著性程度P＜0.01確定了523個GO條目。其中核心靶點富集在生物過程中的有445個GO條目，主要包括對脂多糖的應(yīng)答、對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)等；富集在細(xì)胞組分中的包括膜筏、線粒體、胞質(zhì)、核漿等24條；富集在分子功能中的包括蛋白質(zhì)結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等54條。在顯著性程度P＜0.01的基礎(chǔ)上，以基因富集數(shù)排序，生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）、細(xì)胞組成（cellular component）各選取排名前10的GO條目進(jìn)行可視化。

3.5 六堡茶活性成分作用于SARS-CoV-2 3CL水解酶的分子對接

Autodock Vina軟件采用半經(jīng)驗打分方程對分子配體與受體蛋白結(jié)合的能力進(jìn)行評估，兩者結(jié)合的能量越低，越有利于構(gòu)象的穩(wěn)定。當(dāng)結(jié)合能小于等于-5.0 kJ/mol時，一般認(rèn)為配體和受體結(jié)合較好。由對接結(jié)果可知，六堡茶的6個活性化學(xué)成分：（+）-兒茶素、（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、α-菠甾醇、（-）-兒茶素沒食子酸酯、角鯊烯、氯化天竺葵素，與Mpro結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，如表2所示，與受體蛋白Mpro結(jié)合較好，結(jié)合位點均與原配體N3抑制劑所在的結(jié)合口袋區(qū)域相近，由此提示六堡茶具有發(fā)揮干預(yù)新型冠狀病毒的潛在作用，且結(jié)合能與目前使用較多的部分抗病毒藥物相近，如圖5所示。

3.6 （-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯對SARSCoV-2 3CL水解酶活性抑制試驗

Figure 3 GO（gene ontology）enrichment analysis of the core target of Liupao tea BP:biological process;MF:molecular function;CC:cellular component

Figure 4 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）pathway enrichment analysis of the core target of Liupao tea

Table 2 Docking results of active ingredients and some chemical drugs with SARS-CoV-2 3CL hydrolase(Mpro)

Figure 5Molecular docking of SARS-CoV-2 3CL hydrolase（Mpro）with N3 inhibitor（A），（+）-catechin（B）,（-）-epigallocatechin gallate（C），α-spinasterol（D），（-）-catechin gallate（E），squalene（F）and pelargonidin chloride（G）

SARS-CoV-2冠狀病毒主蛋白酶原核表達(dá)后，經(jīng)鎳離子金屬螯合色譜、Hitrap Q FF column陰離子交換色譜、HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝膠過濾色譜分離純化，14%SDS-PAGE凝膠電泳檢測目的蛋白的純度可達(dá)95%以上（由中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院廣東省生物醫(yī)學(xué)影像重點實驗室陳守登研究員課題組測定），如圖6所示。圖7-A為不同濃度的EGCG加入到酶反應(yīng)混合物后對熒光強(qiáng)度的影響，通過熒光強(qiáng)度的變化可以反映EGCG對Mpro的抑制活性。不同濃度的EGCG與SARS-CoV-2 3CL水解酶抑制率的關(guān)系如圖7-B所示，計算IC50為3.4 μmol/L。

4 討 論

Figure 6 SDS-PAGE analysis of SARS-CoV-2 3CL hydrolase（Mpro）A:Identification of Mproby 12%SDS-PAGE.1:Marker,2:Mpro-wt which cleavage by rhinovirus 3C-like protease,3:Mproafter the cleavage of C-terminal His tag;B:Purification of Mproby 14%SDS-PAGE

Figure 7 Inhibition of（-）-epigallocatechin gallate（EGCG）for SARS-CoV-2 3CL hydrolase(-x ± s,n=3)A:Effect of different concentrations of EGCG on fluorescence intensity;B:Inhibitory activity of EGCG on SARS-CoV-2 3CL hydrolase.The inhibition rate was acquired by the calculation of initial rates calculated by fitting the straight-line portion of the curves(the first 400 second)in A

從中醫(yī)角度分析，COVID-19為外感風(fēng)熱性質(zhì)的疫癘之氣所致，屬于“濕毒疫”范疇，病位主要在肺，可波及脾胃，內(nèi)濕從生，熱濕相合。由于在不同患者或同一患者的不同病程中表現(xiàn)出寒濕與濕熱。濕邪為中醫(yī)學(xué)致病因素之一，濕邪致病具有4個方面的特性：濕為陰邪，易阻遏氣機(jī)，損傷陽氣；濕性重濁；濕性黏滯；濕性趨下，易傷陰位。而“濕”產(chǎn)生的根本在于脾胃，異氣侵襲人體后易于侵犯脾胃［3，22］。唐代醫(yī)學(xué)家陳藏器在《本草拾遺》中有寫道：“止渴除疫，貴哉茶也”。通過長期飲茶改善人們的濕邪體質(zhì)，健脾和胃不失為一種適宜方法。作為藥食同源的六堡茶，茶氣足，入腎經(jīng)，走督脈，提振陽氣；微生物菌群豐富，助小腸受盛化物；雙管齊下，祛濕尤佳。六堡茶茶樹原本生長的環(huán)境使它自帶有祛濕的功效，更因其獨特的渥堆加工工藝具有獨特的祛濕功效。

本研究以獨特祛濕功效的六堡茶為研究對象，以部分抗病毒藥物和原配體N3抑制劑為對照，通過OB和DL篩選出6種六堡茶潛在活性成分，預(yù)測直接抑制SARS-COV-2復(fù)制的機(jī)制。為了進(jìn)一步探討這6個關(guān)鍵活性成分與新型冠狀病毒的相關(guān)性，研究進(jìn)行了分子對接驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種活性成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶均能較好地結(jié)合。值得注意的是，其中（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯是對應(yīng)靶標(biāo)最多的成分，在六堡茶的茶多酚含量中占比較大［23］，也是與SARS-CoV-2 3CL水解酶結(jié)合較好的成分。兒茶素屬于茶多酚類化合物，是茶葉中的主要活性成分，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)兒茶素可以抑制流感病毒的復(fù)制，具有抗病毒功效［24］。多數(shù)研究證明（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗腫瘤作用［25］，可緩解感染肺炎鏈球菌小鼠的肺水腫癥狀［26］。有實驗研究證明廣藿香對脂多糖誘導(dǎo)的炎癥有顯著的抗炎作用，其中缺少不了α-菠甾醇的存在［27］，且角鯊烯是一種開鏈三萜類化合物，還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗腫瘤等多種生理功能［28］。

為了進(jìn)一步探究六堡茶主要是通過哪些靶標(biāo)對COVID-19起作用，本研究通過3個拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選，得到MAPK3、MAPK1、TNF 、IL6、CASP3、EGFR 、STAT3等38個核心靶點。其中MAPK1、MAPK3都屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，能對高或低滲透壓、氧化應(yīng)激、DNA損傷等潛在有害的非生物應(yīng)激刺激做出反應(yīng)，可調(diào)控炎癥、細(xì)胞生長、分化、凋亡及對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理或病理過程［29］。MAPK主要有ERK、p38 MAPK和SAPK/JNK三大亞型。有研究發(fā)現(xiàn)在感染了SARS-CoV的細(xì)胞中，p38 MAPK的磷酸化顯著上調(diào)［30］。而在后來研究中也發(fā)現(xiàn)了MAPK中另外兩個亞型在感染SARSCoV時也出現(xiàn)磷酸化現(xiàn)象［31］。近期發(fā)表的文獻(xiàn)指出，COVID-19的發(fā)生發(fā)展與炎癥風(fēng)暴存在密切關(guān)系［32］。炎癥風(fēng)暴即細(xì)胞因子風(fēng)暴，是由感染、藥物或某些疾病引起的免疫系統(tǒng)過度激活，呈現(xiàn)高炎癥反應(yīng)狀態(tài)。一旦發(fā)生可迅速引起單器官或多器官功能衰竭，最終威脅生命［33］。IL-6、TNF作為引發(fā)新冠肺炎患者炎癥風(fēng)暴中的關(guān)鍵炎癥因子，其中IL-6作為一種多效性因子，廣泛表達(dá)在T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等細(xì)胞的表面，是介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的重要因子之一［34］。TNF是促炎性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)MAPK、ERK、NF-κB 等信號通路廣泛參與細(xì)胞分化、凋亡和誘發(fā)炎癥等生理或病理過程［35］。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3，可同時介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和相應(yīng)的免疫應(yīng)答，此外有報道發(fā)現(xiàn)STAT3在哮喘模型大鼠的肺組織中高表達(dá)［36］。

隨后本研究對IL-6、TNF、MAPK3等38個核心靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。從GO的富集結(jié)果分析可知，在BP中涉及到3條關(guān)于脂多糖（LPS）的GO條目。實驗表明LPS可通過下調(diào)JAK2/STAT3通路致使腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6、TNF等炎癥因子分泌過多，從而導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)的發(fā)生［37-38］。由KEGG通路富集結(jié)果預(yù)測六堡茶發(fā)揮干預(yù)作用是通過干預(yù)HIF-1、IL-17、TNF、T細(xì)胞受體、Toll樣受體、非小細(xì)胞肺癌、肺結(jié)核、甲型流感等信號通路實現(xiàn)的。其中HIF-1是非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［39］，可通過激活相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與低氧相關(guān)的生理或病理過程，如在缺血組織中增加VEGF的表達(dá)從而加快血管生成以及參與細(xì)胞代謝途徑實現(xiàn)細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)［40］。有研究證明HIF-1與炎癥有關(guān)，通過涉及免疫反應(yīng)上調(diào)NF-κB信號通路［41］。IL-17由Th17細(xì)胞分泌而來，可誘導(dǎo)免疫相關(guān)細(xì)胞分泌促炎癥因子、刺激趨化因子的產(chǎn)生以及通過PTGS2誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素2等加劇了炎癥的發(fā)生［42］。IL-17信號通路與NF-κB信號通路存在相互關(guān)系，NF-κB是介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子［43］。并且IL-17還可以激活NF-κB、MAPK信號通路。有研究表明MAPK信號通路中，p38MAPK信號通路的活化，加劇了鏈球菌性肺炎小鼠的炎癥［44］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法對六堡茶干預(yù)COVID-19的藥效基礎(chǔ)、核心靶標(biāo)、通路進(jìn)行預(yù)測，六堡茶中的核心化學(xué)成分（+）-兒茶素、（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、α-菠甾醇、（-）-兒茶素沒食子酸酯、角鯊烯、氯化天竺葵素與SARS-CoV-2 3CL水解酶結(jié)合并通過MAPK1、TNF等炎癥和免疫相關(guān)的靶標(biāo)介導(dǎo)HIF-1、IL-17、T細(xì)胞受體等信號通路發(fā)揮干預(yù)COVID-19的功效。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法僅起到預(yù)測的作用，具有一定局限性，因此本實驗選取結(jié)合能較低的且在六堡茶中含量較高的（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯進(jìn)行了SARS-CoV-2 3CL水解酶活力測定，發(fā)現(xiàn)（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯對SARSCoV-2 3CL水解酶有一定的抑制效果?，F(xiàn)階段對COVID-19的發(fā)生、發(fā)展、變異等機(jī)制的研究存在著諸多的不確定，故其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的體內(nèi)外實驗研究。