HPLC 法測定(E)-4-[2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙酰氧基]-3-甲氧基苯基丙烯酸的有關物質

許 靜，彭 紅，熊賢招

（江西中醫(yī)藥大學，南昌330004）

（E）-4-［2-（4-氯苯氧基）-2-甲基丙酰氧基］-3-甲氧基苯基丙烯酸（（E）-4-［2-（4-chlorophenoxy）-2-methylpanoyloxy］ -3-methoxyphenylacrylic acid，XTAC）是由江西中醫(yī)藥大學藥物化學教研室合成的一種全新結構的降脂藥物，藥理學實驗結果表明，XTAC能夠顯著降低血清中總膽固醇、總三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇，并可降低動脈粥樣硬化指數(shù)［1］，XTAC的合成工藝簡單（共3步），合成途徑如圖1所示，前期已經研究了XTAC原料藥中的殘留溶劑［2］，但是關于其他雜質的研究甚少，根據雜質研究指導原則及ICH雜質研究的要求，對其有關物質進行研究，以合成起始原料、中間體及可能產生的副產物或降解產物為研究對象，分析了XTAC產生的有關物質并建立了HPLC分析方法［3-4］，分離并鑒定了主要雜質C［5］，為 XTAC的質量控制提供了理論依據。

1 材料

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Triple TOF 5600+型四極桿飛行時間串聯(lián)質譜儀（美國AB SCIEX公司）；AvanceⅢHD 600 MHz型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker科技有限公司）。

1.2 試藥

XTAC（ 批 號 ：20190324、20190401、20190412）、中間體2（批號：20190312）由江西中醫(yī)藥大學藥物化學教研室提供；雜質C（批號：20190513）由本實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%乙酸水溶液（70∶30），等度洗脫；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；進樣量：10 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性

精密稱取研細后的XTAC 100 mg，置50 mL量瓶中，加流動相適量超聲使溶解，放至室溫后加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖（見圖2）。理論塔板數(shù)按XTAC峰計大于2 500。

2.3 專屬性

2.3.1 XTAC、起始原料以及中間體的分離度取一定濃度的本品、起始原料和工藝中間體的混合溶液，照“2.1”項下的色譜條件進行檢測。結果見圖3，XTAC與起始原料及中間體的分離度較好。

Figure 2 HPLC diagram of XTAC

Figure 3 HPLC diagram of mixed solution of raw material(A),intermediate1(B),intermediate 2(C),XTAC(D)and impurity of intermediate 2(E)

2.3.2 強制降解實驗 分別取XTAC約100 mg，精密稱定，置不同50 mL量瓶中，進行強降解實驗。未破壞供試品溶液：加流動相適量超聲溶解；高溫破壞供試品溶液：在105℃下恒溫條件放置4 h，冷卻至室溫；光破壞供試品溶液：紫外光（4 500±500）lx下照射4 h，加流動相適量超聲溶解；堿破壞供試品溶液：加1 mol/L NaOH溶液1 mL，在80℃水浴條件下加熱30 min，放冷至室溫后加1 mol/L的鹽酸溶液中和至中性，加流動相適量超聲溶解；酸破壞供試品溶液：加1 mol/L的鹽酸溶液1 mL，在80℃水浴條件下加熱30 min，放冷至室溫后加1 mol/L的NaOH溶液中和至中性，加流動相適量超聲溶解；氧化破壞供試品溶液：加30%H2O2溶液1 mL，在室溫下放置30 min，加流動相適量超聲溶解。上述樣品用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，分離度符合要求，結果見表1。堿破壞、氧化破壞實驗的色譜圖見圖4，圖5。

Table 1 Forced degradation test results of XTAC

Figure 4 HPLC diagram of alkaline-treated sample

Figure 5 HPLC diagram of oxygen-treated sample

強制降解試驗結果顯示各降解產物均在主峰保留時間的2倍內出峰，為了繼續(xù)考察本品在穩(wěn)定性試驗期間的有關物質，故確定本品有關物質檢查保留時間為主峰保留時間的4倍。強制降解色譜圖中主峰與各雜質峰分離度均大于1.5，各雜質間分離度良好，物料平衡在98.76%～100.67%之間符合驗證要求。本品在酸、光照、高溫、氧化條件下主成分含量均大于99.00%。本品堿條件較不穩(wěn)定，主成分下降，雜質峰升高。未破壞、酸破壞、光照破壞、氧破壞樣品中雜質C的含量最多。

2.4 主要雜質C的結構鑒定

2.4.1 樣品中有關物質分析 3批XTAC樣品純度較高，有關物質含量均小于0.1%，含量較大的有關物質為雜質C，采用制備HPLC收集雜質C，HPLC圖譜顯示雜質C的保留時間與中間體2保留時間一致（圖6）。

Figure 6 HPLC diagram of impurity C reference substance

2.4.2 雜質C的結構確證 雜質C為白色至類白色晶體，ESI-MSm/z349［M+H］+。1H NMR譜（600 MHz，DMSO-d6）如圖7所示：δ9.98（1H，S，C16-H）、δ7.69（1H，s，C11、C2、C4、C5-H中的 3個）、δ7.38（6H，s，C1、C2、C4、C5、C10、C13-H）、δ3.87（1H，s，C15-H中的 1個）、δ1.61（6H，s，C18和C19-CH3）。13C NMR 譜（151 MHz，DMSO-d6）如圖 8所示：δ192.47（C16）；δ171.41（C14）；δ154.06（C6）、δ151.88（C8）、δ144.15（C9）、δ135.90（C12）、δ129.64（C2 或 C4）、δ126.57（C3）、δ124.04（C1 或C5）、δ123.98（C1 或 C5）、δ123.81（C10）、δ121.12（C11）、δ112.50（C13）；δ79.44（C7）、δ56.61（C15）、δ25.47（C17或C18）。結合總離子流圖和一級、二級質譜圖（圖7，圖8）可知，檢測到m/z349.183 2的［M+H］+準分子離子峰，可知該物質相對分子質量為 348.5，tR為 9.51 min，在 MS/MS圖上出現(xiàn)m/z111.001 2、m/z169.042 4的特征離子碎片，結合雜質C母核結構特征可知m/z169.042 4可能為雜質C的酯鍵進行α-斷裂然后失去一分子中性分子CO生成的碎片，m/z111.001 2可能為雜質C的醚鍵進行i-斷裂生成的碎片，同時利用同位素峰形匹配校正技術查找以及質譜碎片推測該物質分子式為C18H17O5Cl。

Figure 7 Primary mass spectrum of impurity C

Figure 8 Secondary mass pectrum of impurity C

2.5 雜質C的線性范圍與檢測限

取雜質C對照品約50 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質C對照品溶液。精密量取雜質C對照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為雜質C對照品儲備液。分別精密量取雜質C對照品儲備液各0.02、0.1、1、2、4、6 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，制成系列濃度的雜質C標準溶液。照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行回歸得回歸方程：y=3650.6x+549.48（r=0.999 9），在 0.20～59.96 μg/mL范圍內雜質C的質量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系。精密量取雜質C對照品儲備液逐級稀釋至信噪比（S/N）約為3時，檢測限為15 ng。

2.6 加樣回收率

XTAC研細，取約50 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相50 mL超聲使溶解，加雜質C對照品溶液（8 μg/mL）2.0，2.5，3.0 mL（各3份），再用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密稱取雜質C（中間體2）對照品約5 mg，置100 mL量瓶中，加流動相適量超聲使溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取雜質C對照品儲備液4 mL，置25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為雜質C對照品溶液。照“2.1”項下色譜條件測定含量，平均回收率為92.88%，RSD為5.62%。結果見表2。

Table 2 Accuracy test results of impurity C

2.7 有關物質檢測

取XTAC樣品細粉適量（約相當于XTAC 50 mg），精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相適量超聲溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為XTAC供試品溶液；精密量取XTAC供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為XTAC對照溶液。另取雜質C（中間體2）對照品適量，精密稱定，用流動相超聲溶解并定量稀釋成每毫升含40 μg的溶液，作為雜質C對照品溶液。按“2.1”項色譜條件進行測定，記錄色譜圖至供試品溶液主峰保留時間的4倍。理論板數(shù)按XTAC對照溶液峰計算應不低于2 500，用XTAC對照溶液的色譜圖來確定雜質C，雜質C相對于XTAC（保留時間大約為15.6 min）的相對保留時間約為0.82。除溶劑峰外，XTAC供試品溶液色譜圖中如有與對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算不得過1.0%；XTAC供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，單個雜質峰面積不得大于XTAC對照溶液主峰面積的0.5倍（0.5%）；各雜質峰面積的和不得大于XTAC對照溶液主峰面積的2倍（2.0%）。供試品溶液色譜圖中小于主峰面積的0.005倍色譜峰忽略不計（0.005%）。3批XTAC樣品的有關物質檢測結果見表3。結果顯示，XTAC樣品的純度較高，雜質的表觀含量均在0.1%以下。

Table 3 Determination of related substances in XTAC

3 討 論

本研究對XTAC樣品中主要有關物質C進行了初步結構確證，并擬定了雜質C對照品的質量要求，在XTAC原料藥質量標準中采用雜質對照品外標法控制樣品中雜質C的限量；對其他的0.1%以下雜質，采用高低濃度對比法進行單個雜質限量控制，并對總雜質限量進行了控制，通過分析方法驗證，表明該方法適用于本品的有關物質分析，在后續(xù)經穩(wěn)定性、放大生產及進一步的藥理毒理研究，在獲得更多的信息下，將對這些有關物質會進一步進行評價和質量控制研究。本研究所建立的HPLC方法簡單、方便、穩(wěn)定，能夠有效地進行XTAC有關物質的測定。

根據歐盟發(fā)布的警示結構，XTAC沒有基因毒性雜質警示結構，但雜質C和其他雜質3-甲氧基對羥基苯甲醛具有基因毒性雜質警示結構（SA_11：Simple aldehyde，）。雖然雜質C的含量小于0.1%（約0.05%），其他雜質含量也遠遠小于雜質C的含量，但其相關基因毒性雜質的研究仍應得到重視。