脂筏特異性AIE熒光探針的設(shè)計、合成及其應(yīng)用

陳 悅，郝玫茜，鞠曹云，張 燦

（中國藥科大學(xué)高端藥物制劑與材料研究中心，南京210009）

脂筏（lipid raft）是由細胞膜上的飽和磷脂、鞘磷脂以及膽固醇構(gòu)成的高度動態(tài)的有序微區(qū)［1-3］。研究表明，脂筏與免疫信號傳導(dǎo)、胞吞與胞吐、病毒入侵、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等多種生理、病理過程密切相關(guān)；脂筏區(qū)可以調(diào)節(jié)膜蛋白與信號蛋白之間的相互作用及蛋白構(gòu)象，繼而調(diào)控下游信號的傳導(dǎo)［4-5］。因此，特異性標(biāo)記脂筏對于研究脂筏區(qū)相關(guān)生理、病理過程具有重要意義。

目前，常用的脂筏區(qū)探針根據(jù)其檢測機制分為兩大類。一類是基于脂筏區(qū)特異性的脂質(zhì)組成設(shè)計的脂類探針與分子標(biāo)志物檢測探針［6］。脂筏區(qū)富含的糖基磷脂酰肌醇-錨定蛋白（glycosylphosphatidyli-nositol-anchored proteins，GPI-AP）的 GPI部分由親水的聚糖部分與疏水的飽和磷脂尾部組成，親水的聚糖部分可使跨膜蛋白暴露于細胞膜外，而疏水的飽和磷脂部分可使跨膜蛋白通過疏水作用力錨定在細胞膜的脂筏區(qū)域［7-8］。但是GPI結(jié)構(gòu)復(fù)雜且合成難度高，而膽固醇-三聚乙二醇與GPI的結(jié)構(gòu)相似，均由脂筏區(qū)的固有脂質(zhì)以及長度為20 ?的親水鏈組成，因此，有研究人員利用膽固醇-三聚乙二醇結(jié)構(gòu)，并在其上引入熒光基團作為模擬GPI的探針，用于脂筏區(qū)成像［9］。另一類是基于脂筏區(qū)脂質(zhì)分布特點設(shè)計的環(huán)境敏感性探針［10］。與非脂筏區(qū)相比，脂筏區(qū)脂質(zhì)排布緊密，含水量低，黏度高且極性低。脂筏區(qū)緊密的脂質(zhì)排布使疏水性的大位阻化學(xué)結(jié)構(gòu)難以嵌入脂筏區(qū)，從而被排出到細胞膜外的水相環(huán)境中形成聚集體；而非脂筏區(qū)脂質(zhì)排布疏松，疏水性的大位阻化學(xué)結(jié)構(gòu)易插入，并以單體形式存在于非脂筏區(qū)。因此，有研究人員針對脂筏區(qū)與非脂筏區(qū)的脂質(zhì)排布差異，構(gòu)建了具有適當(dāng)位阻的熒光探針對脂筏區(qū)進行成像［11］。雖然這些探針已經(jīng)得到了一定程度的應(yīng)用，但是仍存在特異性不足和靈敏度有限的局限［12-13］，需要繼續(xù)研究高選擇性和靈敏度的脂筏探針。

2001年，唐本忠院士團隊發(fā)現(xiàn)具有噻咯母核結(jié)構(gòu)的熒光染料在聚集狀態(tài)下熒光會顯著增強，并將具有這類現(xiàn)象的染料命名為AIE熒光染料（aggregation-induced emission luminogens，AIE-gens）。當(dāng)AIEgens以單體形式存在時，其激發(fā)態(tài)具有較高的扭曲程度，使分子內(nèi)共軛程度下降，發(fā)射出較短波長的熒光；而當(dāng)以聚集態(tài)形式存在時，分子內(nèi)自由旋轉(zhuǎn)受限，其激發(fā)態(tài)具有較高的共軛程度，能發(fā)射較長波長的熒光［14-15］。這一聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性有利于脂筏區(qū)脂質(zhì)聚集狀態(tài)的成像。

基于此，本研究針對傳統(tǒng)熒光染料靈敏度有限和脂筏成像探針特異性不強的局限，設(shè)計了基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光母核的脂筏成像探針膽固醇-三聚乙二醇-四苯乙烯（TCHS-TPE）。該探針以經(jīng)典的AIEgens四苯乙烯（TPE，圖1藍色部分）作為熒光基團；在TPE的側(cè)鏈羧基上對稱引入三聚乙二醇（PEG3，圖1黑色部分）作為親水連接臂，保證TPE能夠暴露在細胞膜外；并在兩側(cè)PEG3的氨基上同時引入膽固醇（圖1紅色部分）作為細胞膜錨定分子。TCHS-TPE首先利用膽固醇的疏水作用錨定在脂筏區(qū)或非脂筏區(qū)；當(dāng)其位于脂筏區(qū)時，由于脂筏區(qū)緊密的脂質(zhì)排布，大體積的TPE被擠出細胞膜暴露于水相環(huán)境中以聚集態(tài)存在，此時分子自由旋轉(zhuǎn)受阻，可發(fā)射出較長波長的熒光（綠光）；而當(dāng)位于非脂筏區(qū)時，由于脂質(zhì)排布疏松，疏水性的TPE可嵌入細胞膜，大部分以單體形式存在，此時分子可自由旋轉(zhuǎn)，發(fā)射出較短波長的光（深藍光）。因此，可以通過檢測TCHS-TPE的發(fā)射熒光準(zhǔn)確區(qū)分脂筏區(qū)與非脂筏區(qū)，實現(xiàn)細胞膜脂筏的高選擇性成像。

Figure 1 Structure of cholesterol-triethylene glycol-tetraphenylethylene(TCHS-TPE)

1 合成路線

本研究以4-甲基二苯甲酮為原料（1）通過Mc-Murray偶聯(lián)得到化合物2，繼而在過氧化苯甲酰（BPO）的引發(fā)下與N-溴代丁二酰亞胺（NBS）進行自由基反應(yīng)生成化合物3，隨后通過芐基溴水解得到化合物4，化合物4經(jīng)氧化反應(yīng)得到化合物5。此外，膽固醇琥珀酸單酯（6）與（3-（2-（2-（3-氨基丙氧基）乙氧基）乙氧基）丙基）氨基甲酸叔丁酯（Boc-TOTA）通過酰胺縮合并脫去Boc保護基得到化合物8。最終化合物5與化合物8進行酰胺縮合得到目標(biāo)探針TCHS-TPE。具體合成路線見路線1。

Scheme 1 Synthesis of cholesterol-triethylene glycol-tetraphenylethylene(TCHS-TPE)Reagents and reaction conditions:(a)TiCl4,Zn,tetrahydrofuran(THF),75°C,overnight;(b)N-bromosuccinimide(NBS),benzoyl peroxide(BPO),CCl4,80 °C,overnight;(c)NaHCO3,dimethyl sulfoxide(DMSO),95 °C,4 h;(d)tert-butyl hydroperoxide(tBuOOH),CuCl,MeCN,25 °C,overnight;(e)tert-butyl(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamate(Boc-TOTA),2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate(TBTU),N,N-diisopropylethylamine(DIPEA),CHCl3,25 °C,overnight;(f)HCl,1,4-dioxane,0 °C,5 h;(g)TBTU,DIPEA,CHCl3,25 °C,overnight

2 實驗部分

2.1 試劑

膽固醇琥珀酸單酯（CHEMS，純度98%）、（3-（2-（2-（3-氨基丙氧基）乙氧基）乙氧基）丙基）氨基甲酸叔丁酯（Boc-TOTA，純度98%，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司）；4-甲基二苯甲酮（純度98%）、含1.0 mol/L TiCl4的CH2Cl2溶液（上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）、四氫呋喃（THF，純度99.5%）、2-（1H-苯并三偶氮L-1-基）-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU，純度98%）（上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；N-溴代丁二酰亞胺（NBS，純度99%，上海阿拉丁試劑有限公司）；過氧化苯甲酰（BPO，純度97%，美國Alfa aesar公司）；其他試劑均為分析純；霍亂毒素B-Alexa 594（CTXB-Alexa 594，賽默飛世爾科技有限公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8，碧云天生物技術(shù)有限公司）。

2.2 儀器

PSL-1810磁力攪拌低溫恒溫水槽（上海愛朗儀器有限公司）；ZetaPlus粒徑電位分析儀（布魯克海文公司）；EU-2600A紫外分光光度計（上海昂拉儀器有限公司）；Cary Eclipse熒光分光光度計（安捷倫科技有限公司）；LSM700激光共聚焦顯微鏡（卡爾蔡司光學(xué)有限公司）。

2.3 細胞

黑色素瘤B16F10細胞（中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所）。

2.4 探針的合成

1，2-二（4-甲基苯）-1，2-二苯乙烯（TMTPE，2）的合成

向100 mL兩頸瓶中加入鋅粉（13.34 g，122.30 mmol）、無水四氫呋喃（20 mL），于-20℃緩慢加入TiCl4（245 mL，244.60 mmol），移至室溫攪拌0.5 h。將該混合溶液加熱回流2 h后，加入4-甲基二苯甲酮（12.00 g，61.14 mmol），回流過夜。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加入10%K2CO3水溶液，攪拌0.5 h后，抽濾得濾液。該濾液用二氯甲烷溶液（200 mL×2）萃取，之后用飽和氯化鈉溶液（200 mL×2）洗滌，收集有機層，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，柱色譜（CHCl2-MeOH，20∶1）純化，得黃色固體10.53 g，收率：96.0%。1H NMR（300 MHz，CDCl3），δ：7.24～7.01（5H，m，Ar-H），6.92（12H，dd，J=4.4，2.7 Hz，Ar-H），2.27（9H，s，Ar-CH3）。

1，2-二苯基-1，2-二（4-溴甲基苯）乙烯（TBTPE，3）的合成

將TMTPE（6.00 g，16.7 mmol），N-溴代丁二酰亞胺（6.50 g，36.7 mmol），過氧化苯甲酰（404 mg，1.67 mmol）溶于CCl4溶液25 mL中回流2 h。反應(yīng)完成后，抽濾，二氯甲烷（200 mL×2）萃取濾液，飽和氯化鈉溶液（200 mL×2）洗滌，收集有機層，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，柱色譜純化，得黃色固體5.78 g，收率：78.7%。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：7.12（10H，dt，J=6.8，5.3 Hz，Ar-H），7.04～6.97（8H，m，Ar-H），4.42（4H，d，J=7.8 Hz，Ar-CH2）.。

1，2-二苯基苯-1，2-二（4-醛基苯）乙烯（TPETCHO，4）的合成

將TBTPE（5.78 g，13.15 mmol）以及碳酸氫鈉（1.65 g，19.6 mmol）溶解于二甲基亞砜25 mL中，90℃攪拌4 h，待反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾。二氯甲烷（200 mL×2）萃取，飽和氯化鈉溶液（200 mL×2）洗滌，收集有機層，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得黃色固體3.46 g。

1，2-二苯基苯-1，2-二（4-羧基苯）乙烯（TPETCOOH，5）的合成

將TPE-TCHO（1.62 g，4.18 mmol）以及叔丁基過氧化氫（4.2 mL，20.91 mmol）溶解于乙腈40 mL中，室溫攪拌過夜。待反應(yīng)結(jié)束后采用飽和亞硫酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，有機層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將獲得的粗產(chǎn)物通過柱色譜純化，得黃色固體0.96 g，收率：54.7%。1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：8.09（4H，d，J=5.4 Hz，Ar-H），7.83（3H，d，J=8.4 Hz，Ar-CH），7.35（2H，d，J=2.5 Hz，Ar-CH），7.18～6.97（9H，m，Ar-CH）。

膽固醇-1-（Boc-氨基）-4，7，10-三氧雜-13-十三癸胺（CHS-NH2-Boc，7）的合成

將膽固醇半琥珀酸酯（化合物6，1.00 g，2.00 mmol）、TBTU（642 mg，2.00 mmol）以及 N，N-二異丙基乙胺（430 μL，2.6 mmol）溶解于CHCl330 mL中。室溫活化1 h后，加入1-（Boc氨基）-13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷（641 mg，2.00 mmol）室溫攪拌8 h。反應(yīng)完成后，減壓濃縮并將粗產(chǎn)物通過柱色譜純化（CHCl2-MeOH，20∶1）得白色固體1.42 g，收率：90.0%。1H NMR（300 MHz，CDCl3），δ：5.35（1H，d，J=4.2 Hz，Cholesterol-CH），4.60（1H，d，J=8.3 Hz，Cholesterol-CH），3.75～3.48（12H，m，2×ArCON-CH2，4×O-CH2），3.35（2H，dd，J=11.7，5.8 Hz，O-CH2），3.21（2H，d，J=6.0 Hz，OCN-CH2），2.62（2H，s，OCN-CH2），2.44（2H，d，J=6.7 Hz，OCO-CH2），2.30（2H，d，J=7.9 Hz，Cholesterol-CH2），2.08～1.69（6H，m，3×Cholesterol-CH2），1.68～1.22（13H，m，6×Cholesterol-CH2，Cholesterol-CH），1.21～0.76（21H，m，1×Cholesterol-CH，4×Cholesterol-CH2，4×Cholesterol-CH3），0.67（3H，s，Cholesterol-CH3）。

膽固醇-1-氨基-15-氧代-4，7，10-三氧雜-14-氮雜十八烷-18-酸酯（CHS-NH2，8）的合成

在0℃下將氯化氫-1，4-二氧六環(huán)（4.50 mL，9.00 mmol）溶液逐滴加入到CHS-NH2-Boc（1.42 g，1.80 mmol）中，0℃反應(yīng)5 h。減壓蒸餾，將溶液的pH調(diào)至中性，二氯甲烷200 mL萃取，有機層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，得到棕色固體893 mg。

膽固醇-1-氨基-4，7，10-三氧雜-13-十三癸胺-四苯基乙烯-1-氨基-4，7，10-三氧雜-13-十三癸胺-膽固醇（TCHS-TPE，9）的合成

將 CHS-NH2（505 mg，0.75 mmol）、TBTU（312 mg，0.97 mmol）、N，N-二異丙基乙胺（161 μL，0.97 mmol）溶解于CHCl330 mL中。室溫活化1 h后，加入TPE-TCOOH（314 mg，0.75 mmol）室溫攪拌8 h。反應(yīng)完成后，減壓濃縮并將粗產(chǎn)物經(jīng)柱色譜進行純化（CHCl2-MeOH，20∶1）后得到白色固體416 mg，收率：50.8%。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：7.54（4H，d，J=8.2 Hz，2×Ar-H），7.12～7.04（9H，m，2×Ar-H），7.00～6.96（5H，m，2×Ar-H），5.35（1H，d，J=3.2 Hz，2×Cholesterol-CH），4.64～4.54（1H，m，2×Cholesterol-CH），3.61（12 H，s，4×OCH2，2×ArCON-CH2），3.53（8H，dd，J=10.3，5.3 Hz，4×O-CH2），3.47（8H，t，J=5.9 Hz，4×O-CH2），3.31（4H，dd，J=12.1，6.0 Hz，2×OCN-CH2），2.60（4 H，t，J=6.9 Hz，OCN-CH2），2.42（4H，t，J=7.0 Hz，OCO-CH2），2.30（4H，d，J=7.7 Hz，2×Cholesterol-CH2），1.98（4H，dd，J=21.3，16.4 Hz，2×Cholesterol-CH2），1.85（8H，dt，J=8.2，4.9 Hz，6×Cholesterol-CH2），1.76～1.39（26H，m，12×Cholesterol-CH2，2×Cholesterol-CH），1.19～1.04（12H，m，6×Cholesterol-CH2），1.00（8H，d，J=12.0 Hz，2×Cholesterol-CH，2×Cholesterol-CH3），0.95～0.85（22H，m，2×Cholesterol-CH2，6×Cholesterol-CH3），0.66（6H，d，J=13.9 Hz，2×Cholesterol-CH3）.HRMS（ESI+）：Calcd.for C110H60N4O14（M+H）+1 762.192 0，F(xiàn)ound 1 763.199 0。

2.5 TCHS-TPE的光物理性質(zhì)

為了證明TCHS-TPE具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光的特性，本研究首先配制10 μmol/L TCHS-TPE的水、甲醇、乙醇、二甲亞砜、二氯甲烷溶液，應(yīng)用紫外分光光度計掃描并記錄紫外吸收光譜，結(jié)果如圖2-A所示。相比于有機溶劑，TCHS-TPE在水溶液中325 nm左右的吸收峰強度大幅減弱，且發(fā)生輕微藍移，分析原因可能是由于水分子與四苯乙烯結(jié)構(gòu)中酰胺鍵的氧原子形成了分子間氫鍵，n軌道能級下降，n→π躍遷能增大，K吸收帶藍移。

隨后，配制10 μmol/L TCHS-TPE的水與二甲亞砜不同比例的溶液，采用熒光分光光度計掃描并記錄熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖2-B所示。隨著溶劑中水的增加，熒光發(fā)射強度逐漸增強。當(dāng)水的比例增至50%時，熒光強度較40%的水增加2.6倍。且測得水中TCHS-TPE無定形聚集體的有效粒徑為229 nm（圖2-C）。以上結(jié)果均說明TCHSTPE具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性。

為了證明TCHS-TPE具有脂筏特異性成像的潛力，通過熒光分光光度計對不同極性溶劑中的TCHS-TPE進行熒光發(fā)射光譜掃描，結(jié)果如圖2-D所示。在水溶液中，TCHS-TPE以聚集體形式存在，最大熒光發(fā)射波長為472 nm；而在有機溶劑中，TCHS-TPE以單體形式存在，在甲醇與乙醇溶液中的最大熒光發(fā)射波長為381 nm，在二甲亞砜溶液中的最大熒光發(fā)射波長為378 nm，而在二氯甲烷溶液中的最大熒光發(fā)射波長為358 nm。由此可以看出，在不同有機溶劑中TCHS-TPE的最大熒光發(fā)射波長不同，這是由于TCHS-TPE結(jié)構(gòu)中酰胺鍵上的羰基氧原子和氨基氮原子含有孤對電子可作為電子供體，而TPE結(jié)構(gòu)可作為電子受體，這種弱的供-受體（donate-acceptor，D-A）結(jié)構(gòu)導(dǎo)致最大熒光發(fā)射波長隨著溶液極性的減小發(fā)生輕微藍移。

綜上，TCHS-TPE在有機溶劑中發(fā)射出波長為358 nm到381 nm的深藍色熒光，而在水中發(fā)射出波長為472 nm的綠色熒光。以上結(jié)果顯示，TCHS-TPE在聚集狀態(tài)與在單體狀態(tài)發(fā)射出的波長差異明顯，差值達到100 nm左右，兩種狀態(tài)之間的熒光發(fā)射不會相互干擾，充分證明TCHS-TPE具有脂筏特異性成像的潛力，可進行后續(xù)的細胞脂筏成像研究。

2.6 TCHS-TPE對B16F10細胞的脂筏成像方法

2.6.1 TCHS-TPE對B16F10細胞的安全性考察首先對TCHS-TPE在細胞水平的安全性進行考察，本研究選擇了脂筏區(qū)相對豐富的B16F10黑色素瘤細胞作為模型細胞，通過CCK-8試劑盒考察不同濃度（0.5，1，2，4，8，10，20，50，100 μmol/L）的TCHS-TPE對B16F10細胞的毒性。如圖3所示，上述一系列濃度對B16F10細胞均無明顯的毒性，表明TCHS-TPE具有良好的安全性。

Figure 2 Photophysical properties of TCHS-TPE in vitroA:Normalized UV absorption of TCHS-TPE in MeOH，EtOH，dimethyl sulfoxide(DMSO)，methylene chloride(DCM)and H2O.Concentration：10 μmol/L;B:Photo luminescence(PL)spectra of TCHS-TPE in water/DMSO mixtures with different water fractions(fW).Concentration：10 μmol/L;Excitation wavelength：305 nm;C:Particle size distributions of TCHS-TPE aggregates in the water/DMSO mixture with a 99%water fraction.Concentration：10 μmol/L;D:Normalized PL spectra of TCHS-TPE in MeOH，EtOH，DMSO，DCM and H2O.Concentration：100 μmol/L

Figure 3 Cell viability of B16F10 cells after treatment with different concentration of TCHS-TPE

2.6.2 TCHS-TPE最佳孵育濃度的篩選 在上述安全性良好的濃度范圍內(nèi)，采用流式細胞術(shù)考察不同濃度（2，4，10，20，50 μmol/L）的TCHS-TPE對細胞膜脂筏區(qū)成像效果的影響，以篩選出最佳的探針濃度（圖4-A，圖4-B）。結(jié)果顯示TCHS-TPE與B16F10細胞孵育的濃度越高，TCHS-TPE成功標(biāo)記的陽性細胞率就越高，而當(dāng)濃度達到20 μmol/L時，陽性細胞率達到平臺，因此選取20 μmol/L TCHS-TPE作為與B16F10細胞孵育的最佳濃度。

2.6.3 TCHS-TPE與B16F10細胞最佳孵育時間的篩選 采用流式分析細胞術(shù)，考察不同時間（5，10，15，30，45 min）TCHS-TPE對細胞膜脂筏區(qū)成像效果的影響，以篩選出最佳孵育時間。由圖4-C和圖4-D所示，TCHS-TPE的陽性細胞率隨著孵育時間的增加而增加，當(dāng)孵育時間為15 min時，陽性細胞率達到平臺，因此選取15 min作為TCHS-TPE與B16F10細胞孵育的最佳時間。

2.6.4 TCHS-TPE對B16F10細胞膜的錨定 為了證明TCHS-TPE能錨定到細胞膜上且不被細胞內(nèi)吞，通過激光共聚焦顯微鏡觀察TCHS-TPE在B16F10細胞上的分布。將新鮮的B16F10細胞用含血清的DEME培養(yǎng)基重懸后，接種于激光共聚焦小皿中，于37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基。采用預(yù)冷的PBS洗滌，加入20 μmol/L的TCHS-TPE，并于37℃孵育15 min，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌，最終采用激光共聚焦觀察并拍攝。結(jié)果如圖5所示，TCHS-TPE的熒光大部分都位于B16F10細胞膜上，與明場的細胞輪廓基本重合，且探針在細胞內(nèi)幾乎無熒光。表明TCHSTPE不會被B16F10細胞內(nèi)吞，可有效錨定于細胞膜上。

Figure 4 Screening of optimal imaging conditions for lipid raft on B16F10 cellsA:Flow cytometry analysis of positive percent of B16F10 cells after treatment with different concentration of TCHS-TPE;B:Quantitative analysis in A;C:Flow cytometry analysis of positive percent of B16F10 cells after treatment with 20 μmol/L TCHS-TPE for different times;D Quantitative analysis in C

Figure 5 Fluorescent staining of TCHS-TPE in B16F10 cells(Scale bar，10 μm)

2.7 TCHS-TPE對B16F10細胞脂筏區(qū)的特異性成像

本研究最后考察了TCHS-TPE對細胞膜脂筏區(qū)的特異性成像。CTxB-Alexa 594是商業(yè)化公認(rèn)的脂筏染料，它可通過與脂筏分子標(biāo)志物神經(jīng)節(jié)苷酯（GM1）結(jié)合進而實現(xiàn)脂筏區(qū)特異性成像。但GM1同樣也有部分存在于非脂筏區(qū)上，因此CTxBAlexa 594的特異性不高，并且CTxB通常以五聚體的形式存在，易發(fā)生交聯(lián)，誘導(dǎo)大塊脂筏區(qū)的形成，可能會對細胞的正常生理功能產(chǎn)生干擾［16］。如圖6所示，TCHS-TPE的綠色熒光與CTXB-Alexa 594的紅色熒光在細胞膜上大部分重疊，不僅表明TCHS-TPE可成功實現(xiàn)B16F10細胞脂筏區(qū)的特異性成像，而且其與CTXB-Alexa 594的紅色熒光不重疊的部分也表明其可能具有更高的選擇性。

Figure 6 The fluorescence images of B16F10 cells stained with 20 μmol/L TCHS-TPE and 20 μg/mL of CTxB-Alexa 594(Scale bar，20 μm)

3 總結(jié)與展望

本研究通過分析脂筏區(qū)的脂質(zhì)組成與分布，設(shè)計合成了一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光母核的脂筏特異性成像探針膽固醇-三聚乙二醇-四苯乙烯（TCHS-TPE）。該探針的體外光學(xué)性質(zhì)證實了TCHS-TPE是一種聚集誘導(dǎo)發(fā)光熒光探針，在聚集態(tài)與單體態(tài)時分別呈現(xiàn)出不同的最大熒光發(fā)射波長，二者相差100 nm，具有優(yōu)異的區(qū)分脂筏區(qū)與非脂筏區(qū)的潛力。該探針在細胞水平與CTxB-Alexa 594的共定位實驗也表明，TCHS-TPE可以標(biāo)記細胞膜脂筏區(qū)，且具有更高的脂筏區(qū)特異性。

本研究設(shè)計合成的細胞膜脂筏探針具有特異性高、安全性好、靈敏度高等優(yōu)點。雖然目前該探針只在腫瘤細胞膜脂筏區(qū)成像上取得了較好的效果，但是今后將進一步嘗試將其應(yīng)用于其他細胞（如免疫細胞、原代細胞等），考察其在不同細胞種類上的脂筏區(qū)成像效果，以期能為脂筏相關(guān)生理病理過程的探索提供更多的研究工具。