蕎麥葉大百合組織培養(yǎng)初步研究

李婷婷 李娜 李波 汪小飛 萬志兵

摘 要：目的：蕎麥葉大百合長期處于野生狀態(tài)，不適宜連續(xù)分球、扦插等繁殖方式。采用組織培養(yǎng)進行繁殖，探究啟動培養(yǎng)、誘導愈傷組織及不定芽的最佳培養(yǎng)基，以期建立蕎麥葉大百合快速繁殖體系。方法：所有實驗采用MS基本培養(yǎng)基。在外植體滅菌實驗中，采用75%乙醇與0.1%升汞滅菌，對比污染率與誘導率篩選最適消毒方式;鱗片啟動培養(yǎng)實驗中，附加不同濃度的6-BA與NAA，計算并對比誘導出愈傷組織或不定芽的誘導率;誘導愈傷組織實驗中，采取不同濃度的2，4-D與相同濃度的6-BA（0.5mg/L）和NAA（0.1mg/L）進行配比來誘導愈傷組織，并比較誘導率;在誘導不定芽分化的實驗中，不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0mg/L）與NAA（0.1mg/L）誘導愈傷組織分化不定芽。結(jié)果：以75%乙醇50s，0.1%升汞8min，對鱗片的滅菌作用最好;MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA最適于鱗片的啟動培養(yǎng)，誘導率高達90.67%;MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基對葉片愈傷組織的誘導效果最佳，誘導率為49.43%;MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA時，愈傷組織分化的不定芽數(shù)量最多，誘導率達到78.81%。

關鍵詞：蕎麥葉大百合;組織培養(yǎng);鱗片

中圖分類號：Q943.1? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）09-0022-05

引言

蕎麥葉大百合（Cardiocrinum cathayanum），多年生粗壯草本植物，屬百合科大百合屬，多處于野生狀態(tài)，為中國特有[1，2]，在我國江蘇、浙江、安徽、江西、湖南、湖北等地均有分布，生長在海拔600～1050m的山坡、谷地疏林和灌木叢中，是華中華東分布的特有種[3，4]。大百合屬植株高大，姿態(tài)挺拔優(yōu)美，春季萌發(fā)基生葉蓮座狀，葉片碧綠油亮，夏季總狀花序頂生，花大潔白而美，可做切花、盆花和花境植物等，具有較高的觀賞價值[5]。大百合屬基生葉的葉柄基部膨大形成鱗莖，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，鱗莖研磨后可取食，具有保健和營養(yǎng)價值[6]。百合屬植物具有藥用功能，果實入藥[7]，已研制出具有清肺止咳、解毒、散瘀功效的藥用百合七，作為一味中藥廣泛運用[8]。

百合科植物通常通過扦插、分球或分株進行繁殖，蕎麥葉大百合為野生，繁殖多采用種子繁殖和分球繁殖，種子發(fā)芽率極低，而分球繁殖具有繁殖率低，不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需要，而且這些繁殖方式容易造成百合品質(zhì)和優(yōu)良性狀的退化，使蕎麥葉大百合的價值降低，在一定程度上影響野生花卉蕎麥葉大百合的推廣和應用[9，10]。

解決蕎麥葉大百合繁殖問題較為行之有效的方法是進行組織培養(yǎng)，組織培養(yǎng)能在短期內(nèi)大量快速繁殖，是有效的商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的途徑。本實驗對蕎麥葉大百合的組織培養(yǎng)進行初步研究。而鱗莖一般作為百合科植物組織培養(yǎng)的外植體[11，12]，本實驗同樣采用鱗莖作為啟動培養(yǎng)的外植體，但由于鱗莖長期生長于地下，具有大量的真菌和細菌，很難做到完全消毒滅菌，總體上污染率偏高。本實驗通過75%乙醇與0.1%升汞的處理，篩選污染率較小的消毒方法為后續(xù)實驗做準備。

采用組織培養(yǎng)的方法繁殖大百合，可以加快繁殖速度，蕎麥葉大百合雖一直處于野生狀態(tài)，但目前對其離體培養(yǎng)已有了一定的研究，并且得到了一些較理想的方法[11-13]。以往在百合科植物進行組織培養(yǎng)的研究中，肖玉菲[13]等人在進行大百合鱗莖誘導出芽的實驗中，采用不同濃度梯度的6-BA和NAA處理大百合鱗莖，觀察接種后是否產(chǎn)生愈傷組織，或產(chǎn)生不定芽。結(jié)果表明，MS+5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA更有利于誘導鱗莖產(chǎn)生愈傷組織，作為啟動培養(yǎng)基;馬生軍[13]等人以不同濃度的6-BA和NAA進行配比誘導不定芽分化，其中MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA為最佳誘導不定芽培養(yǎng)基。

本實驗首先以鱗莖為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA與NAA，通過對比誘導率篩選最適啟動培養(yǎng)基;在誘導愈傷組織的實驗中，在MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA培養(yǎng)基的基礎上附加不同濃度的2，4-D，對比愈傷組織的狀態(tài)與誘導率選出最適愈傷組織誘導培養(yǎng)基;成功誘導愈傷組織后，不同濃度的6-BA與0.1mg/L NAA配比，附加于MS基本培養(yǎng)基中誘導不定芽的分化，并將在培養(yǎng)過程中生根的組培苗移栽至溫室中，以期達到后續(xù)可持續(xù)利用的目的。同時，為蕎麥葉大百合的人工培養(yǎng)和大量繁殖提供理論依據(jù)，更好地開發(fā)利用蕎麥葉大百合資源。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

蕎麥葉大百合的外植體為鱗莖，取自安徽省黃山風景區(qū)溫泉附近的蕎麥葉大百合野生群落，取回后立刻對其進行假植。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境

1.2.1 培養(yǎng)基

實驗以MS為基本培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)階段設置不同激素濃度組合。

1.2.2 培養(yǎng)環(huán)境

培養(yǎng)室溫度為25±2℃，空氣相對濕度為70%，日光燈光源，光照強1000lx，光照12h/d。

1.3 實驗方法

1.3.1 外植體的預處理

取生長健壯、無病蟲害的蕎麥葉大百合鱗莖作為外植體，清洗表面泥污，小心剝離鱗莖，將中層內(nèi)層的鱗片在洗衣粉溶液中浸泡5min，再用自來水流水沖洗2h。

1.3.2 接種方法

接種前將鱗片切成0.5cm×1cm的小塊，用無菌水沖洗掉流出的組織液，在5mg/ml的抗壞血酸（Vc）溶液中浸泡5min備用。將小鱗片腹面向上接種到培養(yǎng)基上。每瓶培養(yǎng)基接種1個，每個處理30瓶，3次重復。

1.4 實驗設計

1.4.1 不同消毒方式對鱗片啟動培養(yǎng)的影響

采用75%的乙醇、0.1%的升汞和吐溫-80對鱗片進行4個時間梯度處理，不同消毒時間處理方法如表1所示。將鱗片接種在MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NA蔗糖30g+瓊脂6.4g的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計污染率和誘導率。

1.4.2 不同激素配比對鱗片啟動培養(yǎng)的影響

采用最佳的消毒方式處理鱗片后，分別接種到不同的誘導培養(yǎng)基中，具體激素配比如表2所示，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計誘導率。

1.4.3 不同激素配比對愈傷組織誘導的影響

以鱗片啟動培養(yǎng)誘導出的健壯、無褐化現(xiàn)象的葉片為材料，分別接種到相應的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，激素配比如表3所示，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計結(jié)果。

1.4.4 不同激素配比對不定芽誘導的影響

選擇生長狀況良好、嫩綠且結(jié)構(gòu)緊密的愈傷組織為接種材料，切成0.5cm×0.5cm的小塊，分別轉(zhuǎn)接到不同處理的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計分化情況。

1.4.5 組培苗移栽

在上述實驗過程中會誘導出根，將生根且生長良好的組培苗移栽至溫室的基質(zhì)中，移栽前噴灑一定濃度的多菌靈進行基質(zhì)殺菌消毒，并在移栽后定期噴灑營養(yǎng)液。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

接種后每隔10d進行一次觀察，記錄產(chǎn)生愈傷組織及不定芽的數(shù)量，以及組培苗生長狀況。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excel 2010進行，數(shù)據(jù)處理使用SPSS 20.0軟件的ANOVA過程對各處理進行差異性的檢驗和Duncan法對結(jié)果進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對啟動培養(yǎng)的影響

在組織培養(yǎng)的過程中，出現(xiàn)污染的情況是很常見的，污染率的高低是植物組織培養(yǎng)成功的關鍵。本實驗通過用75%乙醇與0.1%升汞處理外植體的時間長短不同，來探究消毒時間對污染率與誘導率的影響。

由表1可以看出，每種消毒方法都對污染率產(chǎn)生一定遏制作用，隨著消毒時間的延長，污染率逐漸降低。A組處理（75%乙醇30s，0.1%升汞6min）下的外植體污染率最高，達到83.64%，顯著高于其他三組處理，且A組處理最先出現(xiàn)污染情況;同時A組處理下的誘導率最低，為24.33%，明顯低于其他三組處理下的誘導率，顯然A組消毒處理不適宜蕎麥葉大百合啟動培養(yǎng)。同樣，B組處理（75%乙醇40s，0.1%升汞7min）下外植體污染率為57.65%，誘導率為34.25%，二者均次于C、D兩組處理。

D組處理（75%乙醇60s，0.1%升汞9min）污染率最小，為42.35%，并且明顯低于另三組處理，但該處理下的誘導率為46.28%，顯著低于C組處理75%乙醇50s，0.1%升汞8min下的誘導率52.67%。猜測可能是由于升汞處理的時間過長，使鱗片的誘導率降低。

上述分析表明，本實驗中C組消毒處理的效果最好，后續(xù)接種實驗均采用該消毒方法。

2.2 鱗片啟動培養(yǎng)的誘導

本實驗以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA和NAA配制培養(yǎng)基接種蕎麥葉大百合鱗片，進行初代啟動培養(yǎng)，通過對比誘導率篩選最適啟動培養(yǎng)基，結(jié)果見表2。接種后的鱗片在培養(yǎng)的第四天，鱗片體積顯著增大，顏色逐漸變綠，部分鱗片出現(xiàn)紅紫色的條紋。有些鱗片經(jīng)誘導后直接形成的綠色的大型葉片，葉片在培養(yǎng)的過程中可形成愈傷組織，甚至可以分化出淡綠色的不定芽。

從表2可以看出，當6-BA濃度為0.5mg/L時，誘導率隨著NAA的濃度增加而降低，且四組激素配比處理下的誘導率均較低。其中，5組處理（MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA）下的誘導率最高，為60.00%，相同濃度的6-BA處理下，當NAA為0.1mg/L時誘導率明顯高于0.5mg/L的處理結(jié)果。可得出結(jié)論：NAA在低濃度（0.1mg/L）條件下對蕎麥葉大百合鱗片啟動培養(yǎng)效果最佳。

當NAA濃度為0.1mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，誘導率逐漸增高，除1組處理（MS+0.1mg/L NAA）誘導率較低為51.62%外，其他三組處理誘導率均較高。其中，4組處理（MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA）下，誘導率最高為90.67%，且顯著高于其他激素配比處理，相對于1組處理誘導率提高了39.05%，而在本次實驗所有處理組中，明顯高于8組處理，其誘導率為42.33%，提高了48.34%;同時，誘導率僅次于4組處理的3組處理，其誘導率為75.33%，相對于4組處理，顯著降低了15.34%。

實驗表明細胞分裂素6-BA對鱗片的啟動培養(yǎng)有促進作用，而高濃度的生長素NAA對鱗莖的誘導有抑制作用。由上述分析得出，本實驗中培養(yǎng)基中的激素配比為MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA時，鱗片的啟動效果最好。

2.3 愈傷組織的誘導

由2.2可知，MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA誘導率最高。本實驗將不同濃度梯度的2，4-D（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L）和0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA配制愈傷組織誘導培養(yǎng)基接種葉片。葉片在接種后，逐漸出現(xiàn)淡綠色、半透明的疏松組織，隨著培養(yǎng)時間的延長，慢慢變?yōu)榘咨?、結(jié)構(gòu)緊密的愈傷組織，激素配比對誘導率的影響差異見表3。

由表3可知，2，4-D對葉片愈傷組織誘導率有顯著影響，且有助于提高葉片愈傷的誘導率。隨著2，4-D的濃度的增加，誘導率遞增。當2，4-D濃度為2.0mg/L時，誘導率最高，達到49.43%，與濃度為1.5mg/L時誘導率無明顯差別，但顯著高于剩余兩組處理。1組處理，當2，4-D濃度為0.5時，誘導率最低，為41.67%，相對4組處理，顯著降低了7.76%。

綜上所述，MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA+2.0mg/L是用于誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

2.4 不定芽的分化

愈傷組織轉(zhuǎn)接到相應的誘導培養(yǎng)基后，其體積不斷地增大，同時形成2-4個淡綠色的小突起，繼而伸長形成不定芽。本實驗通過不同濃度的6-BA與0.1mg/L的NAA配比處理愈傷組織誘導不定芽，探究不同激素配比對不定芽誘導率的影響，結(jié)果見表4。

由表4分析可知，6-BA對愈傷組織對不定芽的誘導有促進作用，當NAA濃度為0.1mg/L時，不定芽的誘導率隨著6-BA濃度的增加而顯著增加。4組處理（2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）下不定芽的誘導率最高，達到78.81%，且顯著高于另外三組處理，相對于1組處理（0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L）誘導率為29.71%，顯著提高了29.1%。而2組處理（1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）與3組處理（1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）下的不定芽誘導率分別為34.56%與54.55%，顯著高于1組處理，但明顯低于4組處理。

綜上所述，4組處理（2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）最適宜誘導愈傷組織分化不定芽。

3 結(jié)論與討論

植物根際存在大量微生物，因而在以蕎麥葉大百合鱗莖作為外植體時，接種前滅菌的方式與時間至關重要，滅菌劑濃度過大或滅菌時間過長都容易使外植體受到傷害，濃度過小或過短，滅菌不徹底，而達不到滅菌的最終效果。本研究中75%乙醇消毒50s、0.1%升汞消毒8min鱗片的啟動效果好，成活率高，且污染率相對較低;而75%乙醇消毒60s、0.1%升汞消毒9min時雖然污染率低，但鱗片褐化死亡現(xiàn)象嚴重，影響到了鱗片的成活率。李國瑞[14]在紫薇滅菌時間的研究與本研究結(jié)論一致，較嫩的外植體應當適當減少滅菌時間。

在植物組織培養(yǎng)過程中，添加適當?shù)耐庠醇に厥浅晒φT導愈傷組織的關鍵因素[15]。在蕎麥葉大百合的組織培養(yǎng)實驗中，多數(shù)研究者采用6-BA與NAA，本實驗采用2，4-D與6-BA、NAA相互配比誘導愈傷組織，且結(jié)果表明，2，4-D對蕎麥葉大百合愈傷組織的誘導有明顯的促進作用。

任江萍等在大麥幼胚立體培養(yǎng)條件的建立中也提到，不同濃度2，4-D對大麥愈傷組織的誘導存在較大差異[16]。本研究中蕎麥葉大百合葉片愈傷組織的誘導實驗中，2，4-D能夠促進葉片的出愈率.2，4-D濃度為2.0mg/L時，誘導效果最佳，與任江萍的研究相似，她認為2，4-D的濃度在1-2 mg/L時，愈傷誘導率較高[15]。

植物生長發(fā)育過程與植物的內(nèi)源和外源激素種類、含量及配比等有密切關系。在誘導愈傷組織產(chǎn)生不定芽的實驗中，可以看出6-BA對不定芽的誘導有較明顯的影響，在馬生軍[12]等人的實驗中，NAA濃度不變時，隨著6-BA濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，該結(jié)果與本實驗結(jié)果相同，6-BA2.0mg/L與NAA0.1mg/L配比時，分化的不定芽數(shù)量多，生長速度快。

由于蕎麥葉大百合長年生長于野生狀態(tài)，移栽后需要多加管理，并于后期噴灑一定量的營養(yǎng)液使移栽后的組培面生長良好，為其后續(xù)利用提供更多材料，以滿足市場需求。

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