HS-SPME-GC-MS分析小黃姜精油及油樹脂揮發(fā)性香氣成分

張璐璐，吳建文，黎貴卿，劉慧勤，陸順忠，李秋庭，*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧530002）

西林小黃姜又名細(xì)肉姜、火姜，姜科屬植物，草本多年生單子葉植物姜的地下根莖，一種常見的香辛調(diào)味料和傳統(tǒng)中醫(yī)藥材[1-2]。其根、莖、皮、肉皆為淡黃色，肉質(zhì)致密，姜香濃郁，辛辣味濃，益脾胃、除濕消痞、止咳祛痰的功效優(yōu)良，辛辣與香味和藥效都優(yōu)于大種生姜，故又被稱為“火姜”，是廣西百色市西林縣著名特產(chǎn)，已評(píng)為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品[3-4]。

姜油（ginger oils）是生姜的主要深加工產(chǎn)品，根據(jù)不同的提取方法和產(chǎn)品特性分為精油（essential oils）和油樹脂（oleoresin）兩大類，能充分反映生姜的感官特性及生物活性，不僅是食品工業(yè)的主要原料，還用于醫(yī)學(xué)和洗化用品的開發(fā)，另外作為終端消費(fèi)品也有廣闊的市場(chǎng)前景[1，5-7]。

姜油的香氣由大量的活性香氣成分構(gòu)成，通過刺激或者激活嗅覺器官，產(chǎn)生了各種各樣的香氣[8]，可以作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的理論依據(jù)，也決定著不同的開發(fā)前景，而且是加工工藝改良的重要依據(jù)[9]。頂空-固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）作為香氣物質(zhì)主要測(cè)定方法之一，具有裝置簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、采樣快速、重現(xiàn)性良好和避免了非揮發(fā)成分對(duì)色譜柱的污染等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）可將定性與定量于一體，已廣泛用于揮發(fā)性成分測(cè)定[10]。并且，近幾年研究發(fā)現(xiàn)其在研究葡萄籽油[11]、茶油[12]、蒜油[13]以及金槍魚油[14]等多種油樣的香氣方面也有很好的應(yīng)用。而姜油關(guān)于此方面的研究較少，僅在2015年，劉娜等[15]采用HS-SPME探究不同產(chǎn)地姜油樹脂香氣，發(fā)現(xiàn)主要香氣成分均為莰烯、β-萜品烯、α-蒎烯、水芹烯和β-水芹烯，但是含量差別較大。

因此，本研究采用HS-SPME對(duì)小黃姜不同姜油的萃取條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，并結(jié)合GC-MS技術(shù)手段定性定量，以期全面分析其揮發(fā)性香氣物質(zhì)，為小黃姜的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小黃姜干姜片：西林縣富源植物開發(fā)有限公司；無水乙醇、石油醚、無水硫酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

MND-628多功能養(yǎng)生料理機(jī)：福到家；98-II-B電子調(diào)溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；萃取頭及手動(dòng)進(jìn)樣手柄：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Scion.TQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)布魯克美國(guó)布魯克道爾頓公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料制備

精油：粉碎干姜過40目篩，稱取90 g，水蒸餾物料比1∶16（g/mL），提取至得油體積不再增加，收集上層澄清透明黃色精油，無水硫酸鈉干燥，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

油樹脂：粉碎干姜過40目篩，稱取90 g，索氏提取料液比為1∶8（g/mL），分別使用石油醚在85℃、無水乙醇在95℃條件下提取至回流液無色透明，旋蒸濃縮（溫度50℃）至恒重，得石油醚提取的油樹脂和無水乙醇提取的油樹脂，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 萃取針頭的老化

使用氣相質(zhì)譜儀進(jìn)樣口作為老化裝置，氦氣吹掃保持環(huán)境惰性，老化時(shí)間及溫度按照Supelco公司的推薦條件進(jìn)行，85 μm PA，老化溫度28 0℃，老化時(shí)間0.5 h。50 μm DVB/CAR/PDMS，老化溫度 270 ℃，老化時(shí)間 1 h。100 μm PDMS，老化溫度 250℃，老化時(shí)間0.5 h。

1.2.3 樣品萃取

將樣品置于15 mL樣品瓶中聚四氟乙烯隔墊密封，使用老化后SPME萃取纖維頭在室溫（28℃）進(jìn)行吸附，快速插入GC-MS進(jìn)樣口250℃，解吸一段時(shí)間，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。

1.2.4 萃取條件的優(yōu)化

1.2.4.1 萃取頭的優(yōu)化

分別稱取精油（gingeressentialoils，GEO）0.1500g、石油醚油樹脂（oleoresin extracted by petroleum ether，PEEO）、無水乙醇油樹脂（oleoresin extracted by absolute ethanol，AEEO）各 0.400 0 g于 15 mL 樣品瓶中，使用萃取頭（100μmPDMS、50/30μmDVB/CAR/PDMS、85μm PA）分別萃取精油2 min、油樹脂5 min，在進(jìn)樣口解析3 min進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化指標(biāo)為定性香氣成分的總峰面積和峰數(shù)。

1.2.4.2 萃取時(shí)間的優(yōu)化

分別稱取精油0.150 0 g，油樹脂（PEEO、AEEO）0.400 0 g于15 mL樣品瓶中，使用確定的最佳萃取頭，分別萃取精油（2、3.5、5、6.5 min）和油樹脂（5、7.5、10、12.5 min），在進(jìn)樣口解析3 min進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化指標(biāo)為定性香氣成分的總峰面積和峰數(shù)。

1.2.4.3 解析時(shí)間的優(yōu)化

分別稱取精油0.150 0 g，油樹脂（PEEO、AEEO）0.400 0 g于15 mL樣品瓶中，使用已確定最佳萃取頭和萃取時(shí)間，在進(jìn)樣口解析（1、2、3、4 min）進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化指標(biāo)為定性香氣成分的總峰面積和峰數(shù)。

1.2.5 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：BR-5ms（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50℃保持1 min，以3℃/min升至150℃，保持2 min；再以20℃/min升至250℃，保持2 min；載氣為氦氣，流量 1.20 mL/min，壓力 2.4 kPa；分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度250℃。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件

電離方式EI，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍30 m/z～550 m/z，掃描間隔1 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

定性分析：通過與NIST11譜庫(kù)進(jìn)行檢索，要求正、反匹配度都大于800給予確認(rèn)作為定性結(jié)果。定量分析：面積歸一化法。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的優(yōu)化

萃取頭是影響HS-SPME效果的最大因素。不同材料、不同厚度涂層的萃取頭，極性存在差異，萃取結(jié)果也明顯不同[16]。研究表明，精油主要由單萜和倍半萜烯組成，油樹脂除精油成分還含有姜酚，姜烯酚和姜油酮等酚類物質(zhì)[17-18]。因此，試驗(yàn)選取100μmPDMS（小分子揮發(fā)性非極性物質(zhì)），50 μm DVB/CAR/PDMS（C3～C6大范圍分析），85μmPA（極性半揮發(fā)物質(zhì)，酚類）萃取頭進(jìn)行優(yōu)化。不同萃取頭對(duì)HS-SPME萃取效果的影響見表1。

表1 不同萃取頭對(duì)HS-SPME萃取效果的影響Table 1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different SPME fibers

結(jié)果如表1所示，可以看出不同的萃取頭對(duì)姜油萃取效果差別顯著。萃取頭100 μm PDMS萃取精油和油樹脂所得物質(zhì)總峰面積最大，種類數(shù)最多，萃取效果明顯高于另兩種萃取頭，這與shao等[19]的研究結(jié)果相一致。因此，選取100 μm PDMS作為后續(xù)試驗(yàn)的萃取頭進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 萃取時(shí)間的優(yōu)化

HS-SPME分析揮發(fā)性有機(jī)物時(shí)，萃取平衡所需時(shí)間較短，10 min之內(nèi)一般可達(dá)最高吸附量；分析復(fù)雜基質(zhì)及半揮發(fā)性有機(jī)物時(shí)，30 min至60 min才能達(dá)到平衡[20]。姜油屬濃縮成品，風(fēng)味濃郁，在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在參數(shù)優(yōu)化基礎(chǔ)上，萃取時(shí)間分別設(shè)定為精油：2、3.5、5、6.5 min，油樹脂：5、7.5、10、12.5 min 進(jìn)行優(yōu)化。萃取時(shí)間對(duì)HS-SPME萃取效果的影響見圖1。

圖1 萃取時(shí)間對(duì)HS-SPME萃取效果的影響Fig.1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different extraction time

結(jié)果如圖1A所示，隨著吸附時(shí)間的增長(zhǎng)，GEO的總峰面積先增加后減少，但有效峰個(gè)數(shù)在增加后出現(xiàn)波動(dòng)。可見延長(zhǎng)吸附時(shí)間，有利于達(dá)到萃取平衡，但時(shí)間過長(zhǎng)，萃取柱吸附已經(jīng)達(dá)到飽和，樣品瓶中大量的低沸點(diǎn)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)吸附會(huì)導(dǎo)致高沸點(diǎn)低含量的物質(zhì)所占百分比發(fā)生變化，使總峰面積和有效峰個(gè)數(shù)出現(xiàn)波動(dòng)。對(duì)比3.5 min與6.5 min的物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，6.5 min多吸附的3種物質(zhì)含量極低，僅稍大于0.1%，但因?yàn)闀r(shí)間的增長(zhǎng)導(dǎo)致一些對(duì)姜風(fēng)味起重要作用的物質(zhì)含量降低。又經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，2 min的總峰面積與3.5 min的存在極顯著差異（P＜0.01），與6.5 min的存在顯著差異（P＜0.05）。綜合考慮，確定3.5 min為最佳吸附時(shí)間。

如圖1B所示，隨著吸附時(shí)間的增長(zhǎng)，PEEO總峰面積不斷增加，有效峰個(gè)數(shù)先增加然后保持不變。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)僅7.5 min與10 min的總峰面積存在顯著差異（P＜0.05）?？紤]到7.5 min時(shí)峰型分離的更好，有利于物質(zhì)定量。因此，確定7.5 min為最佳吸附時(shí)間。

如圖1C所示，隨著吸附時(shí)間的增長(zhǎng)，AEEO總峰面積先增加后減少，有效峰個(gè)數(shù)先增加然后保持不變?？赡苡捎谳腿≈竭_(dá)到飽和，延長(zhǎng)一定的吸附時(shí)間，揮發(fā)物重新達(dá)到平衡過程時(shí)總峰面積會(huì)稍有波動(dòng)。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)吸附時(shí)間改變，僅5 min的總峰面積與12.5 min的存在顯著差異（P＜0.05）?？紤]到7.5 min峰數(shù)已達(dá)最大，峰型分離的更好，有利于物質(zhì)定量。因此，確定7.5 min為最佳吸附時(shí)間。

2.3 解析時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

在HS-SPME萃取富集完成后，萃取頭需要在GC進(jìn)樣口解吸進(jìn)樣。當(dāng)進(jìn)樣口溫度一定時(shí)，解吸時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)破壞萃取頭的涂層材料，大大縮短使用壽命。反之解析時(shí)間過短，則不能完全解吸，不僅會(huì)降低GC-MS分析結(jié)果準(zhǔn)確性，還可能污染萃取頭影響后續(xù)試驗(yàn)[21-22]。因此，在優(yōu)化參數(shù)基礎(chǔ)上，對(duì)不同解吸時(shí)間1、2、3、4 min 進(jìn)行優(yōu)化。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在不同的解析時(shí)間條件下，姜油的峰數(shù)均未發(fā)生改變，GEO、PEEO和AEEO的峰數(shù)分別為44、41、44。而解析時(shí)間對(duì)總峰面積影響較大，如圖2所示。GEO的總峰面積在1 min～3 min內(nèi)一直處于上升趨勢(shì)，4 min時(shí)有所降低，證明3 min時(shí)已基本解吸完全，因此，確定3 min作為精油的最佳解析時(shí)間。PEEO和AEEO的總峰面積，在2 min之前隨時(shí)間的增加而增加，2 min后緩慢下降。因此，確定2 min作為油樹脂最佳解吸時(shí)間。

圖2 解析時(shí)間對(duì)HS-SPME萃取效果的影響Fig.2 Extraction efficiencies of HS-SPME with desorption time

2.4 姜油揮發(fā)性成分的分析鑒定

最佳萃取條件下3種姜油的總離子流圖，如圖3所示。

圖3 姜油揮發(fā)性香氣成分的HS-SPME-GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion current chromatogram of aroma volatiles extracted from ginger oil by HS-SPME

由圖3可以看出，在最佳條件下，姜油揮發(fā)性香氣成分分離度好、峰型尖銳、對(duì)稱性好、無過飽和狀態(tài)。

在不同姜油中，同種香氣成分出峰時(shí)間差異不大，組成和含量存在顯著差異，對(duì)其進(jìn)行檢索并計(jì)算相對(duì)百分含量，匯總結(jié)果如表2所示。

表2 姜油揮發(fā)性香氣成分的鑒定結(jié)果及相對(duì)百分含量Table 2 Volatile aroma compounds and relative content from ginger oil

續(xù)表2 姜油揮發(fā)性香氣成分的鑒定結(jié)果及相對(duì)百分含量Continue table 2 Volatile aroma compounds and relative content from ginger oil

由表2可知，GEO共鑒定出44種揮發(fā)性香氣成分，其中萜烴類20種（77.98%），酯類3種（0.70%），酮類6種（2.17%），醛類4種（10.93%），醇類11種（8.22%），主要為β-水芹烯（24.72%）、α-蒎烯（22.28%）、莰烯（10.95%）、α-檸檬醛（5.56%）、β-檸檬醛（4.99%）、月桂烯（4.81%）、姜烯（4.67%）等。PEEO共鑒定出41種香氣成分，其中萜烴類22種（77.64%），酯類3種（0.71%），酮類5種（1.43%），醛類 3種（4.71%），醇類 8種（15.52%），主要為 β-水芹烯（18.44%）、姜烯（18.40%）、莰烯（15.48%）、桉葉油醇（11.81%）、α-蒎烯（5.32%）、β-倍半水芹烯（4.37%）等。AEEO共鑒定出44種香氣成分，其中萜烴類25種（74.88%），酯類4種（1.26%），酮類3種（1.06%），醛類3種（3.13%），醇類9種（19.68%）主要為姜烯（32.51%）、桉葉油醇（14.52%）、β-水芹烯（10.20%）、β-倍半水芹烯（8.00%）、α-姜黃烯（5.53%）、β-紅沒藥烯（4.79%）、（E，E）-α-法呢烯（4.46%）等。

不同姜油的揮發(fā)性香氣成分存在一定差異。其中，GEO中未檢測(cè)到油樹脂中的δ-欖香烯、乙酸香茅酯、（+）-香橙烯、香柑油烯，β-法呢烯等12種香氣成分，而大量研究表明姜精油含有這些成分[23-24]，經(jīng)分析這些成分集中在GC-MS出峰靠后的時(shí)間段，因此，這可能與成分的含量、揮發(fā)性以及萃取頭的萃取平衡等因素相關(guān)。而三環(huán)烯、α-蒎烯、甲基庚烯酮等12種香氣成分均只在其中一種油樹脂中檢測(cè)到，可能與兩種溶劑極性差別有關(guān)。此外，姜辣素類物質(zhì)是油樹脂主要成分，使其呈現(xiàn)特征辛辣風(fēng)味，但是在PEEO、AEEO頂空固相微萃取的整個(gè)優(yōu)化過程中均未檢測(cè)到，這與文獻(xiàn)中姜酚、姜烯酚沸點(diǎn)高不具有揮發(fā)性相一致[25-27]。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME以總峰面積和峰數(shù)為優(yōu)化指標(biāo)對(duì)萃取頭、萃取時(shí)間和解析時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確立常溫下萃取小黃姜3種姜油香氣成分最佳條件為：GEO0.1500g，采用100μmPDMS萃取頭，萃取3.5min，解析 3 min；PEEO、AEEO 均為 0.400 0 g，采用 100 μm PDMS萃取頭，萃取7.5 min，解析2 min。最佳條件下GEO、PEEO、AEEO 分別測(cè)定出 44、41、44 種香氣成分，含量最高的物質(zhì)均為萜烴類，也含有少量酯、酮、醛和醇。3種姜油在組成和含量均具有一定差異，使得呈香各具特色。其中GEO主要為β-水芹烯、α-蒎烯、莰烯、α-檸檬醛、β-檸檬醛、月桂烯、姜烯等；PEEO 主要為 β-水芹烯、姜烯、莰烯、桉葉油醇、α-蒎烯、β-倍半水芹烯等；AEEO主要為姜烯、桉葉油醇、β-水芹烯、β-倍半水芹烯、α-姜黃烯、β-紅沒藥烯、（E，E）-α-法呢烯等。