微生物多糖與Fe離子螯合試驗(yàn)研究

刁歡，張娟娟，趙紅，賀真真

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥230088）

鐵是人體的必需營養(yǎng)素，是非常容易引起代謝紊亂的元素。鐵主要在人體內(nèi)攜帶和輸送O2和CO2；可以增強(qiáng)免疫功能；可以保持正常造血功能以及參與人體新陳代謝等[1-2]。缺鐵會(huì)引起各種疾病，如缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA），同時(shí)還會(huì)引起免疫力、抵抗力低下等問題。我國IDA的發(fā)生率比較高，是我國重要的公共營養(yǎng)衛(wèi)生問題，嚴(yán)重影響人類的健康，兒童和孕婦缺鐵現(xiàn)象相對(duì)更加嚴(yán)重。IDA增加了妊娠高血壓的發(fā)生率，還可對(duì)兒童的大腦發(fā)育造成不可逆的損傷[3]。一般可通過口服補(bǔ)鐵，靜脈注射鐵或聯(lián)合營養(yǎng)干預(yù)來治療IDA，臨床上取得了顯著效果，但在患者依從性、效率和不良反應(yīng)方面仍存在顯著差異。因此，現(xiàn)有的補(bǔ)鐵劑還需要加以優(yōu)化，并需開發(fā)出副作用少、利用率高、且能被人體快速吸收和利用的口服新型補(bǔ)鐵劑。

當(dāng)前國內(nèi)外大多探究的是一類以多糖為載體、螯合Fe3+后形成的配合物，以Fe3+為中心的多糖鐵現(xiàn)已成為一種新型的口服補(bǔ)鐵劑。在1990年之后，右旋糖酐鐵在美國普遍用于醫(yī)治IDA，其對(duì)腸道無刺激，之后以Fe3+為中心、含多羥基的多糖類為配體的多糖鐵復(fù)合物成為新研究熱點(diǎn)。近年來，很多學(xué)者用中藥或食品所含多糖合成多糖鐵復(fù)合物，如大棗、玉米、茶葉、人參、二色補(bǔ)血草多糖鐵等[4-6]。多糖鐵具有較強(qiáng)的還原性，是一種新型的鐵補(bǔ)充劑[7]。多糖鐵配合物以非游離形態(tài)出現(xiàn)，不但可以避免胃腸道損傷，還可以在體內(nèi)還原成Fe2+被吸收利用。多糖鐵配合物和傳統(tǒng)的補(bǔ)鐵劑相比較而言，前者容易被人體攝取，具有較強(qiáng)絡(luò)合Fe3+能力，對(duì)胃腸道的不良反應(yīng)較弱，況且當(dāng)Fe3+釋放之后，配體多糖增強(qiáng)人體免疫能力，對(duì)細(xì)胞無損害，可以完全攝取。多糖鐵可以分子方式存在于人體中，并具備水溶性、沒有腸道刺激性、無毒性等優(yōu)勢(shì)。

克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）的胞外多糖是一種非常好的免疫調(diào)節(jié)劑，具備高質(zhì)量、不良反應(yīng)少等特征[8]。此類菌的大多數(shù)胞外多糖具備絮凝活性和重金屬的吸附能力。Sugihara等利用K.oxytoca TMN3發(fā)酵提取胞外多糖，并對(duì)此進(jìn)行免疫活性的研究，結(jié)果顯示該多糖對(duì)小鼠關(guān)節(jié)炎有免疫效果[9]。多糖與鐵元素二者結(jié)合在一起，有望成為有一種新型補(bǔ)鐵劑，滿足人們的需要。

當(dāng)前尚未發(fā)現(xiàn)微生物胞外多糖和鐵螯合的有關(guān)研究報(bào)道，本論文通過研究制備微生物胞外多糖鐵的最佳工藝，為進(jìn)一步開發(fā)其螯合物提供重要依據(jù)，并為利用微生物胞外多糖鐵配合物開發(fā)臨床補(bǔ)鐵劑類藥物提供科學(xué)依據(jù)。本文擬通過研究克雷伯氏菌胞外多糖鐵的制備工藝，實(shí)現(xiàn)其與鐵的有效螯合，并獲得有望成為新型鐵補(bǔ)充劑的多糖鐵。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：克雷伯氏菌種由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技樓613實(shí)驗(yàn)室，從白酒廠活性污泥中篩選而來。

種子培養(yǎng)基（nutrient broth medium，NB）：牛肉膏5 g、NaCl 5 g、蛋白胨 10 g，加 H2O 1 000 mL，自然 pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、酵母膏0.5 g、K2HPO45.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.2 g、NaCl 0.1 g、硫酸銨0.1 g、尿素 0.5 g、水 1 000 mL。

ZHP-100型振蕩培育箱：常州諾基儀器有限公司；UV1000型單光束紫外/可見分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；DHG-9101.3A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；FA2004N型電子天平：上海箐海儀器有限公司；XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國宇儀器制造有限公司；離心機(jī)：蘇州玖世器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 克雷伯氏菌胞外多糖的提取

克雷伯氏菌胞外多糖粗提步驟：發(fā)酵培養(yǎng)液→離心、去菌體細(xì)胞→無水乙醇添加倍量→4℃沉淀過夜放置→離心，取沉淀→再溶解→Sevage去蛋白→透析后再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍真空干燥→初步獲得微生物絮凝劑的粗品。

克雷伯氏菌株按照1%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min、培養(yǎng)48 h，制備細(xì)菌發(fā)酵液。取發(fā)酵液50 mL經(jīng)3 000 r/min離心15 min，將上清液置于三角瓶中，然后按照上述方法進(jìn)行胞外多糖提取，獲得多糖粗品[10]。

1.2.2 克雷伯氏菌胞外多糖的純化

利用Sevage試劑法去除克雷伯氏菌胞外多糖粗品中蛋白質(zhì)成分，經(jīng)透析法去除鹽、有機(jī)溶劑和部分生物小分子雜質(zhì)，再利用凝膠層析法進(jìn)行深度純化。葡萄糖凝膠為Sephadex G-200，層析柱規(guī)格為40 cm×2.5 cm。

1.2.3 克雷伯氏菌多糖鐵螯合物的制備

稱取克雷伯氏菌胞外多糖純品，按照一定質(zhì)量比加入檸檬酸三鈉，用10 mL蒸餾水溶解，再加入足夠0.1 mol/L的FeCl3，調(diào)節(jié)pH值在7～8之間，可以看到有紅棕色沉淀的生成，當(dāng)反應(yīng)中產(chǎn)生的沉淀不再溶解時(shí)，停止添加FeCl3溶液，此時(shí)說明已反應(yīng)完全；之后70℃水浴1 h，并不停攪拌；再4 000 r/min離心5 min，取上清液，加3倍95%乙醇，再離心；沉淀分別用無水乙醇、95%乙醇和無水乙醚3種有機(jī)溶劑洗滌，之后再真空干燥，制得粗品[11]。

1.2.4 鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用鄰菲羅啉比色法[12]，取8個(gè)50 mL容量瓶，按順序準(zhǔn)確加入 0、4.0、6.0、8.0、12.0、14.0、18.0、20.0 mL的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別加入10%的乙酸鈉溶液8 mL、10%的鹽酸羥胺溶液1 mL以及0.1%的鄰菲羅啉溶液10 mL進(jìn)行反應(yīng)，蒸餾水定容后搖勻，靜置15 min，測(cè)510 nm處吸光度值，并作出回歸方程。

1.2.5 樣品中鐵含量的測(cè)定

稱量一定的干燥多糖鐵配合物溶于蒸餾水中，50 mL容量瓶定容，即制得待測(cè)胞外多糖鐵溶液。

取多糖鐵溶液1 mL放入50 mL容量瓶，分別加入10%的鹽酸羥胺溶液2 mL和10%的鹽酸溶液1 mL，常溫（25℃左右）下反應(yīng)1 h，然后按順序加入10%的乙酸鈉溶液10 mL和0.15%的鄰二氨菲溶液4 mL，計(jì)算鐵的含量，方法同 1.2.4[11，13]。

1.2.6 螯合試驗(yàn)的單因素考察

在微生物胞外多糖鐵螯合的試驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)，螯合物中鐵含量受多糖和檸檬酸三鈉加入量的比例、螯合時(shí)間、螯合溫度及溶液pH值影響較大，所以對(duì)這些影響因素再進(jìn)行具體的單因素考察，最后得到最佳制備工藝范圍。

胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比：檸檬酸三鈉作為催化劑對(duì)多糖鐵的螯合作用有一定的影響。設(shè)置不同質(zhì)量比 2∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、6 ∶1進(jìn)行探究。螯合時(shí)間：設(shè)置 0.5、1、1.5、2、2.5 h 5 個(gè)不同時(shí)間進(jìn)行探究。螯合溫度：設(shè)置 40、50、60、70、80℃ 5個(gè)不同的螯合溫度進(jìn)行探究。溶液pH值：在5個(gè)不同pH值6、7、8、9、10的條件下進(jìn)行探究。根據(jù)上述的初步試驗(yàn)進(jìn)行多糖鐵的螯合，最后通過鄰菲羅啉法測(cè)定樣品中的鐵含量。

1.2.7 正交試驗(yàn)及其驗(yàn)證

按照1.2.3的試驗(yàn)方法進(jìn)行螯合，測(cè)定各組樣品的鐵含量，并經(jīng)過正交數(shù)據(jù)分析獲得最佳制備工藝條件，因素水平表見1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L9（34）horizontal table of factors in orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of iron

根據(jù)鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到回歸方程：y=0.003 9x+0.005 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7。由圖1可知，鐵濃度在0 μg/mL～200 μg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素考察

2.2.1 胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比對(duì)鐵含量的影響

胞外多糖與檸檬酸三鈉按質(zhì)量比分別為2∶1、3∶1、4 ∶1、5∶1、6∶1，在 pH 值為 8、70℃條件下水浴 1h，并根據(jù)上述步驟進(jìn)行螯合，得出結(jié)果見圖2。

圖2 胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of polysaccharide to trisodium citrate on iron content in products

由圖2可知，克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比因素影響大，當(dāng)質(zhì)量比小于3∶1時(shí)，不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)質(zhì)量比大于4∶1時(shí)，其含鐵量逐步減小，檸檬酸三鈉在反應(yīng)體系中作為催化劑，添加量過多過少，均會(huì)影響反應(yīng)體系效率，故選擇克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的最佳質(zhì)量比為3∶1。

2.2.2 螯合時(shí)間對(duì)產(chǎn)品中鐵含量的影響

在最佳質(zhì)量比3∶1的條件下，選擇pH值為8、70 ℃的條件下水浴 0.5、1、1.5、2、2.5 h 進(jìn)行螯合反應(yīng)。結(jié)果見圖3。

圖3 螯合時(shí)間對(duì)產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.3 Effect of chelating time on iron content in products

由圖3可知，反應(yīng)1 h時(shí)，鐵含量達(dá)到最高，但隨著時(shí)間的增加，鐵含量迅速下降。因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)達(dá)到一定的時(shí)間，反應(yīng)完全，繼續(xù)反應(yīng)，易使螯合物分離，得到的鐵含量也降低。因此，最佳螯合時(shí)間選擇為1 h。

2.2.3 螯合溫度對(duì)產(chǎn)品中鐵含量的影響

將胞外多糖和檸檬酸三鈉以3∶1的質(zhì)量比分別在 40、50、60、70、80 ℃、pH 值為 8 的條件下水浴 1 h，并根據(jù)初步試驗(yàn)進(jìn)行螯合，結(jié)果見圖4。

圖4 螯合溫度對(duì)產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.4 Effect of chelating temperature on iron content in products

由圖4可知，隨著溫度的升高，所得鐵含量先降低后增加，當(dāng)螯合溫度為60℃時(shí)達(dá)到最大值，然后鐵含量迅速降低，當(dāng)反應(yīng)溫度過高時(shí)，離子振動(dòng)比較強(qiáng)烈，不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)溫度過低，則很難進(jìn)行螯合反應(yīng)。因此最佳螯合溫度為60℃。

2.2.4 溶液pH值對(duì)產(chǎn)品中鐵含量的影響

按照胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比3∶1，螯合溫度 60 ℃，溶液 pH 值分別為 6、7、8、9、10，水浴 1 h，產(chǎn)品中鐵含量的測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 螯合pH值對(duì)產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.5 Effect of chelating pH on iron content in products

當(dāng)pH值高于7時(shí)，反應(yīng)體系中離子強(qiáng)度過大，阻礙反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)pH值較低時(shí)，則反應(yīng)氫離子濃度增大，導(dǎo)致螯合反應(yīng)不完全。當(dāng)反應(yīng)液pH值為7時(shí)，所得含鐵量最高，為最佳螯合pH值。

2.3 正交試驗(yàn)

L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9（34）Orthogonal test results

續(xù)表2L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2L9（34）Orthogonal test results

從表2可以得到：極差值R可以看出影響克雷伯氏菌胞外多糖與三價(jià)鐵螯合效果從大到小依次為D>C>B>A，即克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比>螯合時(shí)間>螯合溫度>溶液pH值，最佳的試驗(yàn)組合為A2B2C1D2，即克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為3∶1，反應(yīng)時(shí)間為0.5 h，溫度為60℃，溶液pH值為7。經(jīng)驗(yàn)證在這種條件下，所得螯合物的含鐵量最高為2.88%，大于正交試驗(yàn)第2組（A1B2C2D2）的結(jié)果。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響克雷伯氏菌胞外多糖與三價(jià)鐵螯合效果從大到小依次為D>C>B>A，得出最佳螯合試驗(yàn)組合為A2B2C1D2，即克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為3∶1，螯合反應(yīng)時(shí)間為0.5 h，溫度為60℃，溶液pH值為7。經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下所得的含鐵量最高為2.88%。

本研究制得的多糖鐵中鐵含量最高為2.88%，與植物多糖鐵的含量有一定差距。當(dāng)歸多糖鰲合鐵的能力差異較大，試驗(yàn)通過高價(jià)鐵鹽的鑒別反應(yīng)，得出鐵含量可達(dá)10%～40%[14]；黨參多糖也可在堿性條件下合成黨參多糖鐵，且含鐵量可達(dá)19.9%[15]；在pH 4.1～12.6的條件下，茯苓多糖與鐵易鰲合，且鰲合鐵的鐵含量達(dá)6.33%[16]。黃芪多糖與鐵螯合力較強(qiáng)，形成的復(fù)合物中鐵含量可達(dá)到20.45%[17]?；覙浠ǘ嗵窃?0℃，螯合0.5 h，且溶液pH值為8時(shí)，可制得灰樹花多糖鐵的螯合物，鐵含量最高為3.08%[11]。天麻多糖鐵經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝后，螯合物中鐵含量為33.48%[18]。不同多糖原料螯合鐵后得到的螯合物中鐵元素含量差異較大[19-20]。本研究中微生物胞外多糖與鐵離子可能未充分螯合，也可能是由于胞外多糖提純程度不足等導(dǎo)致螯合率不高。但本研究開拓了一個(gè)新的螯合領(lǐng)域，克雷伯氏菌胞外多糖螯合鐵有望成為一種新的補(bǔ)鐵劑，但其結(jié)構(gòu)分析和安全性驗(yàn)證試驗(yàn)還需要進(jìn)一步研究。