細(xì)菌生物被膜檢測(cè)與清除方法研究進(jìn)展

張君怡，王靜怡，巴巨偉，崔雪巖，崔佳琪，郝建雄

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000）

1978年，英國(guó)學(xué)者J.Willam Costerton首次提出生物被膜的概念。細(xì)菌生物被膜（biofilm，BF）是指細(xì)菌黏附于接觸表面上，同時(shí)分泌多糖蛋白復(fù)合物、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)從而形成的細(xì)菌聚集膜[1]。細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)通過(guò)黏附在附著物表面形成生物被膜，如菌毛等結(jié)構(gòu)[2]。生物被膜對(duì)細(xì)菌菌體具有強(qiáng)烈的保護(hù)作用，使菌體成為具有結(jié)構(gòu)和復(fù)雜代謝的高度組織群體。生物被膜的結(jié)構(gòu)符合Marc habas等提出的成熟生物被膜模型，即分別為基質(zhì)層、條件層、連接層和生物被膜層。不同位置的生物被膜的體積和代謝活性均有顯著差異。近年的研究表明，世界廣為傳播的致病菌均易形成生物被膜，如李斯特菌、假單胞菌和沙門氏菌等[3-4]。在食品廠房的地板、天花板、加工設(shè)備、工業(yè)管道等表面均易形成食源性致病菌生物被膜，生物被膜的形成不僅會(huì)損害設(shè)備，污染食品，還會(huì)傳播食源性疾病。例如牙周炎是由產(chǎn)酸性革蘭氏陽(yáng)性菌球菌引發(fā)，心內(nèi)膜炎與草綠色鏈球菌生物被膜形成息息相關(guān)。顯然有關(guān)生物被膜的檢測(cè)和清除已成為當(dāng)下的熱門。因此本文結(jié)合當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)生物被膜的相關(guān)研究，擬對(duì)生物被膜的形成過(guò)程和調(diào)控機(jī)制、檢測(cè)和清除方法的研究展開綜述，旨在闡明生物被膜形成和機(jī)制以及檢測(cè)和清除的方法技術(shù)，其在食品工業(yè)和慢性感染的預(yù)防和治療中起到重要作用。

1 細(xì)菌生物被膜的形成

目前，研究者公認(rèn)的細(xì)菌形成細(xì)菌生物被膜的過(guò)程包括黏附（adherence）、生長(zhǎng)（growth）、成熟（maturation）、分散（dispersal）4 個(gè)階段的動(dòng)態(tài)過(guò)程[5]。

1.1 細(xì)菌黏附期

細(xì)菌黏附是形成細(xì)菌生物被膜的首要步驟。胞外大分子物質(zhì)與生物材料表面受體相互作用產(chǎn)生附著力，具有特異性。根據(jù)細(xì)菌黏附在材料表面的原理不同可分為可逆黏附和不可逆黏附。首先，浮游菌通過(guò)鞭毛作用減少與固體表面之間的排斥力，固定到載體表面，這個(gè)黏附是可逆的。由胞外多聚物或鞭毛介導(dǎo)，使細(xì)胞牢固附著到材料表面，這個(gè)黏附是不可逆的。Takhistov等觀察到，在3 s～5 s極短的時(shí)間內(nèi)，細(xì)菌處在最不穩(wěn)定黏附期狀態(tài)，可以通過(guò)沖洗、加熱等物理方法清除細(xì)菌生物被膜[6]。

1.2 生物被膜生長(zhǎng)期

在與表面黏附接觸后，細(xì)菌形成單層菌膜，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)分泌大量胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS），不斷形成微菌落。蛋白質(zhì)、多糖、核酸和磷脂等物質(zhì)組成了EPS，EPS的形成使細(xì)菌相互黏結(jié)并黏附于物體表面[7]。在細(xì)菌生物被膜形成階段，除觀察到EPS的合成增加外，還有細(xì)菌生物被膜不斷加厚成熟，增強(qiáng)其對(duì)于不利環(huán)境的抗性[8]。感應(yīng)環(huán)境信號(hào)觸發(fā)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與胞內(nèi)信號(hào)分子都可以調(diào)節(jié)細(xì)菌生物被膜的形成[9]。由于細(xì)菌生物被膜處于形成初期，設(shè)備表面細(xì)菌的附著力不是十分穩(wěn)定。

1.3 生物被膜成熟期

此階段EPS包裹細(xì)菌，微菌落大量聚集形成了成熟的細(xì)菌生物被膜。在成熟的細(xì)菌生物被膜內(nèi)，細(xì)菌通過(guò)脫落、再黏附、再形成新的被膜的方式進(jìn)入新的階段。在這個(gè)階段，細(xì)菌生物被膜的結(jié)構(gòu)由扁平不均一向高度結(jié)構(gòu)化發(fā)展，這也是它具有抗逆特性的原因之一。由于養(yǎng)料、酶和代謝廢物的不斷運(yùn)輸，細(xì)菌生物被膜此時(shí)結(jié)構(gòu)比生長(zhǎng)期的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)各種不利環(huán)境因素的抵抗力也達(dá)到最強(qiáng)。此時(shí)，加大清洗力度和提高殺菌劑的劑量難以清除細(xì)菌生物被膜。

1.4 細(xì)菌的分散

分散是細(xì)菌生物被膜形成的第四階段。生物被膜細(xì)菌受到環(huán)境和養(yǎng)料的限制，會(huì)離開附著表面，重新黏附于適宜生長(zhǎng)新細(xì)菌生物被膜的表面。在新的接觸表面，細(xì)菌生物被膜各條件的改變都會(huì)促進(jìn)細(xì)菌表達(dá)相關(guān)的分散基因[10]。Sauer等[11]發(fā)現(xiàn)可獲得性碳源數(shù)量的增長(zhǎng)對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜中的野生株呈促進(jìn)作用。而離開的細(xì)菌又會(huì)重新進(jìn)行以上4個(gè)步驟，生物被膜形成的不斷循環(huán)為其難以清除的主要原因。

2 細(xì)菌生物被膜的調(diào)控機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞可以調(diào)控小分子信號(hào)分子，當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，會(huì)和相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)信息的傳遞[12]。這種通過(guò)細(xì)胞密度的細(xì)胞信息交流現(xiàn)象稱為細(xì)菌的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS），該現(xiàn)象與生物被膜形成有關(guān)。所以干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)將成為抑制細(xì)菌生物被膜的有效手段。群體感應(yīng)抑制劑可破壞受體蛋白的結(jié)合，減少細(xì)菌中的濃度，抑制細(xì)菌生物被膜生長(zhǎng)。

研究發(fā)現(xiàn)在腐敗細(xì)菌中，蛋白酶、果膠酶等都會(huì)在群體感應(yīng)系統(tǒng)的控制下得到分泌[13]，熒光假單胞菌中的蛋白酶受基于?；呓z氨酸內(nèi)酯的群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)[14]。Aifei Zhao等研究表明熒光假單胞菌細(xì)胞上清液加熱有3種群體感應(yīng)的誘導(dǎo)物，這表明加熱不能抑制細(xì)胞上清液中的感應(yīng)活性[15]。

QS可通過(guò)自體誘導(dǎo)物（autoinducer，AI）信號(hào)分子的產(chǎn)生、分泌和響應(yīng)，感知細(xì)菌密度的變化，從而調(diào)控基因的表達(dá)[16]。QS主要可分為以下3種類型：（1）主要存在于革蘭氏陰性菌中，以高絲氨酸內(nèi)酯（acyl-homoserine lactones，AHL）介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)[17]。大多數(shù)革蘭氏陰性菌中含有通過(guò)共價(jià)鍵連接外層膜和多糖的胞壁質(zhì)脂蛋白（Braun's lipoprotein）。大腸桿菌中，AHL被LuxR型蛋白當(dāng)作折疊開關(guān)使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并在沒(méi)有這種信號(hào)的情況下退化[18]。（2）存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中，以寡肽（autoinducing peptide，AIP）介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。如單增李斯特菌中的AIP介導(dǎo)的Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌生物被膜的形成正調(diào)控，系統(tǒng)中的編碼前提肽AgrD被AgrB翻譯和修飾，AgrD被加工成具有誘導(dǎo)功能的信號(hào)肽，從而參與系統(tǒng)調(diào)控[19]。（3）除此之外，革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌中也存在信號(hào)分子AI-2介導(dǎo)的細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)。Ng等[20]證實(shí)，AI-2信號(hào)分子的合成與LuxS基因相關(guān)，一旦LuxS基因失活，AI-2信號(hào)分子將不會(huì)產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，盡管LuxS在不同種屬李斯特菌中具有比較保守的序列，但具有較高生物膜形成能力的菌株LuxS基因在不同的堿基位點(diǎn)上也存在差異[21]。LuxS/AI-2系統(tǒng)可以影響葡萄球菌屬中生物膜的形成：生物膜形成的調(diào)控子Rbf，間接抑制IcaR的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Ica表達(dá)水平增高、Pia產(chǎn)生和生物被膜形成[22]。

細(xì)菌生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌基因表達(dá)與浮游菌不完全相同。Huang Y Y等構(gòu)建了gltb和gltc缺失的突變體，與野生型相比，這兩種突變體的生物膜形成明顯減少[23]。除此之外，還有APHA是弧菌中的一種小的PADR家族DNA結(jié)合調(diào)節(jié)劑，與生物膜形成和細(xì)菌的群體感應(yīng)有關(guān)[24]。所以，aphA無(wú)效突變體中生物被膜胞外聚合物的減少導(dǎo)致生物膜形成減少[23]。研究發(fā)現(xiàn)生物膜的形成與鞭毛的合成代謝調(diào)控的基因突變有關(guān)，DNase I可以減少附著并分散已建立的生物膜，但沒(méi)有完全抑制生物膜的發(fā)展。Nguyen等還發(fā)現(xiàn)蛋白酶K可分散食品級(jí)不銹鋼上缺乏多糖合成編碼基因的一些細(xì)菌形成的生物膜[25]。Uyen T發(fā)現(xiàn)蛋白酶K比DNase I分散現(xiàn)有生物膜更有效，且公認(rèn)安全的菠蘿蛋白酶在清除生物被膜也遠(yuǎn)不如蛋白酶K有效[26]。除此之外，lmo 1386是編碼推定的DNA轉(zhuǎn)位酶基因，復(fù)制lmo 1386補(bǔ)充分離株，整合其衍生物與細(xì)菌的啟動(dòng)子，基因互補(bǔ)突變體恢復(fù)了生物膜表型[27]。lmo 1386可以降低最初的黏附能力，導(dǎo)致生物膜受損，這也加強(qiáng)了對(duì)生物膜形成的理解。

3 細(xì)菌生物被膜檢測(cè)方法

因細(xì)菌生物被膜表面具有多種微生物群落和胞外物質(zhì)的特點(diǎn)，因此通過(guò)定性檢測(cè)和定量檢測(cè)，進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌生物被膜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、比較和分析。

3.1 細(xì)菌生物被膜定性研究方法

細(xì)菌生物被膜定性研究方法主要借助各種染色方法（如銀染法）、光學(xué)和光譜學(xué)方法（如光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)等）進(jìn)行細(xì)菌生物被膜檢查和監(jiān)測(cè)，研究者更傾向于通過(guò)顯微檢查技術(shù)觀察選取細(xì)菌生物被膜與細(xì)菌群體的結(jié)構(gòu)參數(shù)和構(gòu)效關(guān)系。

3.1.1 銀染法

銀染法是利用AgNO3溶液和多糖蛋白復(fù)合物產(chǎn)生反應(yīng)生成黑色物質(zhì)的原理，通過(guò)銀染可以觀察不同階段細(xì)菌生物被膜中多糖蛋白復(fù)合物的變化趨勢(shì)，并且用這種方法可以評(píng)估細(xì)菌的黏附性[28]。銀染法操作簡(jiǎn)單，在試驗(yàn)條件較簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行操作，且能夠鑒定大量生物被膜的形成能力[29]。

3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)板法

細(xì)胞培養(yǎng)板法通過(guò)冰醋酸溶解結(jié)晶紫染色生物被膜，并根據(jù)顏色對(duì)細(xì)菌生物被膜進(jìn)行檢測(cè)[30]。此法簡(jiǎn)單方便，檢測(cè)迅速，適合在較簡(jiǎn)易的試驗(yàn)條件下定性檢測(cè)細(xì)菌生物被膜，可用細(xì)胞培養(yǎng)板法定性溶藻弧菌[31]。

3.1.3 剛果紅瓊脂培養(yǎng)法

剛果紅瓊脂培養(yǎng)法的原理是在生物被膜的形成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的胞外聚合物，其中的胞外多糖與剛果紅結(jié)合，可觀察到干燥的紅褐色結(jié)晶。試驗(yàn)中多用剛果紅瓊脂培養(yǎng)法來(lái)對(duì)細(xì)菌的潛在毒力進(jìn)行判斷。

3.1.4 掃描顯微鏡和透射電鏡掃描

電鏡為研究人員提供了生物被膜的空間結(jié)構(gòu)，并且可檢測(cè)胞外物質(zhì)的分布情況[32]。電子顯微鏡的方法也可以對(duì)細(xì)菌和真菌BF進(jìn)行定量測(cè)定[33]，也可以對(duì)生物被膜的表型特征進(jìn)行評(píng)價(jià)[34]。汪洋[35]通過(guò)蘇木精-伊紅染色和掃描電鏡，觀察luxS缺失株和野生株的生物被膜成像對(duì)比，為探究鏈球菌中l(wèi)uxS和生物被膜形成和其毒力邁出了至關(guān)重要的一步[36]。光學(xué)透鏡被電子透鏡代替，分辨率小于納米，可以高倍放大物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)。透射電鏡雖然可以深入了解生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和胞外聚合物的特征，但是透射電鏡也有損傷樣品與試驗(yàn)成本過(guò)高的不足。

3.1.5 激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CSLM）

該方法可以依據(jù)死活細(xì)胞膜的通透性不同，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察菌體活性的變化，從而定量測(cè)定生物被膜。常用刀豆素A（concanamycin A，ConA）等熒光結(jié)合凝集素，進(jìn)行熒光標(biāo)記后聯(lián)合CLSM觀察結(jié)果[37]。

3.2 細(xì)菌生物被膜定量研究方法

3.2.1 平板分析法

平板分析法工作強(qiáng)度大、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、誤差較大，不適宜樣本觀察，其中細(xì)菌生物被膜從黏附表面的剝離程度是影響試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。這種方法很少單獨(dú)使用，一般結(jié)合其他方法對(duì)細(xì)菌生物被膜進(jìn)行定量研究。

3.2.2 超聲波平板法

在質(zhì)量合格的產(chǎn)品進(jìn)入加工環(huán)節(jié)后，汪記在產(chǎn)品的每個(gè)階段也都制定著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓に嚰安僮饕?guī)程，各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格按照要求組織生產(chǎn)。生產(chǎn)過(guò)程中，設(shè)立質(zhì)檢監(jiān)督崗位，對(duì)生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的操作進(jìn)行抽查驗(yàn)證，同時(shí)在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)各個(gè)工序環(huán)節(jié)安裝視頻監(jiān)控系統(tǒng)，實(shí)時(shí)監(jiān)控廠區(qū)生產(chǎn)操作，實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)監(jiān)控全覆蓋、無(wú)盲區(qū)。

許多試驗(yàn)結(jié)果均顯示超聲波平板法的效果比平板法更有效率，該方法可以控制處理時(shí)間和溫度，更改超聲波功率，除此之外，該方法很少受到人為因素的影響，這是其更受青睞的原因。但超聲波平板法也有缺點(diǎn)，如對(duì)于形成時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)菌生物被膜還不能做到完全剝離，與平板分析一樣也存在著測(cè)定誤差；而且剝離后也需要進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，不能達(dá)到快速檢測(cè)的要求[38]。

3.2.3 微孔板法

微孔板法是定量檢測(cè)BF的常用方法。在評(píng)估生物被膜方面，微孔板和顯微鏡結(jié)合也起到了突出的作用[39]。Chavant實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基中放入磁珠，定量計(jì)算磁珠表面形成生物被膜和基質(zhì)組成已眾所周知[40]。

3.2.4 結(jié)晶紫染色法

結(jié)晶紫染色法[41]是目前研究生物被膜使用頻率最高的檢測(cè)方法。結(jié)晶紫在表面濕潤(rùn)生物被膜，靜置一段時(shí)間后，通過(guò)水洗的方法對(duì)未結(jié)合的結(jié)晶紫進(jìn)行去除，經(jīng)烘干處理后，用溶解液對(duì)生物被膜上的染料進(jìn)行溶解，酶標(biāo)儀對(duì)溶解液的吸光度的數(shù)值來(lái)反映生物被膜的數(shù)值。結(jié)晶紫染色法難度低，準(zhǔn)確度高，試管和96孔板是最常用的培養(yǎng)生物被膜的載體。

3.2.5 熒光法

該方法利用不同的熒光染料可以選擇性地觀察細(xì)菌生物被膜，利用Syto9及碘化丙錠發(fā)出的不同熒光可以區(qū)分細(xì)菌生物被膜中的活菌與死菌[42]。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是通過(guò)核酸探針雜交原理，并應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)，在細(xì)胞核中或在染色體上顯示DNA序列位置的方法，然后在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，用特異性熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針結(jié)合互補(bǔ)核苷酸序列。熒光法可以快速檢測(cè)被測(cè)物質(zhì)，方法安全，且核酸的探針可長(zhǎng)期保存。雜交特異性是肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探針熒光原位雜交技術(shù)的顯著特性，這使得在判斷細(xì)菌存在的基礎(chǔ)上也不會(huì)損害細(xì)菌的結(jié)構(gòu)[43]。熒光法與CLSM聯(lián)用，可檢測(cè)和鑒定傷口中特別是慢性傷口中細(xì)菌的各種情況，與傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)技術(shù)相比，有很明顯的優(yōu)勢(shì)。

3.2.6 試鹵靈試驗(yàn)

刃天青是一種藍(lán)色化合物，被活細(xì)胞代謝成粉色的試鹵靈（resorufin），與平板計(jì)數(shù)得到的結(jié)果之間有很好的相關(guān)性[42]。在生物被膜中加入新鮮培養(yǎng)基和刃天青，使測(cè)定生物被膜的數(shù)量更為準(zhǔn)確。這種方法主要用于真菌、葡萄球菌和變形鏈球菌的藥敏試驗(yàn)。

3.2.7 MTT/XTT試驗(yàn)

許多四唑鹽類染料可以對(duì)細(xì)菌生物被膜中活細(xì)胞進(jìn)行定量，并可以區(qū)別出活細(xì)胞和死細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于懸浮細(xì)胞的定量化和細(xì)菌生物被膜的定量研究中。但它的缺點(diǎn)是種內(nèi)和種間變異較大，所以只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力，不能測(cè)絕對(duì)值。文獻(xiàn)顯示優(yōu)化的 2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （triphenyl tetrazolium choloride，TTC）可以來(lái)量化BF中細(xì)菌的代謝活性[43]。除此之外2，3-雙（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5-[（苯氨基）羰基]-氫氧化四唑[2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyc）2-H-tetrazolium-5-car-boxanilide，XTT]不穩(wěn)定，所以要需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.2.8 ATP生物發(fā)光法

由于ATP生物發(fā)光法檢測(cè)迅速、靈敏度高的特點(diǎn)，因此其在食品工業(yè)中具有的使用已十分普遍。但此方法極易受環(huán)境的干擾[44]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)生物被膜的檢測(cè)方法不斷更新，最新檢測(cè)方法及其特點(diǎn)見表1。

表1 細(xì)菌生物被膜檢測(cè)的最新研究進(jìn)展Table 1 The latest research progress of bacterial biofilm detection

最新生物被膜檢測(cè)方法顯示超聲尾波干涉法、MgZnO雙門TFT生物傳感器、RT-PCR法、圓盤擴(kuò)散法以及備受矚目的電化學(xué)法對(duì)比傳統(tǒng)的定性或定量檢測(cè)方法，靈敏度更高，消耗量更低，更適用于快速檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果也更加嚴(yán)謹(jǐn)和科學(xué)，為后續(xù)清除生物被膜奠定了更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。生物被膜的檢測(cè)在鑒定和預(yù)防控制生物被膜領(lǐng)域均具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

4 細(xì)菌生物被膜的清除方法

細(xì)菌生物被膜對(duì)殺菌劑的抗性受到表面材料的影響，如不銹鋼比玻璃對(duì)微生物更有更強(qiáng)的附著性[50]。進(jìn)一步研究細(xì)菌生物被膜對(duì)殺菌劑的抗性因素，有助于選擇性的針對(duì)細(xì)菌生物被膜進(jìn)行有效控制。目前，控制細(xì)菌生物被膜的形成與發(fā)展的途徑主要有4種：（1）防止微生物與食品表面接觸；（2）阻止細(xì)菌生物被膜中的微生物生長(zhǎng)；（3）阻斷細(xì)菌生物被膜細(xì)菌細(xì)胞間的信號(hào)傳遞；（4）瓦解已經(jīng)形成的細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu)[51]。

4.1 物理方法

控制細(xì)菌生物被膜的常用物理方法有超聲波、低電流等。當(dāng)沒(méi)有抗生素或生物毒素時(shí)，含氯化合物的培養(yǎng)基抗菌效果明顯。劉麗婷等[52]研究發(fā)現(xiàn)，低頻超聲不能單獨(dú)影響細(xì)菌的生物膜，結(jié)合抗生素處理，可破壞細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)，顯著提高殺菌效果。Caubet等[53]研究發(fā)現(xiàn)，射頻電流為10 MHz的條件下，慶大霉素對(duì)生物被膜的控制作用對(duì)比于控制組明顯增加。

4.2 化學(xué)方法

金屬可以影響生物被膜的形成，高濃度的鐵對(duì)生物被膜有促進(jìn)作用，同時(shí)鐵元素也是生物被膜形成三維結(jié)構(gòu)必要元素[54]。表面活性劑也可以清除細(xì)菌生物被膜。如鼠李糖脂是假單胞菌屬合成的表面活性劑，它能加快銅綠假單胞菌的脫落速度，同時(shí)，還可以對(duì)已形成的生物被膜起到破壞作用[55]。除此之外，通過(guò)觀察5 000倍的金黃色葡萄球菌細(xì)菌生物被膜的掃描電鏡照片發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酸性氧化電解水處理后，細(xì)菌胞外物質(zhì)被破壞，菌體發(fā)生破裂，生物被膜細(xì)菌數(shù)量急劇下降，清除效果十分顯著。

抗生素的大量使用導(dǎo)致的耐藥性以致于細(xì)菌生物被膜難以清除，聯(lián)合使用抗菌藥物有利于清除細(xì)菌生物被膜，解決藥物感染等問(wèn)題。控制細(xì)菌生物被膜方法就是吸收某些生物活性成分到食品接觸表面，從而抑制細(xì)菌的黏附。萬(wàn)珍艷[56]通過(guò)紅霉素聯(lián)合環(huán)丙沙星霧化吸入試驗(yàn)，通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌生物被膜明顯減少。所以抗生素的衍生物和化學(xué)合成物均是清除細(xì)菌生物被膜的有效途徑。

在細(xì)菌生物被膜的防治階段，抑制細(xì)菌的黏附和定植，可以有效預(yù)防細(xì)菌生物被膜的形成。如在材料表面涂聚乙二醇或納米銀，都可以防止細(xì)菌生物被膜的形成[57]。也可以通過(guò)使用不同光譜和處理方法根除細(xì)菌生物被膜。研究者將以上方法進(jìn)行結(jié)合，如鹵化呋喃酮，消毒劑以及納米和微乳液結(jié)合對(duì)沙門氏菌生物膜有抑制作用[58]。此外，物理處理也可以與化學(xué)消毒劑結(jié)合使用，如低強(qiáng)度超聲波增強(qiáng)了氯己定對(duì)生物膜細(xì)菌的作用[59]。

此外，國(guó)際上也有許多新型的抗生物膜劑。Cedric[60]指出胱胺可以阻止銅綠假單胞菌生物被膜的形成并破壞生物被膜。丁烯內(nèi)酯是一種從海洋鏈霉菌中提取的有效的抗大環(huán)素化合物，以大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌為目標(biāo)，Qi[61]證明了丁烯內(nèi)酯不僅可以抑制生物膜的形成，并且可以消除被測(cè)細(xì)菌的生物膜。氯硝柳胺是一種廣泛的驅(qū)蟲藥，對(duì)金黃色葡萄球菌和根霉的生物被膜抑制率可達(dá)到30%～60%，特別是氯硝柳胺和阿奇霉素聯(lián)合使用對(duì)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)有明顯的抑制作用[62]。Marikani Kannan等[63]發(fā)現(xiàn)碘化銀納米顆粒對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都具有廣泛的抗菌譜，對(duì)生物膜有很強(qiáng)的化學(xué)治療作用，所以碘化銀納米顆?？梢宰鳛樯锬ば纬傻目刂苿?。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)細(xì)菌生物被膜的清除方法日新月異，新方法的清除效果更加高效便捷，具體見表2。

隨著生物被膜相關(guān)研究的不斷更新，清除生物被膜的最新研究進(jìn)展為以酶處理、激光技術(shù)、大氣冷等離子體、噬菌體溶素和電化學(xué)法等技術(shù)為基礎(chǔ)，以上5種清除方法與傳統(tǒng)的清除方法相比在定性或定量的水平上均體現(xiàn)清除效果的改善。也體現(xiàn)出單獨(dú)使用一種方法很難將生物被膜完全清除，多種清除方法并存在一定程度上提高了清除效率，并降低生物被膜產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 細(xì)菌生物被膜清除方法的最新研究進(jìn)展Table 2 The latest research progress of bacterial biofilm removal methods

5 總結(jié)

以生物被膜形式存在的致病菌不僅會(huì)造成食品工業(yè)設(shè)備的腐蝕，更會(huì)污染食品，縮短食品貨架期。本文從細(xì)菌生物被膜的生成、調(diào)控方面做了大量的整理，結(jié)合最新的研究進(jìn)展對(duì)細(xì)菌生物被膜的現(xiàn)狀進(jìn)行了分析。為實(shí)現(xiàn)細(xì)菌生物被膜的有效控制，消除由生物被膜造成的食品安全隱患提供了綜合性的認(rèn)識(shí)。結(jié)合了不同檢測(cè)和清除方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為后續(xù)生物被膜的相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。然而，如何更準(zhǔn)確尋找一種完整分析生物被膜形成的新方法，并探究低毒、高活性的生物被膜抑制劑以及多種方法聯(lián)用清除生物被膜還有待更深入的探究。