食品來源的碳點合成特性及生物應用研究進展

房彬，張竹君，李少鵬，夏婷

（天津科技大學生物工程學院省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457）

碳點 （carbon dots，CDs）是一類粒徑小于10 nm，由C、H、O等元素構成的新型熒光納米顆粒。2004年，這種熒光碳納米顆粒在單壁碳納米管的合成中被首次發(fā)現(xiàn)[1]。與傳統(tǒng)的量子點相比，碳點不僅具有紫外-可見光吸收、光致發(fā)光、上轉(zhuǎn)換熒光等優(yōu)質(zhì)的光學特性，還具有高生物相容性、抗光漂白、化學惰性和低細胞毒性等優(yōu)點。近年來，其在傳感器、細胞成像、藥物傳送等領域表現(xiàn)出巨大的應用潛力[2-3]，不斷地受到國內(nèi)外學者的關注，成為熒光納米材料研究的熱點。隨著可持續(xù)發(fā)展、綠色合成理念的不斷實施，制備碳點所需的原料選擇不再局限于檸檬酸、葡萄糖等小分子物質(zhì)和炭黑、石墨等碳質(zhì)材料，越來越多的食品來源的物質(zhì)也被應用其中。食品來源的物質(zhì)不僅富含葡萄糖、纖維素、多糖等有機分子，還含有氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等含氮、硫元素的天然營養(yǎng)物質(zhì)，可以在無額外表面修飾的情況下提高碳點的熒光產(chǎn)率。另外，以食品制備形成的碳點還具有更高的生物相容性、低細胞毒性和綠色環(huán)保等優(yōu)點，在生物領域具有廣泛的應用前景。本文就食品來源碳點的合成特性及其生物應用進行綜述。

1 不同食品來源的碳點合成

研究發(fā)現(xiàn)可以利用任何含碳材料制備碳點，因此合成碳點的原料具有廣泛的選擇性[4]。果蔬、動物、加工食品及其廢棄物中均含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營養(yǎng)成分，這些物質(zhì)不僅可以為碳點的合成提供天然的碳源，而且所富含的氨基也可以填補碳點表面缺失，從而提高碳點量子產(chǎn)率（quantum yield，QY）。另外，食品來源的物質(zhì)還具有環(huán)境相融性高、毒性低、成本低、易獲取、可再生等優(yōu)點[5]。目前食品來源的碳點主要通過自下而上法制備，主要包括水熱合成法、微波輻射法、熱分解法等。水熱合成法是制備食品源碳點最常用的方法，一般將原料與水等溶劑混合、密封在高壓反應釜內(nèi)，在高溫高壓條件下進行反應，再經(jīng)純化等步驟得到熒光碳點[6]。微波合成法是一種省時、高效、直接的碳點制備方法，可以在短時間內(nèi)碳化合成前體物，但可能會造成碳點粒徑大小不夠均一[5，7]。而熱解法是將天然產(chǎn)物高溫加熱形成碳化物質(zhì)，并從中分離和提純得到熒光碳點顆粒[8]。除此之外，還有化學氧化法、萃取法和分子聚集法等用于食品來源碳點的合成。以下將對不同食品來源的碳點合成特性分類介紹，詳見表1。

表1 不同食品來源的碳點合成Table 1 Synthesis of carbon dots from different food sources

1.1 果蔬來源的碳點合成

蔬菜水果不僅為人體健康提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，近年來研究發(fā)現(xiàn)也可為碳點合成提供前體物，例如：卷心菜、蘑菇、番茄、橙子等。制備果蔬來源碳點最常用的方法是水熱合成法。Chaudhary等[9]以香蕉為唯一原料，采用水熱合成法在150℃反應4 h合成碳點顆粒，其粒徑分布在0.5 nm～2.5 nm范圍內(nèi)，QY為32%，可在紫外線照射下發(fā)出藍色熒光。紫外-可見吸收光譜（ultraviolet visible，UV-vis）顯示，該碳點產(chǎn)生兩個明顯的吸收峰，分別在284 nm和330 nm處，對應于C=O的n-π*躍遷和C=C的π-π*躍遷。除水熱合成法外，微波輻射法也可用于制備果蔬來源的熒光碳點。Gu等[10]以蓮藕為碳源合成天然氮摻雜的熒光碳點，其可在365 nm激發(fā)光照射下呈現(xiàn)藍色熒光，平均粒徑約為9.41 nm，QY高達19%。傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）和 X射線光譜（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）顯示，該碳點主要由C、N、O 3種元素組成，其相對含量分別為61.81%、5.23%和32.96%，表面含有-COOH、-OH和-NH2等基團。

1.2 動物來源的碳點合成

動物及其衍生物中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等天然物質(zhì)，是人類生活中不可或缺的天然產(chǎn)物之一。制備動物來源碳點常用的方法是水熱合成法、熱解法和微波合成法。Zhao等[11]以新鮮豬肉為碳源，通過水熱合成法制備形成一種發(fā)藍色熒光的碳點顆粒，平均粒徑約為3.5 nm，QY為17.3%。熒光光譜顯示隨著激發(fā)波長的增加，發(fā)射峰出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象，結果表明該碳點具有激發(fā)依賴性的光致發(fā)光特性。Wang等[12]以雞蛋的蛋清和蛋黃為原料，通過等離子體誘導的熱解法合成兩種熒光碳點，分別為CDpew和CDpey。兩種碳點在紫外線照射下均發(fā)藍色熒光，CDpew其平均粒徑為3.39 nm，QY約為6%；CDpey其平均粒徑約為2.15 nm，QY約為8%。UV-vis光譜顯示，兩種碳點在275 nm處均表現(xiàn)出明顯的吸收。此外，熒光光譜顯示在360 nm的激光激發(fā)下，兩種碳點在420 nm處均熒光強度最高。綜合以上研究表明，與果蔬來源的碳點合成相比，以動物為原料合成的熒光碳點數(shù)量較少。

1.3 加工食品來源的碳點合成

許多加工食物也可以作為合成碳點的天然前體物，例如牛奶、咖啡、啤酒、豆?jié){等。Wang等[13]通過水熱合成法制備牛奶來源的碳點，結果發(fā)現(xiàn)所得碳點在紫外線照射下發(fā)藍綠色熒光，粒徑分布范圍為2 nm～4 nm，QY約為12%。通過FT-IR和XPS分析，碳點表面具有羧基、羥基等多個官能團和少量含氮基團，可能是牛奶在水熱處理過程中降解所形成。隨著碳點前體物的深入研究，研究人員發(fā)現(xiàn)在食物制作和高溫烘焙過程中也會產(chǎn)生熒光碳點。常用萃取法對食物自身或者加工過程中產(chǎn)生的熒光碳點進行提取。該方法先將碳點溶解于有機溶劑中，再使用萃取劑或者凝膠層進行分離純化，最后得到純化的碳點顆粒[5]。Wang等[14]通過萃取法從青島啤酒中提取出了一種藍色熒光碳點。研究結果顯示，該碳點粒徑約為2.5nm，QY約為7.39%。從透射電鏡圖（transmission electron microscopy，TEM）中可以觀察到碳點內(nèi)有間距為0.302 nm的晶格條紋。

1.4 食物廢棄物來源的碳點合成

一些食物廢棄物例如：絲瓜皮、咖啡豆殼、雞蛋殼等，也可作為綠色合成碳點的優(yōu)秀前體物。該合成碳點的來源不僅材料易得、投入資金少、經(jīng)濟成本低，而且還能減少環(huán)境的污染，綠色環(huán)保[15]?；瘜W氧化法也是制備食品源碳點的方法之一。該方法先將天然產(chǎn)物進行碳化，再添加氧化劑對其氧化處理，最后分離、純化得到純凈的碳點[5，8]。Jiao等[16]以芒果皮為碳源通過化學氧化法合成一種粒徑約為3 nm，QY約為8.5%的藍色熒光碳點。FT-IR光譜顯示，碳點表面含有O-H、NH、C-H、C-N、C-O、C-S等化學鍵，證明其表面存在大量的羧基、羰基、氨基等官能團。近期研究發(fā)現(xiàn)利用分子聚集法制備碳點時，不需要外界能量輸入或者使用復雜的裝置，可以有效地避免破壞天然產(chǎn)物的化學結構，為綠色環(huán)保合成碳點提供了新策略[5]。Wang等[17]以咖啡豆外殼為原料通過分子聚集法合成一種發(fā)藍色熒光的碳點顆粒，其粒徑分布在1 nm～5 nm范圍內(nèi)。通過該方法制備咖啡豆外殼來源的碳點可以有效的保護其中酚類化合物較強的抗氧化能力。根據(jù)DPPH法測定碳點的抗氧化能力，當碳點的濃度為0.16 mg/mL時，其清除自由基的能力可以達到85%。結果表明通過該方法制備的碳點可以有效地保護其中酚類化合物的抗氧化能力。

2 食品來源碳點的生物應用

食品來源的碳點因其優(yōu)良的光學特性、耐光漂白性、高水溶性、低細胞毒性等優(yōu)點，被認為是最具發(fā)展?jié)摿Φ臒晒饧{米材料。目前文獻報道其在離子檢測、生物傳感器、生物成像、藥物運輸、熒光繪圖等領域均有應用[14，29-31]。以下主要介紹食品來源碳點在生物領域的應用。

2.1 生物傳感器

2.1.1 在生物、醫(yī)學檢測上的應用

目前，在生物、醫(yī)學領域中對氨基酸、酶、蛋白質(zhì)等分子檢測常用免疫法、化學法、儀器測定法等方法。這些傳統(tǒng)方法雖已應用于臨床，但其還是存在耗時較長、儀器復雜等缺陷[8]。以食品為原料合成的熒光碳點其表面含有羥基、羧基、氨基等官能團，可作為生物傳感器的熒光探針對生物分子進行檢測。該方法不僅檢測效果顯著，而且資金投入少，具有較強的發(fā)展?jié)摿?。Lu等[18]利用西瓜汁制備碳點，研究發(fā)現(xiàn)該碳點表面的羥基、胺基和羧基基團與Fe3+之間發(fā)生強配位相互作用破壞輻射躍遷，從而使熒光猝滅；而在CDs/Fe3+體系中加入半胱氨酸后，導致了Fe3+離子從碳點表面分離，從而使熒光得以恢復，表現(xiàn)出“開-關-開”熒光變化的特性。根據(jù)該特性對半胱氨酸進行檢測，結果顯示其線性范圍為 0～250 μmol/L，最低檢出限為 0.27 μmol/L。研究表明西瓜汁來源碳點的熒光傳感器可用于半胱氨酸的檢測。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)蘑菇來源的碳點與HA和HAase之間表現(xiàn)出“開-關-開”熒光變化。依據(jù)該變化對溶液中的HA和HAase進行檢測，HA的檢測范圍為 50 pmol/L～50 μmol/L，最低限為 0.03 nmol/L；HAase的檢測范圍為0.2 U/mL～10 000 U/mL，最低限為0.1 U/mL。此外，該方法還可以用于人類尿液中HAase的檢測，結果顯示其回收率在97.7%～105.0%，尿液中的其他成分對檢測結果無顯著影響。研究表明該方法能夠?qū)Aase進行特異、靈敏地檢測。因此，食品來源的碳點不僅獲取方便、成本低廉，而且可作為一種熒光探針對人體中的生物指標進行靈敏高效地檢測，具有很好的應用前景。

2.1.2 在食品添加劑檢測上的應用

食品添加劑會使食物變得更加可口、美味，但其含量超標也會對人體健康造成一定危害。Hang等[32]發(fā)現(xiàn)甘蔗蜜糖來源的碳點可與食品添加劑日落黃發(fā)生靜電作用，從而引起熒光猝滅。以該碳點為熒光探針，對食品中日落黃添加劑進行檢測，結果顯示其檢測范圍為 0～60 μmol/L，檢測限為 0.399 μmol/L。研究表明基于該碳點的熒光傳感器可對食品中的日落黃進行高效檢測。S.Monte-Filho等[33]利用檸檬汁和洋蔥汁制備碳點，發(fā)現(xiàn)該碳點可與核黃素之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而引起碳點的熒光猝滅。利用該猝滅現(xiàn)象，以碳點為熒光探針，對復合維生素/礦物質(zhì)補充劑中核黃素進行檢測，結果顯示其檢測范圍為0.10 mg/mL～3.0 mg/mL，最低檢測下限為1.0 ng/mL。此外，對3種不同品牌的營養(yǎng)劑中核黃素進行檢測，其回收率在96.0%～101.4%。研究表明檸檬汁和洋蔥汁來源的碳點可作為熒光探針用于核黃素的測定。

2.2 生物成像

在生物成像領域，利用有機染料對組織切片進行染色是最常用的方法，但有機染料的劇毒性限制了其在細胞成像及體內(nèi)成像方面的應用[34]。碳點具有穩(wěn)定的光學特性、高細胞相容性、低細胞毒性等優(yōu)點。同時食品來源的碳點粒徑相對較小，更易于通過細胞膜進入細胞從而進行熒光成像。這些優(yōu)點使食品來源的碳點應用于生物成像方面成為可能。

Kasibabu等[35]利用石榴為前體合成一種粒徑約為3.5 nm的熒光碳點，并以其為探針利用激光共聚焦細胞成像儀對銅綠假單胞菌和燕麥鐮刀菌進行成像。結果顯示該碳點被細胞所攝取，在405 nm和458 nm的激光激發(fā)下，銅綠假單胞菌細胞和燕麥鐮刀菌細胞內(nèi)分別發(fā)出綠色和紅色熒光。Niu等[36]發(fā)現(xiàn)小白菜來源的碳點其粒徑約為1.8 nm，且具有較低的細胞毒性，Hela細胞在不同濃度（0～2 000 μg/mL）的碳點溶液中培養(yǎng)24 h后細胞活性保持95%以上。以該碳點為熒光探針，對大腸桿菌和Hela細胞進行激光共聚焦細胞成像。結果顯示在405 nm和488 nm激發(fā)下，碳點進入細胞內(nèi)并分別發(fā)出藍色和綠色熒光。Shen等[37]合成了一種甘薯來源的熒光碳點，并以其為探針利用激光共聚焦細胞成像儀對HeLa和HepG2細胞進行成像。兩種細胞在紫外光（330 nm～388 nm）、藍光（450 nm～480 nm）和綠光（510 nm～550 nm）激發(fā)下細胞分別發(fā)出藍色、綠色和紅色熒光。

目前利用碳點進行體外成像的研究較多，除此之外，也有學者對碳點的體內(nèi)成像進行了研究。Zhang等[17]以咖啡豆外殼來源的碳點為熒光探針對用宮頸癌小鼠進行動物活體成像。結果顯示注射碳點2 h后即可在腫瘤部位觀察到明顯的熒光信號；24 h后對小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)碳點多集中在腫瘤和肝臟，其他部位不受影響。此外，宮頸癌小鼠在注射碳點6 d后仍然存活，進一步地證明該碳點能夠安全地用于體內(nèi)成像。綜合以上研究提示食品來源的熒光碳點可安全、有效地應用于細菌和細胞的體外成像以及小動物體內(nèi)成像，在應用于生物成像領域表現(xiàn)出較大的潛力。

2.3 藥物傳送

隨著對醫(yī)學納米技術的深入研究，近年研究發(fā)現(xiàn)通過將藥物和納米材料結合可以提高藥物在人體吸收、分布、代謝方面的傳遞過程[2]。食品來源的碳點具有粒徑小、易溶于水、細胞相容性高等優(yōu)點，可作為納米載體應用于藥物傳輸領域。由于腫瘤的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應，與碳點結合的藥物進入人體后，易于定向腫瘤部位并聚集，從而更好地發(fā)揮藥效[38]。

Wang等[14]利用啤酒制備碳點，結果發(fā)現(xiàn)當碳點濃度在0～12.5 mg/mL范圍內(nèi)對細胞活性沒有顯著影響，表明該碳點具有低細胞毒性。以該碳點為藥物載體對鹽酸阿霉素（doxorubicin，DOX）進行藥物遞送，并通過激光掃描共聚焦成像儀進行觀察到隨著時間的增加，大部分的碳點-DOX復合物被MCF-7細胞所攝取，并將DOX轉(zhuǎn)移并釋放到細胞內(nèi)。研究表明該碳點可作為一種有效的納米載體用于乳腺癌治療。D’souza等[39]合成了一種胡蘿卜來源的熒光碳點，發(fā)現(xiàn)該碳點通過氫鍵與絲裂霉素藥物有效結合，但在中等酸性的腫瘤細胞外微環(huán)境 （pH 6.80）下碳點-藥物復合物的氫鍵斷裂，絲裂霉素釋放。同時，研究發(fā)現(xiàn)碳點-絲裂霉素復合物的細胞活性（60%）顯著低于裸碳點和純絲裂霉素的細胞活性（89%，81%），結果表明該碳點可作為絲裂霉素藥物載體顯著提高絲裂霉素的殺傷作用。因此，食品來源碳點表面存在的大量官能團，及其具有的低細胞毒性，有利于藥物遞送至目標部位發(fā)揮藥效。

3 展望

碳點作為一種新型熒光納米顆粒，具有優(yōu)良的光學特性、高分散性、高穩(wěn)定性、抗光漂白性等特點。食品來源的碳點與其他來源的碳點相比，具有綠色環(huán)保、尺寸較小、細胞毒性低、安全性高等優(yōu)點，在生物領域具有巨大的應用潛力，近年日益受到國內(nèi)外研究人員的關注。隨著研究地不斷深入，目前發(fā)現(xiàn)食品來源的碳點在合成及生物應用方面仍有些問題有待進一步地研究與探討：1）目前碳點的合成選用果蔬、動物等可食用的食品，會造成一定程度的資源浪費。今后可側(cè)重研究選擇食物的廢棄物或食品加工過程中的廢渣或廢料，以便綠色環(huán)保、可持續(xù)地利用食品制備碳點；2）目前合成食品來源碳點的方法需要大量能源投入，因此開發(fā)綠色合成方法，使之更加節(jié)能、高效地制備碳點，進而實現(xiàn)食品來源碳點的大規(guī)模制備，應用于實際，是今后研究的重要方向；3）食品來源的碳點在生物領域的應用多局限在生物傳感器、生物成像、藥物運輸?shù)确矫妫芊窭闷湫》肿影邢蛱攸c，進一步應用于疾病的診斷、預防及治療等方面，擴大其應用范圍，有待于科研工作者進一步探究。