丙酸鈉通過抑制NLRP3保護膿毒癥大鼠的結(jié)腸組織

謝獻政，楊然棟，陳肖鳴

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

膿毒癥是重癥監(jiān)護室患者常見的死亡原因[1]。腸道是膿毒癥諸多受損器官中受累最早的器官，同時腸道受損又能促進膿毒癥全身炎癥反應(yīng)[2-3]。膿毒癥時，腸道組織中炎性因子分泌和釋放增加，腸黏膜屏障受到破壞，有害物質(zhì)更易進入機體并隨血液循壞播散至全身各處[4]。NLRP3炎性小體是目前研究最多的一種炎性小體。NLRP3炎性小體被激活后，能調(diào)節(jié)caspase-1的活化，產(chǎn)生和分泌成熟的IL-1β和IL-18，參與炎癥反應(yīng)。研究表明，NLRP3炎性小體可能參與膿毒癥的發(fā)生進展，影響疾病的嚴重程度和預(yù)后[5]。

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）是細菌在腸道中發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等。SCFA在維持腸道穩(wěn)態(tài)以及腸道上皮細胞的形態(tài)和功能方面具有重要作用[6-7]。近年來，有報道表明丙酸鹽在葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）引起的結(jié)腸炎模型中，可以通過減少炎癥和氧化應(yīng)激來改善腸屏障功能[8]。但目前仍未見丙酸鹽在膿毒癥這一方面的研究。在本研究中，我們將探究丙酸鈉（sodium propionate，SP）對膿毒癥的結(jié)腸損傷是否具有保護作用，并研究其對NLRP3炎性小體的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠80只，體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2018-0017。

1.1.2 主要試劑：ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司；SP購自美國Sigma公司；claudin-1、occludin、NLRP3、caspase-1、IL-β、IL-18 一抗購自美國Affinity公司；beclin-1、LC3 II一抗購自美國CST公 司，HE染色試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥動物模型的建立：采用盲腸結(jié)扎穿刺法（cecum ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥模型。SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、假手術(shù)+SP組和模型+SP組（Sham、CLP、Sham+SP和CLP+SP），每組20只。CLP組、CLP+SP組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉并固定，腹部消毒，并予正中切口，分離暴露盲腸，將盲腸遠端結(jié)扎并用針頭對穿2次，將盲腸收納回腹，逐層關(guān)腹。Sham組、Sham+SP組大鼠僅打開腹腔，暴露盲腸，不予結(jié)扎穿孔，逐層關(guān)腹。處理后0.5 h和4 h后給予Sham+SP和CLP+SP組大鼠腹腔注射200 mg/kg SP。Sham組和CLP組注射等量 0.9%氯化鈉溶液。處理24 h后，處死各組10只大 鼠，收集結(jié)腸組織，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 生存率的檢測：每隔12 h觀察各組剩余10只大鼠的存活情況，記錄大鼠3 d的存活率。

1.2.3 觀察指標：HE染色觀察各組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)變化；ELISA檢測結(jié)腸組織中IL-6、TGF-β和TNF-α含量；Western blot和免疫組化染色檢測結(jié)腸緊密連接蛋白（claudin-1和occludin）和NLRP3炎性小體的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 利用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析并繪制生存曲線；多組間比較用單因素方差分析；計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP對膿毒癥大鼠生存率的影響 SP對CLP組大鼠72 h生存率的影響見圖1。Sham組和Sham+SP組動物72 h內(nèi)均無死亡。CLP組大鼠72 h生存率為10%，CLP+SP組大鼠72 h的存活率為50%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 SP減輕膿毒癥大鼠結(jié)腸組織病理損傷 Sham組和Sham+SP組中結(jié)腸組織大體觀無明顯變化，表面光滑，無水腫充血，鏡下觀黏膜上皮完整連續(xù)，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清楚，無炎性細胞浸潤。CLP組大體觀充血水腫，鏡下觀黏膜上皮間斷缺失，腺體排列紊亂，腺體間有炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。與CLP組相比，CLP+SP組的黏膜上皮缺失、腺體排列紊亂和炎性細胞浸潤較少。見圖2。

2.3 SP減少膿毒癥大鼠結(jié)腸組織的炎癥因子 CLP處理后大鼠的結(jié)腸組織中，三種炎癥細胞因子的濃度增加（P＜0.05）。而SP明顯抑制了CLP誘導(dǎo)的炎癥細胞因子濃度的升高（P＜0.05）。見圖3。

圖1 各組大鼠生存率比較（n=10）

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色

圖3 各組大鼠TNF-α、IL-6和TGF-β含量變化

2.4 SP增加膿毒癥大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示（見圖4），Sham組和Sham+ SP組的緊密連接蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CLP組的claudin-1和occludin蛋白表達與Sham組比降低（P＜0.05）。與CLP組相比，CLP+SP組claudin-1和occludin的蛋白表達有所增加（P＜ 0.05）。此外，各組結(jié)腸組織中claudin-1和occludin的免疫組化染色結(jié)果（見圖5）與上述Western blot結(jié)果一致（P＜0.05）。

2.5 SP抑制膿毒癥大鼠結(jié)腸NLRP3炎性小體激活 Sham組和Sham+SP組NLRP3、caspase-1、IL-β和IL-18 的蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CLP組NLRP3、caspase-1、IL-β和IL-18 的蛋白表達顯著高于Sham組（P＜0.05）。而與CLP組相比，CLP+SP組這些蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）。此外，各組的NLRP3和caspase-1免疫組化染色結(jié)果與上述Western blot結(jié)果一致，CLP+SP組的表達較CLP組有所降低（P＜0.05）。見圖6-7。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織occludin、claudin-1蛋白表達情況

3 討論

丙酸鹽是腸道菌群在宿主腸道內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物之一。據(jù)報道，丙酸鹽可減少LPS刺激的中性粒細胞TNF-α的釋放，抑制NF-κB的基因表達，具有抗炎作用[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)在大鼠哺乳期丙酸鹽可通過增加緊密連接蛋白的表達來促進結(jié)腸的屏障功能[10]。 而在膿毒癥相關(guān)性腸損傷尤其是結(jié)腸損傷方面，有關(guān)丙酸鹽的研究尚未見報道。正常情況下，完整的腸屏障能保護機體免受損傷，然而當腸屏障損傷，細菌移位或有害物質(zhì)進入體內(nèi)，使得機體膿毒癥惡化[11]。因此，研究丙酸鹽在膿毒癥結(jié)腸損傷中的作用及其潛在作用機制有助于深入闡明兩者間的關(guān)系，為膿毒癥期結(jié)腸損傷的預(yù)防和治療提供新的途徑。

在本研究中，CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠模型死亡率很高，在前期的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，腹腔注射 200 mg/kg SP處理可顯著降低大鼠死亡率（P＜0.05），提示SP可保護大鼠免受CLP誘導(dǎo)的死亡。進一步的實驗中，根據(jù)HE染色結(jié)果提示，SP對結(jié)腸的組織結(jié)構(gòu)具有保護作用，能減少中性粒細胞的浸潤，保護黏膜完整性，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細胞因子（包括促炎細胞因子和抗炎細胞因子）。促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間不斷相互作用，引起細胞因子風(fēng)暴[12]。早期抗炎細胞因子IL-6和TNF-α由巨噬細胞分泌并刺激免疫系統(tǒng)，已經(jīng)有研究證明其在膿毒癥模型中顯著升高[13]。TGF-β是抗炎細胞因子的一種，研究發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β有助于保護膿毒癥大鼠模型[14-15]。我們的實驗結(jié)果顯示，SP能顯著降低膿毒癥大鼠結(jié)腸組織中的IL-6、TNF-α和TGF-β水平。與之前的報道一致，即丙酸鹽可以顯著減少DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的炎癥細胞因子[8]。因此，我們推測，SP通過抑制IL-6、TNF-α和TGF-β等炎癥細胞因子，阻止細胞因子風(fēng)暴，改善膿毒癥結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng)。

腸上皮細胞之間的緊密連接是腸黏膜屏障中不可或缺的一部分，在維持腸屏障結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要作用。有研究表明，由于腸屏障受損，水電解質(zhì)吸收失衡，claudin-1基因敲除鼠不能存活24 h[16]。 腸屏障損傷被認為是膿毒癥多器官功能障礙綜合征的病因之一[17]。腸道病原體常常通過改變緊密連接破壞腸屏障。本研究結(jié)果顯示，CLP+SP組的claudin-1和occludin的蛋白表達比CLP組顯著增加，2組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從免疫組化染色結(jié)果來看，CLP+SP組結(jié)腸組織比起CLP組，呈棕色的緊密連接蛋白顏色更深，且分布更為連續(xù)密集。這表明SP通過增加緊密連接蛋白的表達對膿毒癥大鼠結(jié)腸屏障起保護作用。

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織occludin、claudin-1蛋白表達情況（免疫組化法）

圖6 各組大鼠結(jié)腸組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達情況

膿毒癥早期，適度的炎癥反應(yīng)可以抵擋外來病原體從而避免機體組織進一步的損傷。然而，過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致機體的臟器損傷和功能障礙。NLRP3炎性小體被認為可能會參與膿毒癥的炎癥級聯(lián)放大，對于膿毒癥患者的病情嚴重程度的預(yù)測，具有一定價值[18-19]。有研究認為NLRP3炎性小體在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[20]。NLRP3被激活后，參與腸道的炎癥反應(yīng)，分泌IL-18和IL-1β，募集炎性細胞浸潤，減弱腸道黏膜屏障功能。本實驗結(jié)果顯示，SP可以減少NLRP3炎性小體活化相關(guān)蛋白表達，表明SP可能通過抑制NLRP3炎性小體減少膿毒癥結(jié)腸損傷。由于可用于動物實驗的NLRP3激動劑的不足，在接下來的實驗中，若能在分組上再添上CLP+SP+NLRP3激動劑組，則能更進一步證明SP抑制NLRP3炎性小體。

圖7 各組大鼠結(jié)腸組織caspase-1、NLRP3蛋白表達情況（免疫組化法）

綜上所述，SP可能通過抑制NLRP3炎性小體的活化減少CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠中結(jié)腸組織的炎癥和損傷，從而發(fā)揮對膿毒癥大鼠結(jié)腸組織的保護作用。此外，SP還能顯著提高膿毒癥大鼠的存活率。