全基因組染色體微陣列分析及核型分析在頸項透明層增厚胎兒遺傳學診斷中的價值*

徐梅梅，王海霞

（安徽省婦幼保健院 產(chǎn)前診斷中心，安徽 合肥 230001）

頸項透明層（nuchal translucency,NT）是指胎兒頸后的皮下液體積聚，在超聲圖像上表現(xiàn)為頸后皮膚高回聲帶與深部軟組織高回聲帶之間的無回聲區(qū)[1]。作為胎兒的高危標志物，NT 增厚與胎兒的染色體畸變、病理性亞顯微拷貝數(shù)變異（copy number variation,CNV）、各種器官結(jié)構(gòu)異常、流產(chǎn)和死胎風險增加有關(guān)[2]。傳統(tǒng)的染色體核型分析因分辨率受限，僅能發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目及大片段（＞10 Mb）結(jié)構(gòu)畸變，難以識別亞顯微結(jié)構(gòu)異常，染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis,CMA）能夠?qū)θ蚪M掃描，分辨率達50～100 kb，比傳統(tǒng)核型分析提高近1 000倍，近年來已成為產(chǎn)前檢測CNV 強有力的診斷工具。本研究對62 例NT 增厚的胎兒進行標準的核型分析+CMA 遺傳學分析，評估NT 增厚的顯微和亞顯微水平遺傳學發(fā)病原因及兩者的診斷效率，為CMA 在產(chǎn)前診斷中的應用積累有價值的臨床資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月1日—2018年9月30日在安徽省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的62 例孕婦的胎兒（均為單胎妊娠）。根據(jù)NT厚度分為3組：2.5～＜3.5 mm組（30 例），3.5～＜4.5 mm 組（22 例）及≥4.5 mm 組（10 例）。年齡18～44 歲，平均（30.10±5.49）歲。通過羊水穿刺術(shù)獲取胎兒標本，同時行染色體核型分析及CMA 檢測。納入標準：①孕婦孕期11～13+6周（頂臀徑45～84 mm）；②NT 檢查，胎兒未合并其他異常。排除標準：①夫妻雙方本身合并染色體異常疾??；②合并感染性疾病、凝血功能障礙疾?。虎巯日琢鳟a(chǎn)；④胎盤前置伴出血；⑤羊水過少。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有受檢者術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 超聲檢查使用LOGIQ E9（美國GE 公司）、iU22（荷蘭飛利浦公司）彩色多普勒超聲診斷儀，配套經(jīng)腹部超聲探頭，探頭頻率設置為2～5 MHz；測量胎兒頭臀徑在45～84 mm；孕婦取仰臥位，胎兒自然姿勢，在胎兒正中矢狀切面時測量，放大超聲影像，使胎兒軀體占據(jù)整個影像畫面的3/4，同時顯示胎兒鼻尖、鼻骨、間腦、腭部和脊柱；分辨羊膜和胎兒皮膚，測量胎兒鼻骨下緣至頸椎垂直方向NT 最大厚度；橫標尺應放在白線的邊界處；直至兩者重疊，連續(xù)測量3次后取最大值，且光標尺的移動只可改變測量結(jié)果的0.1 mm。

1.2.2 羊水穿刺術(shù)納入62例患者，在孕18～24周時，無菌條件下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取三管羊水，每管約10 ml。所有穿刺在超聲引導下由具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)、經(jīng)驗豐富的醫(yī)生進行操作。

1.2.3 羊水DNA 提取取羊水10～15 ml 于離心管中，1 600 r/min 離心10 min，棄去上清液。使用QIAamp DNA Blood Mini Kit 試劑盒（德國Qiagen 公司）提取基因組DNA，用Nanodrop 2000 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測DNA濃度和質(zhì)量[光密度（OD）260/280 值1.8～2.0]。

1.2.4 染色體核型分析抽取2 管羊水，離心棄去上清液，混勻后，分別接種于2 個裝有4.5 ml 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，分兩線于5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～8 d，第2 天取出觀察，視生長情況換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，當有大量分裂期細胞時，加入秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)1 h后收獲-低滲-固定-制片-消化-G 顯帶。鏡下計數(shù)30 個中期分裂相，兩線鏡下各分析5 個核型，如遇嵌合體，加倍計數(shù)分析。染色體圖像分析系統(tǒng)兩線至少采3 個圖，核型結(jié)果嚴格參照《人類細胞遺傳學的國際命名體制（ISCN）》進行描述[3]。

1.2.5 CMA采用Affymetrix Gene Chip ? System（GCS）3000 Dx V.2 基因芯片掃描系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）對樣本進行檢測，嚴格按照Affymetrix Cyto Scan 750K 芯片（55 萬CNV 探針和20 萬SNP 探針）的標準操作流程進行檢測：基因組DNA 酶切、連接、PCR 擴增、純化、片段化、標記，芯片雜交、洗滌及掃描。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Chromosome Analysis Suite（ChAS 3.1）軟件進行分析，CNV 的報告閾值為200 kb缺失、500 kb 重復。對CMA 檢出的CNV 結(jié)果判讀，主要參考常用國際公共數(shù)據(jù)庫，如DGV（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）及本實驗室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫。根據(jù)CNVs 的性質(zhì)不同，將其分為致病性CNVs、可能致病性CNVs、良性CNVs、可能良性CNVs 以及臨床意義不明確CNVs 5 類[4]。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗，趨勢分析采用Cochran Armitage 趨勢檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 核型分析及CMA 結(jié)果

62 例NT 增厚的胎兒中，常規(guī)羊水核型分析發(fā)現(xiàn)10 例染色體異常，檢出率為16.13%，其中5 例（8.06%）為唐氏綜合征，2 例（3.23%）為18 三體綜合征，1 例（1.61%）嵌合體，2 例（3.23%）為染色體結(jié)構(gòu)畸變，分別為46，XN，t（1 ∶16）（q41 ∶q23）pat 和46，XN，der（18）。

CMA 發(fā)現(xiàn)15 例染色體異常，檢出率為24.19%，7 例（11.29%）為常見染色體非整倍體（5 例唐氏綜合征，2 例18 三體綜合征），8 例（12.90%）為染色體微缺失/微重復，其中4 例微缺失、2 例微重復、1 例微重復+微缺失、1 例伴有2 處微重復。CMA 檢出的CNVs 片段大小介于459 kb～34.34 Mb，涉及1q21.1q21.2、2q13、12p13.33p11.1、11p15.4、Xq28等區(qū)帶。

2.2 不同NT 值組核型分析和CMA 結(jié)果

2.2.1 2.5～＜3.5 mm 組30 例胎兒中核型分析發(fā)現(xiàn)4 例異常（13.33%），包括2 例唐氏綜合征，1 例18 三體綜合征和1 例結(jié)構(gòu)畸變46，XN，t（1 ∶16）（q41 ∶q23）pat；CMA 共檢出6 例（20.00%）異常，其中3 例染色體數(shù)目異常與核型一致，1 例2q13 微缺失，1 例Xq28 微重復，1 例伴有4q35.1 和13q11q 12.11 2 處微重復（其中4 例為致病性，2 例VOUS）。

2.2.2 3.5～＜4.5 mm 組22 例胎兒中核型分析檢出5 例異常（22.73%），包含3 例唐氏綜合征，1 例18三體綜合征和1 例結(jié)構(gòu)畸變46，XN，der（18）；CMA共檢出5 例（22.73%）異常，4 例染色體非整倍體與核型結(jié)果相同，1 例18p11.32p11.21 微缺失伴Yp11.31p11.2 微重復（均為致病性）。

2.2.3 ≥4.5 mm 組10 例胎兒中核型分析檢出1 例（10.00%）嵌合性異常；CMA 發(fā)現(xiàn)4 例（40.00%）異常，其中1 例為12 號染色體短臂發(fā)生2 次重復，1 例1q21.1q21.2 微缺失，1 例1q21.1 微缺失，1 例11p15.4微缺失（2 例為致病性，1 例為可能致病性，1 例為VOUS）。

2.2.4 總計62 例中，CMA 檢出15 例（24.19%）染色體異常，核型分析共發(fā)現(xiàn)10 例（16.13%）異常。核型分析和CMA 對染色體異常的檢出率，在3 種厚度的樣本間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表1）；經(jīng)Cochran Armitage 趨勢檢驗結(jié)果顯示，核型分析發(fā)現(xiàn)的染色體異常檢出率，隨NT 增厚的變化趨勢無差異（χ2=1.630，P=0.443），但CMA 所發(fā)現(xiàn)的卻有差異（χ2=11.567，P=0.003），CMA 檢出率隨NT 值的增加而增加。

2.3 孤立性及非孤立性NT 增厚胎兒核型分析和CMA 結(jié)果

62 例NT 增厚胎兒中，40 例為孤立性NT 增厚，22 例為非孤立性NT 增厚（包括10 例NT 增厚合并高齡孕婦、4 例NT 增厚合并不良孕產(chǎn)史、8 例NT 增厚合并其他超聲異常）。見表2。

表1 不同NT 增厚組核型分析和CMA 結(jié)果 例（%）

表2 孤立性及非孤立性NT 增厚胎兒核型分析和CMA 結(jié)果 例（%）

在40 例孤立性NT 增厚胎兒中，核型分析和CMA 的檢出率分別為2.5%（1/40）和12.5%（5/40），其中核型分析發(fā)現(xiàn)1 例46，XN，t（1 ∶16）（q41 ∶q23）pat 染色體間相互易位，CMA 發(fā)現(xiàn)5 例微缺失/微重復。在10 例NT 增厚合并高齡孕婦的胎兒中，核型和CMA 均檢出5 例異常，其中4 例為唐氏綜合征，1 例染色體結(jié)構(gòu)異常46，XN，der（18）；在4 例NT 增厚合并不良孕產(chǎn)史胎兒中，核型分析未見異常，CMA 發(fā)現(xiàn)1 例微缺失。在8 例NT 增厚合并其他超聲異常（如心室強光斑、脈絡叢囊腫、鼻骨缺失、房間隔缺損、下頜扁平等）胎兒中，核型發(fā)現(xiàn)4 例染色體非整倍體（1 例唐氏綜合征，2 例18 三體綜合征，1 例嵌合體），CMA 檢出4 例異常，除3 例染色體數(shù)目異常與核型分析一致外，CMA 發(fā)現(xiàn)1 例12 號染色體短臂2 次重復的畸變?？傮w而言，合并高齡、不良孕產(chǎn)史和其他超聲異常的非孤立性NT 增厚胎兒，核型分析和CMA 的檢出分別為40.91%（9/22）和45.45%（10/22），孤立性及非孤立性NT 增厚組核型分析和CMA 結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.770 和8.405，P=0.000 和0.004），非孤立性NT 增厚組均高于孤立性NT 增厚組。

2.4 核型分析及CMA 陽性結(jié)果比較

62 例胎兒中，核型分析發(fā)現(xiàn)10 例異常，其中7 例非整倍體異常與CMA 結(jié)果相符，另有3 例核型分析與CMA 結(jié)果不符（見表3）。其中，1 例（胎兒3）核型分析為46，XN，t（1 ∶16）（q41 ∶q23）pat，CMA未見異常（見圖1A），1 例（胎兒2）核型分析為46，XN（28）/47，XN，+mar（14）（見圖2A），CMA 顯示12p13.33p11.1 區(qū)段發(fā)生2 次重復（見圖1B），1 例（胎兒11）核型分析提示18 號衍生染色體46，XN，der（18）（見圖2B），CMA 提示18p11.32p11.21 區(qū)帶存在14.9Mb缺失，同時Yp11.31p11.2 區(qū)域存在約8.20Mb 重復（見圖1C 和D）。CMA 共檢出15 例染色體異常，除上述7 例染色體數(shù)目異常與核型分析一致及3 例核型分析與CMA 不吻合的胎兒外，在余下52 例核型分析正常的胎兒中，CMA 額外檢出6 例（11.54%）亞顯微拷貝數(shù)變異，片段大小介于459kb～2.03Mb，2例涉及1q21.1微缺失，1例2q13微缺失、1例Xq28微重復、1例11p15.4微缺失、1 例4q35.1 微重復，涉及RBM8A（605313）、TRAPPC11（614138）等基因。

表3 17 例NT 增厚胎兒中核型分析及CMA 結(jié)果比較

續(xù)表3

2.5 妊娠結(jié)局隨訪

10 例核型分析異常的胎兒中，9 例選擇終止妊娠，包括5 例唐氏綜合征，2 例18 三體綜合征，1 例18 號衍生染色體46，XN，der（18），1 例嵌合體46，XN（28）/47，XN，+mar（14）。1 例遺傳性染色體相互易位[46，XN，t（1 ∶16）(q41 ∶q23）pat]選擇繼續(xù)妊娠，出生后未見明顯異常。

圖1 胎兒CMA 結(jié)果圖

圖2 胎兒核型分析結(jié)果

52 例核型分析正常的胎兒中，2 例終止妊娠，剩余45 例選擇繼續(xù)妊娠，包括CMA 異常6 例（其中致病性2 例，可能致病性1 例，臨床意義不明3 例）均足月分娩，產(chǎn)后5 個月隨訪未發(fā)現(xiàn)異常，但不排除后期是否會有智力或精神發(fā)育層面的異常，此外，另有1 例NT 厚度為4.0 mm，且核型分析和CMA 正常的胎兒，出生后發(fā)現(xiàn)伴有房間隔缺損。研究中共有5 例失訪。

3 討論

臨床有15%～20%的妊娠以流產(chǎn)告終，其中1%的夫婦出現(xiàn)反復（至少2 次）流產(chǎn)，早期流產(chǎn)的主要病因是胎兒染色體異常，占比高達50%以上，因此早期篩查該異常尤為重要[4]。NT 作為一項妊娠早期篩查胎兒染色體非整倍體異常的有效指標已被廣泛應用于臨床，NT 的檢查孕周為11～13+6周，一般認為NT ≥3.0 mm 為異常標準。NT 增厚與胎兒的染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)畸變、微缺失/微重復、各種器官結(jié)構(gòu)異常、流產(chǎn)和死胎風險增加有關(guān)[5]。臨床對NT 增厚的胎兒，絕大部分需行介入性產(chǎn)前診斷，以評估胎兒遺傳學發(fā)病原因。目前，染色體核型分析作為常規(guī)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，通常僅可發(fā)現(xiàn)大于10 Mb 的染色體畸變[6]，但是很多遺傳疾病可能是由小于10 Mb 的“亞顯微結(jié)構(gòu)異?！睂е拢@些微缺失/微重復可能占人類遺傳性疾病相當大的一部分，據(jù)估計高達15%[7]，由此可見，傳統(tǒng)核型分析已不能滿足產(chǎn)前臨床遺傳病診斷需求。

CMA 作為一種新型的分子診斷方法，與傳統(tǒng)染色體核型分析比較，無需細胞培養(yǎng)，具有高通量、高分辨率和高自動化檢測的優(yōu)勢，可在全基因組范圍內(nèi)檢測核型分析難以發(fā)現(xiàn)的微缺失和微重復、部分嵌合體、雜合性缺失/單親二倍體等，一次性同步檢測多種與出生缺陷相關(guān)的基因組異常。本研究結(jié)果顯示，62 例NT ≥2.5 mm 的胎兒中，羊水核型分析發(fā)現(xiàn)10 例染色體異常，檢出率為16.13%，陽性樣本中包括5 例唐氏綜合征，2 例18 三體綜合征，1 例嵌合體，2 例染色體結(jié)構(gòu)畸變，該結(jié)果與既往文獻[8-10]報道基本類似。由此可見，NT 增厚是妊娠早期提示胎兒染色體異常的重要篩查指標之一，也是介入性產(chǎn)前診斷的主要指征之一，同時胎兒NT 增厚也是針對性篩查三體綜合征（唐氏綜合征居多）的重要指標。本研究結(jié)果還顯示，在不同NT 值組中，CMA 的檢出率略高于核型分析，主要是由于CMA 可以檢測核型分析難以識別亞顯微結(jié)構(gòu)異常，且從CMA 的檢測結(jié)果可以看出，隨著NT 厚度增加，CNV 的檢出率逐步升高。此外，本研究結(jié)果顯示，52 例核型分析正常、NT 增厚的胎兒中，CMA 額外檢出6 例（11.54%）染色體微缺失/微重復，片段大小介于459 kb～2.03 Mb，涉及1q21.1q21.2、1q21.1、2q13、11p15.4、4q35.1/13q11q12.11、Xq28區(qū)帶，其中4 例（5.77%）為可能致病性/致病性CNV（2例致病性，1 例可能致病性，3 例臨床意義不明），略低于既往報道[11]，這可能是由于本研究中選用的NT閾值較低（NT ≥2.5 mm）有關(guān)，其他相關(guān)研究多以NT ≥3.0 mm、3.5 mm 或4.0 mm 作為截斷值。40 例非孤立性樣本中，核型和CMA 的檢出率分別為2.5%（1/40）和12.5%（5/40），而在合并高齡、不良孕產(chǎn)史及其他超聲異常的非孤立性NT 增厚組，兩者的異常檢出均高于孤立性NT 增厚組。在孤立性和非孤立性NT 增厚組，CMA 的檢出率高于核型分析，但因樣本量較少，不能確定有無統(tǒng)計學意義。上述研究結(jié)果均表明，非孤立性NT 增厚組的pCNVs 檢出率高于孤立性NT 增厚組，對核型分析正常、NT 增厚的胎兒應再行CMA 檢測，以找出染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常發(fā)病原因，避免漏檢。

本研究62 例受檢胎兒中，核型分析發(fā)現(xiàn)10 例異常，其中7 例為數(shù)目異常，且與CMA 結(jié)果一致，另有3 例核型分析與CMA 結(jié)果不吻合：胎兒3 為孤立性的NT 增厚（3.0 mm），羊水核型分析為46，XN，t（1 ∶16）（q41 ∶q23）pat，CMA 未見異常，胎兒父母的核型分析結(jié)果顯示，母親未見異常（46，XX），父親核型分析為46，XY，t（1 ∶16）（q32 ∶q22），父親是1 號與16 號染色體之間相互易位的攜帶者，并將該變異遺傳給胎兒，因胎兒CMA 未見異常，說明在染色單體斷裂位點形成和重接的過程中未發(fā)生遺傳物質(zhì)的丟失和增加。胎兒2 的NT 厚度為4.5 mm，并伴有下頜扁平，核型分析結(jié)果為伴有額外標記染色體的嵌合體：46，XN（28）/47，XN，+mar（14），而CMA 結(jié)果顯示12p13.33p11.1 區(qū)段發(fā)生2 次重復，涉及Pallister-Killian 綜合征染色體異常區(qū)域，該綜合征表型包括智力低下、癲癇、皮膚色素沉著、面部異常等。CMA 初步明確mar 染色體的來源，但因夫婦拒絕進一步行胎兒羊水mar 染色體FISH 檢測及家系驗證，沒辦法最終確認mar 染色體的來源組成及家族遺傳性。胎兒11 的NT 厚度為3.8 mm，且孕婦為高齡，胎兒羊水核型分析提示18 號衍生染色體：46，XN，der（18），CMA 檢測結(jié)果顯示18p11.32p11.21 區(qū)帶存在14.9 Mb 片段缺失，涉及18p 單體綜合征，臨床表型包括發(fā)育遲緩、矮小、面部異常、智力低下等，同時Yp11.31p11.2 存在約8.20 Mb 重復，可見對該類核型分析結(jié)果不明的畸變，CMA 可協(xié)助明確核型組成及具體表現(xiàn)形式。因胎兒在不同染色體的短臂末端同時存在片段缺失和重復，根據(jù)細胞基因組學理論，高度提示夫妻一方是平衡易位的攜帶者，但夫妻拒絕進一步行家系驗證，無法有效評估胎兒染色體畸變的遺傳性及夫妻再生育時的再發(fā)風險。上述3 例核型分析與CMA 結(jié)果不符說明，核型分析能夠發(fā)現(xiàn)一些平衡性畸變、額外標記染色體及衍生染色體的表現(xiàn)形式，CMA有助于明確平衡性畸變斷裂位點重組過程中是否發(fā)生遺傳物質(zhì)改變，同時可協(xié)助判定額外標記及衍生染色體包含的基因種類、數(shù)量及來源。在52 例核型分析正常、NT 增厚的胎兒中，CMA 額外檢出6 例（11.54%）核型分析難以發(fā)現(xiàn)的亞顯微拷貝數(shù)變異。由此可見，核型分析和CMA 各有其獨特的優(yōu)勢，兩者的檢測結(jié)果可以相互驗證，互為補充，以確保產(chǎn)前診斷結(jié)果的準確性，避免漏診風險。

綜上所述，胎兒NT 增厚與染色體異常關(guān)系密切，且隨NT 值升高合并染色體病風險增大，CMA 能檢測傳統(tǒng)核型分析無法識別的染色體微缺失/微重復，建議對NT 增厚胎兒，應采用核型分析+CMA 的標準遺傳學診斷模式。