冠狀病毒小分子抑制劑研究進(jìn)展

姚爭光，王志斌，夏春年，莊春林 （. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 3004；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海00433）

冠狀病毒(coronavirus，CoVs)，在電子顯微鏡下呈“冠狀”或冠狀形態(tài)，因而命名為冠狀病毒，可感染人類并容易引起急/慢性呼吸道系統(tǒng)疾病[1]。冠狀病毒科分為α、β、γ 和δ 4 個屬[2]，已知感染人的冠狀病毒共有7 種，分別是HCoV-229E、HCoVOC43、 HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、 SARS-CoV，MERS-CoV 和SARS-CoV-2，其中，前4 種病毒致病性較低，一般僅引起類似普通感冒的輕度感染，后3 種對人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，具有較高的致死率，分別是2003 年出現(xiàn)的冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)感染的嚴(yán)重急性呼吸道綜合征、2012 年在中東地區(qū)出現(xiàn)高致病性冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)感染的中東呼吸綜合征和2019 年出現(xiàn)的一種新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)[3]。

1 冠狀病毒及其藥物靶點

冠狀病毒是一種包膜病毒，具有直徑為120～160 nm 的圓形或橢圓形病毒體[4]。冠狀病毒粒子外包裹著脂肪膜，膜表面有3 種糖蛋白，分別是刺突糖蛋白(spike glycoprotein，S 蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M 蛋白)和小膜蛋白(envelope protein，E 蛋白)。其中，S 蛋白是在病毒體表面上形成配體的I 型糖蛋白，介導(dǎo)與宿主受體的連接，由S1 和S2 兩個亞基組成；M 蛋白是一種前蛋白，主要參與病毒的裝配過程；E 蛋白是一種高度疏水的蛋白，可促進(jìn)病毒的組裝和釋放。病毒的基因組RNA 與核衣殼蛋白(nucleocapsid，N 蛋白)在病毒膜內(nèi)復(fù)合形成螺旋衣殼(圖1A)。

冠狀病毒RNA 基因組是不分段的單股正鏈RNA，大小為26～32 kb，是RNA 病毒中基因組最大的病毒[5]。冠狀病毒的基因順序一致，為5'-復(fù)制酶-S-E-M-N-3'，其中，RNA 5'端為被封端，具有甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，3'端被聚腺苷酸化，具有poly(A)尾巴，具有傳染性。從5'端開始，基因組長度的2/3(長度：20～22 kb)區(qū)域由兩個重疊的開放閱讀框(open reading frame)1a 和1b 組成，共同起著病毒RNA 聚合酶(Pol)的作用，編碼翻譯成兩個多肽，pp1a 和pp1ab[6]。這些多聚蛋白酶包括：類木瓜樣蛋白酶(papain-like protease，PLpro)、3C 胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3C chymotrypsin like protease, 3CLpro，也稱為主蛋白酶，Mpro)、RNA 依賴的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)和解旋酶(helcase，Hel)等[7]。對于所有冠狀病毒，結(jié)構(gòu)蛋白編碼在3′端，占基因組的1/3，按S-E-M-N 順序排列(圖1B)。

冠狀病毒通過S 蛋白附著在特定的細(xì)胞受體上，S1 亞基和同源受體之間的特異性相互作用會觸發(fā)S2 亞基的構(gòu)象變化，導(dǎo)致病毒包膜和細(xì)胞膜融合，并釋放核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；病毒在組織蛋白酶介導(dǎo)下與細(xì)胞表面受體結(jié)合以內(nèi)體途徑或細(xì)胞表面非內(nèi)體途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，低pH 和pH 依賴性的半胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶可以促進(jìn)冠狀病毒通過內(nèi)體途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞[8]。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，正鏈RNA 翻譯產(chǎn)生負(fù)鏈RNA 聚合酶前體蛋白，通過蛋白質(zhì)水解過程產(chǎn)生RNA 依賴性RNA 聚合酶(RdRp)；在RNA 聚合酶的作用下，生成全長的反義負(fù)鏈模板。從負(fù)鏈亞基因組模板中合成亞基因組mRNAs；亞基因組mRNAs 的翻譯會產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)中進(jìn)行病毒膜蛋白裝配，并形成小泡運出。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體中間體(ER-Golgi intermediate compartment, ERGIC)中被衣殼蛋白包裹的正鏈RNA 與膜蛋白識別，小泡內(nèi)卷，包住RNA。病毒通過高爾基體(golgi apparatus, GA)釋放囊泡，囊泡與質(zhì)膜融合釋放病毒，病毒繼續(xù)感染其他細(xì)胞(圖2)。冠狀病毒RNA 在復(fù)制過程中，因糾正其錯誤復(fù)制的酶活性較低，很容易出現(xiàn)病毒錯誤復(fù)制，導(dǎo)致病毒變異株的出現(xiàn)。

冠狀病毒的生命周期是一個復(fù)雜、連續(xù)、多步的過程，病毒配體S 蛋白、與病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制相關(guān)的RdRp、PLpro和3CLpro等多種蛋白質(zhì)和酶發(fā)揮關(guān)鍵作用，是治療冠狀病毒感染疾病的關(guān)鍵藥物靶標(biāo)，以它們?yōu)榘悬c，國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)了一系列的小分子抑制劑[9-22]，現(xiàn)分述如下。

2 冠狀病毒小分子抑制劑

2.1 SARS-CoV 小分子抑制劑

2.1.1 肽類小分子抑制劑

2003 年，Hilgenfeld 等報道了人冠狀病毒(229E 株)3CLpro(HCoV 229E 3CLpro)和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)3CLpro的晶體結(jié)構(gòu)，為抗冠狀病毒藥物研究提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。Hilgenfeld 等以此同源模建了SARS-CoV 3CLpro的三維結(jié)構(gòu)，通過分子對接發(fā)現(xiàn)多肽類似物1(AG7088, rupintrivir，圖3)可能對SARS-CoV 3CLpro具有良好的抑制活性[11]。該化合物原是一種鼻病毒3Cpro抑制劑，用于治療普通感冒，但口服生物利用度低，需鼻腔給藥，臨床研究已終止[12]。

2005 年，Mesecar 等 確 定AG7088 與SARS 3CLpro結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，為后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。根據(jù)AG7088 與SARS-3CLpro的 結(jié) 構(gòu) 模 式，AG7088 可劃分為P1～P4 四個區(qū)域。以此為模板對P2 位點進(jìn)行改造，合成了一系列多肽類小分子抑制劑。用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET)酶水平活性研究表明，含有2-甲基丙烯基基團(tuán)的化合物2(Kinact= 0.045/min，t1/2= 15 min,圖3)活性優(yōu)于含有苯基基團(tuán)的化合物3(Kinact=0.014/min，t1/2= 49 min)，提示P2 位點對應(yīng)SARS 3CLpro的空腔可以容納較小側(cè)鏈殘基[13]。以此為模板對P4 位點再進(jìn)行改造，又合成了一系列多肽類小分子抑制劑?；衔? 的IC50值為200 μmol/L，但抗病毒活性喪失；隨后，以化合物4(圖3)為先導(dǎo)，在P4 位點優(yōu)化獲得的化合物5[IC50=10 μmol/L，IC50(antiviral)=100 μmol/L]比化合物4[IC50= 200 μmol/L，IC50(antiviral)：未測]對SARS 3CLpro抑制活性和抗病毒活性更好。該化合物P4 位點從原有的5-甲基異惡唑-3-基團(tuán)變成1-[(叔丁氧羰基)氨基]-2-羥基乙烷-1-基團(tuán)，易與SARS 3CLpro的谷氨酸(166)殘基形成更多的氫鍵相互作用，有利于提高活性[14]。

2004 年，Vederas 等合成了一系列在α 位帶有鄰苯二甲酰肼基團(tuán)的酮-谷氨酰胺類似物，并測試其抑制抗SARS-CoV 3CLpro的活性。在酶水平系統(tǒng)構(gòu)效關(guān)系表明：將三肽(Ac-Val-Thr-Leu)附著在谷氨酰胺上可產(chǎn)生更好的抑制劑6(IC50= 0.60 μmol/L，圖4)[15]。2005 年，Wong 等以1 為先導(dǎo)化合物，對其P1～P4 位點優(yōu)化設(shè)計，合成了一系列衍生物，其中，化合物7(圖4)在酶水平對SARS-CoV 3CLpro的IC50值為1 μmol/L、Ki(inhibition constant)值為0.52 μmol/L，在感染了SARS-CoV 的Vero E6 細(xì)胞中測得的EC50值為0.11 μmol/L 和CC50值＞200 μmol/L，選 擇 性 指 數(shù)(SI， selectivity index, CC50/EC50)＞1 818[16]。

2006 年，Hsu 等發(fā)現(xiàn)了化合物8(Ki= 53 nmol/L，圖4),在SARS-CoV 感 染 的Vero E6 細(xì) 胞EC50值為0.6 μmol/L。通過解析化合物8 與SARS 3CLpro結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，化合物8 P1 位點醛基的羰基基團(tuán)與SARS 3CLpro的Cys145 共價結(jié)合形成C-S 共價鍵、與SARS 3CLpro的Gly143 和Cys145 形成兩個N-H 氫鍵、P1 位點五元環(huán)內(nèi)酰胺基團(tuán)與SARS 3CLpro的His163、Phe140、Glu166 形成3 個氫鍵，P2 和P3 位點的N-H 鍵分別與Gln189 和Glu166的羰基氧原子形成氫鍵、P3 位點的羰基氧原子與SARS 3CLpro的Glu166 的N-H 鍵形成氫鍵，這些共價鍵作用和氫鍵作用使化合物8 和SARS 3CLpro緊密結(jié)合[17]。

此外，國內(nèi)外還報道了一系列多肽或多肽類似物作為SARS-CoV 3CLpro抑制劑。2008 年，Rao 等解析了SARS-CoV 3CLpro的突變體H41A 晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了化合物9(Ki= 3.3 μmol/L，圖5)在酶水平上對SARS-CoV 3CLpro具有抑制作用，可以作為SARS-CoV 3CLpro小分子抑制劑[18]。2013 年，Hua等通過基于片段的藥物設(shè)計策略設(shè)計合成了一系列3CLpro抑制劑，當(dāng)P1 位置為谷氨酰胺，P2 位置為亮氨酸，P3 位置為萘丙氨酸殘基時，化合物10(圖5)在酶水平對SARS-CoV 3CLpro的IC50值為0.23 μmol/L[19]。2015 年，Simmons 等篩選含有2 100 個化合物庫，發(fā)現(xiàn)了化合物11(k11777，圖5)在酶水平(IC50= 0.68 nmol/L)對SARS-CoV 3CLpro的活性最好，對其優(yōu)化將哌嗪環(huán)上的甲基換成乙基時，在酶水平化合物12(圖5)的IC50值為0.04 nmol/L[20]。2011 年，Akaji 等報道了絲氨酸衍生物13(圖5)在酶水平對SARS-CoV 3CLpro的抑制活性較好，IC50值為30 μmol/L[21]，進(jìn)一步優(yōu)化獲得的苯異絲氨酸衍生物14(IC50= 43 μmol/L, 圖5)比化合物13(IC50= 30 μmol/L)的活性低[22]。

2.1.2 非肽類小分子抑制劑

（1）天然產(chǎn)物

2006 年，蔣華良等首次報道一種天然化合物15(槲皮素-3-β-半乳糖苷，圖6)具有SARS-CoV 3CLpro抑制活性(IC50=42.79 μmol/L)。在分子對接模擬的基礎(chǔ)上，由15 為模板設(shè)計合成了8 種衍生物，構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)：①去除了槲皮素部分的7-羥基，活性降低；7-羥基上引入一個大的糖基取代基對活性影響不大；②糖基乙?；沟没钚詥适В虎塾闷渌侨〈肴樘遣挥绊懟钚?。其中，化合物16(圖6)活 性 較 好，IC50為24.14 μmol/L[23]。2012 年，Jeong 等運用FRET 法研究了64 種天然化合物對SARS 解旋酶的抑制作用。化合物17(楊梅素, 圖6)通過影響ATP 酶活性而非解旋酶活性，間接抑制了SARS-CoV 解旋酶蛋白的表達(dá)，在酶水平對SARS-CoV 病毒活性IC50值為2.71 μmol/L[24]。2014 年，Park 等發(fā)現(xiàn)補骨脂種子的乙醇提取物具有抗SARS-CoV PLpro活性，在酶水平IC50值為15 μmol/L。進(jìn)一步分離獲得6 種芳香族化合物，它們均以劑量依賴性方式抑制PLpro，其中化合物18 活性最佳(圖6)在酶水平對SARS-CoV PLpro的IC50為4.2 μmol/L[25]。2015 年，Ryu 等發(fā)現(xiàn)含有羥基的查爾酮化合物19(圖6)對3CLpro和PLpro的抑制IC50值 分 別 為11.4 和1.2 μmol/L[26]。2017 年，Lee 等從布魯氏假單胞菌提取的多酚類化合物對3CLpro和PLpro具有抑制活性，多酚類化合物對PLpro的活性強于3CLpro；其中，化合物20(圖6)對PLpro抑制活性最佳，IC50值為3.7 μmol/L[27]。

（2）三氮唑類

2016 年，Wong 等采用微滴定板組合反應(yīng)策略修飾先導(dǎo)化合物，從中發(fā)現(xiàn)一類穩(wěn)定的苯并三唑酯SARS-CoV 3CLpro抑制劑，動力學(xué)和質(zhì)譜分析表明，該類化合物通過?；揎?CLpro的活性位點Cys145 發(fā)揮作用，其中，化合物21(圖7)在酶水平活性最佳，Ki為7.5 nmol/L[28]。此前，Stauffer 等篩選NIH 分子探針庫(Molecular Libraries Probe Production Centers Network, MLPCN)發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)構(gòu)的SARS-CoV 3CLpro抑制劑，化合物22(圖7)在酶水平對SARS-CoV 3CLpro的IC50為4.1 μmol/L[29]。

（3）咪唑類

2010 年，Liang 等設(shè)計一系列吡唑啉酮類化合物作為SARS-CoV 3CLpro抑制劑，其中，化合物中23(圖8)在酶水平對SARS-CoV 3CLpro表現(xiàn)出了較強 的 抑 制 作 用，IC50為5.5 μmol/L[30]。2016 年，Liang 等通過“老藥新用”的方法篩選神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase)對SARS-CoV 的作用，化合物24(圖8)在酶水平對SARS-CoV 3CLpro的IC50為16.4 μmol/L[31]。

（4）萘環(huán)類

2014 年，Mesecar 等對多種化學(xué)文庫的高通量篩選，確定化合物25 在酶水平具有SARS-CoV PLpro抑制活性IC50為8.7μmol/L。以此為先導(dǎo)化合物，開展結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)化合物26(圖9)中引入乙胺基基團(tuán)與SARS-CoV PLpro的Gln270、Tyr269 形成氫鍵，酶水平提高了20 倍(IC50=0.46 μmol/L)，對SARS-CoV 感染的Vero E6 細(xì)胞的抗病毒活性為EC50=6 μmol/L[32]。2010 年，Mesecar等通過對多種化學(xué)文庫進(jìn)行高通量篩選，鑒定了一種新的先導(dǎo)化合物27(圖9)，在酶水平對SARSCoV PLpro抑制活性IC50為59.2 μmol/L，在SARSCoV 感染的Vero E6 細(xì)胞中無抗病毒活性。以27 為先導(dǎo)化合物合成一系列類似物和進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，將甲氧基替換為乙酰胺基優(yōu)化得到化合物28(圖9)，28 中的乙酰胺基基團(tuán)與SARS-CoV PLpro的Tyr269 形成氫鍵，28 與SARS-CoV PLpro結(jié)合更加緊密，在酶水平(IC50=0.39 μmol/L)和抑制SARS-CoV 感染的Vero E6 細(xì)胞(EC50=8.3 μmol/L)方面同樣有效[33]。2006 年，來魯華等以化合物29(圖9)為模板，集中改變N-1 和C-5 位置取代基合成了一系列靛紅類衍生物，研究了其構(gòu)效關(guān)系。當(dāng)N-1 位置為β-萘亞甲基，C-5 位置為甲酰胺時，化合物30 在酶水平(圖9)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，IC50為0.37 μmol/L[34]。

（5）喹啉類

2004 年，Keyaerts 等檢測了抗瘧藥氯喹對感染SARS-CoV 的Vero E6 細(xì)胞的抗病毒潛力。結(jié)果表明，化合物31(圖10)的IC50值為8.8 μmol/L[35]。2005 年，Nichol 等發(fā)現(xiàn)化合物31(氯喹)對SARSCoV(ED50為4.4 μmol/L)發(fā)揮抗病毒作用，提示其可能具有治療方面的優(yōu)勢[36]，2014 年，Wilde 等檢測了氯喹對感染SARS-CoV 的Vero E6 細(xì)胞的抗病毒活性，EC50值為4.1μmol/L，CC50＞128 μmol/L，SI＞31[37]。2017 年，Kao 等對50 240 種化合物進(jìn)行篩選SARS-CoV 小分子抑制劑，鑒定出喹啉類化合物32(圖10)，其在感染SARS-CoV 的FRHK4 細(xì)胞中測得的EC50值為8.4 μmol/L，在有效濃度下未觀察到明顯的細(xì)胞毒性[38]。

（6）吡啶類

2008 年，James 等利用高通量篩選發(fā)現(xiàn)了化合物33(MAC-5 576，圖11)對SARS-CoV 3CLpro的酶活性IC50值為0.5 μmol/L；以33 為先導(dǎo)化合物，基于分子對接技術(shù)設(shè)計合成了一系列衍生物，其中，含有氯苯取代的化合物34(圖11)對SARS-CoV 3CLpro酶抑制活性提高了10 倍(IC50值為0.06 μmol/L)，表明SARS-CoV 3CLpro與呋喃一側(cè)結(jié)合口袋具有較大疏水空腔，可以容納苯環(huán)等大基團(tuán)，為進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要依據(jù)[39]。2008 年，Vederas 等制備一系列芳基亞甲基酮類似物，用FRET 測試SARS 3CLpro抑制劑的酶活性。構(gòu)效活性和35(圖11)與SARS 3CLpro結(jié)合模型研究表明：3 個芳香環(huán)對SARS-CoV 3CLpro具有良好抑制作用。該類化合物中35(圖10)對IC50的抑制作用值為13 μmol/L[40]。2012 年，Stauffer 等利用NIH分子文庫進(jìn)行高通量篩選SARS-CoV 3CLpro抑制劑，得到探針化合物36(圖11)，在酶水平對SARSCoV 3CLpro的IC50值為1.5 μmol/L，對SARS-CoV感染的Vero E6 細(xì)胞抗病毒活性EC50值為12.9 μmol/L。此外，化合物36 在中性PBS 緩沖溶液溶解性較好(95 μg/ml)[41]。2008 年，Mesecar 等設(shè)計合成一系列5-氯吡啶酯衍生物，用FRET 檢測抗SARS-CoV 3CLpro的活性。構(gòu)效關(guān)系表明，吲哚環(huán)第4 位具有5-氯吡啶基酯的抑制劑37(圖11)是最有效的抑制劑，在酶水平對SARS-CoV 3CLpro的IC50值為30 nmol/L，在感染SARS-CoV 的Vero E6細(xì)胞中測得EC50值為6.9 μmol/L[42]。

（7）其他類

此外，通過虛擬篩選體外酶活性測試還發(fā)現(xiàn)一系列SARS-CoV 3CLpro小分子抑制劑，如血清素拮抗劑38(圖12)(IC50= 5 μmol/L)[43]、異染色質(zhì)衍生物39(圖12)(IC50= 0.95 μmol/L)[44]、砜類化合物40(圖12)(IC50= 0.3 μmol/L)[45]、鹵 甲 基 酮 抑 制 劑41(圖12)(Ki= 0.31 μmol/L)[46]、不對稱的芳香族二硫醚化合物42(圖12)(IC50= 0.516 μmol/L)[47]、非天然的五元環(huán)雜環(huán)碳環(huán)核苷1,2,4-三唑類似物43(圖12)對SARS-CoV 感染的Vero E6 細(xì)胞EC50為21 μmol/L[48]。2018 年，Denison 等 發(fā) 現(xiàn) 核 苷 類 似 物44(圖12)(GS-5 734，remdesivir)在體外和SARSCoV 小鼠模型中能有效抑制人和人畜共患的冠狀病毒。在感染SARS-CoV 的人氣道上皮細(xì)胞(human airway epithelial cells, HAE)原代培養(yǎng)物中評估44 的抗病毒活性，顯示44 的EC50值為0.069 μmol/L[49]，通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，隨著44 劑量的增加，SARS-CoV 感染的細(xì)胞內(nèi)病毒基因組和亞基因組RNA 數(shù)量均呈劑量依賴性減少，與病毒滴度降低一致[50]。

2.2 MERS-CoV 的小分子抑制劑

2015 年，Radtke 等設(shè)計一系列雙柔性核苷類似物并測試其活性，其中，化合物45(圖13)在感染MERS-CoV 的Vero E6 細(xì)胞中顯示抗病毒活性EC50值為23 μmol/L[51]。2017 年，Grünweller 等用雙重螢光素酶測定法和病毒感染的原代細(xì)胞分析化合物46(圖13)對病毒翻譯的影響，確定感染MERS-CoV 的MRC-5 細(xì)胞的EC50值為1.3 μmol/L；在MERS-CoV 感染的人外周血單核原代細(xì)胞(PBMC)證實了化合物46 的抗病毒活性[52]。2019 年，Johnson 等基于SPR 和FRET 技術(shù)，從含有30 000種化合物的3 種不同化合物庫(Prestwick, Maybridge，Chembridge)中篩選出化合物47(圖13)，對MERSCoV PLpro酶具有明顯抑制活性，IC50值為20.0 μmol/L；為了進(jìn)一步改善其抑制活性，從352 個小片段庫得到一個片段48(ZT626+47)，48 是由47 和ZT626 之間形成氫鍵作用結(jié)合在一起(圖13)，IC50值為6.6 μmol/L，比47 提高了2 倍，后續(xù)將通過分子對接研究47 和ZT626 的具體結(jié)合模式[53]。

前面提到的多個SARS-CoV 3CLpro對MERSCoV 也具有明顯的抑制活性。例如，2014 年De Wilde等對348 個藥物進(jìn)行了抗MERS-CoV 活性的篩選。研究表明化合物31(氯喹，圖10)在體外感染MERS-CoV 的Vero E6 細(xì)胞中測得EC50值為3.0 μmol/L，CC50值 為58.1 μmol/L，SI 值 為19.4[37]。2015 年，Simmons 等篩選含有2 100 個化合物的庫，發(fā)現(xiàn)化合物11(圖5)在酶水平上對MERS-CoV 3CLpro的 活 性 最 好，IC50值 為46.12 μmol/L[20]。2016 年，Liang 等通過老藥新用的方法篩選NA 抑制劑對SARS-CoV 的作用，發(fā)現(xiàn)該類化合物中24 在 酶 水 平(圖8)對MERS-CoV 3CLproIC50為12.2 μmol/L[31]。2017 年，Kao 等對50 240 種化合物進(jìn)行篩選MERS-CoV 小分子抑制劑，鑒定出化合物32(圖10)，其在感染MERS-CoV 的FRHK4細(xì)胞中測得的EC50值為10.1 μmol/L[38]。2018 年，Denison 等發(fā)現(xiàn)核苷類似物44(圖13)(GS-5 734，remdesivir)，研究人員選擇在人氣道上皮細(xì)胞(HAE)原代培養(yǎng)物中評估44 對MERS-CoV 的抗病毒活性，顯示44 對MERS-CoV 的EC50值為0.074 μmol/L[49]。

2.3 SARS-CoV-2 的小分子抑制劑

在當(dāng)前SARS-CoV-2 疫情下，運用“老藥新用，一藥多用”策略開展科技攻關(guān)研發(fā)可治療COVID-19 的藥物，可大大縮短藥物研發(fā)時間，進(jìn)而可以解決新藥研發(fā)周期長、難以滿足當(dāng)前疫情控制急需用藥的難題。多個藥物或候選藥物(圖14)被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗SARS-CoV-2 病毒效能，包括化合物49(利巴韋林，EC50= 109.50 μmol/L、CC50＞400 μmol/L、SI＞3.65)，化合物50(噴昔洛韋，EC50= 95.96 μmol/L、CC50＞400 μmol/L、SI＞ 4.17)、化合物51(硝唑尼特，EC50= 2.12 μmol/L、CC50＞ 35.53 μmol/L、SI＞ 16.76)、化合物52(萘莫司他，EC50= 22.50 μmol/L、CC50＞100 μmol/L、SI＞ 4.44)、化合物31(圖10)(氯喹，EC50=2.71 μmol/L、CC50＞ 211.70 μmol/L、SI＞ 100.81)、化合物44(圖12)(瑞德西韋，GS-5 734)、化合物53(法匹拉韋，T-705，EC50= 61.88 μmol/L、CC50＞ 400 μmol/L、SI＞ 6.46)、化合物54(羥氯喹，EC50= 4.51 μmol/L、CC50＞ 249.49 μmol/L、SI＞ 55.32)等[54-55]。

Gao 等報道了一項多中心臨床試驗研究氯喹治療100 多例SARS-CoV-2 感染的肺炎患者的效果。結(jié)果表明，化合物31 在抑制肺炎惡化、改善肺部影像及縮短病程方面均優(yōu)于對照組，且上述患者未見嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且毒性可以接受[56]。

Wang 等在體外用非洲綠猴腎Vero E6 細(xì)胞(ATCC-1 586)測試羥氯喹的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，化合物54 在體外可以有效抑制SARS-CoV-2 感染，54 是一種已知安全有效的抗炎藥，預(yù)測該藥物對COVID-19 患者具有良好的抗炎潛力，這種可能性有待臨床試驗的證實[56]。Patel 等2020 年5 月22 日在《柳葉刀》上發(fā)表論文指出：COVID-19 住院患者單獨使用氯喹或羥氯喹或與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素聯(lián)用在治療新冠肺炎患者時，并未觀察到益處；且有可能造成患者生存率降低和室性心律失常的頻率增加[57]，世衛(wèi)組織隨即宣布暫停相關(guān)臨床試驗，而該文數(shù)據(jù)的真實性被廣泛質(zhì)疑且未提供原始數(shù)據(jù)，該文章已被撤稿。世衛(wèi)組織宣布重啟相關(guān)臨床實驗。

化合物44 作用于病毒進(jìn)入細(xì)胞的后期階段，與核苷類藥物的作用機制一致。對感染Vero E6細(xì)胞的EC90= 1.76 μmol/L，具有較低不良反應(yīng)，由同情用藥過渡到隨機雙盲的嚴(yán)格III 期臨床試驗(NCT04257656)，治療輕、中和重度感染COVID-19患者。報告顯示，在針對237 名病患的試驗中，158 人服用了瑞德西韋，另97 人沒有服用該藥，結(jié)果服藥患者的病死率為13.9%，沒服藥者的病死率為12.8%。此外，服用瑞德西韋的患者還出現(xiàn)了明顯的副作用，病毒數(shù)量及癥狀卻沒有明顯改善。王辰、曹彬團(tuán)隊得出的結(jié)論是：未觀察到瑞德西韋聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)療法與標(biāo)準(zhǔn)療法相比有統(tǒng)計學(xué)意義上顯著的臨床獲益[58]。另外一項是由美國國立衛(wèi)生研究院領(lǐng)銜的臨床研究，從2020 年2 月21 日開始，共招募1 063 名患者，隨機分為試驗組和安慰劑組，評價指標(biāo)為康復(fù)時間。研究結(jié)果顯示，接受瑞德西韋治療的試驗組患者痊愈中位時間為11 d、安慰劑組為15 d，與安慰劑組相比，接受瑞德西韋的試驗組患者痊愈時間縮短31%，P＜0.001，結(jié)果有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。但是，試驗組患者病死率為8.0%，安慰劑組為11.6%，P= 0.059，病死率無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異[59]。

Zhou 等 發(fā) 現(xiàn)，SARS-CoV-2 與SARS-CoV 基因組有79.5%的相似性[60]?；诙咝蛄型葱愿撸ㄟ^與相同受體ACE2(angiotensin converting enzyme 2)結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞，且已有文獻(xiàn)報道證實[61]，55(洛匹那韋/利托那韋, lopinavir/ritonavir)在SARS的治療中顯示出良好的效果，提示可能對SARSCoV-2 的治療有效。在重癥COVID-19 成人住院患者中，與常規(guī)治療相比，未觀察到化合物55 對治療有益 (臨床試驗注冊號：ChiCTR2000029308)。試驗結(jié)果表明，使用洛匹那韋/利托那韋組合與標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理相比，并沒有使嚴(yán)重COVID-19 成人患者癥狀得到顯著改善[62]。

化合物56(阿比多爾, arbidol)是一種具有免疫增強的非核苷類廣譜抗病毒藥物，用于治療甲、乙型流感病毒等引起的上呼吸道感染。體外細(xì)胞實驗顯示：與藥物未處理的對照組相比，阿比多爾在10～30 μmol/L 濃度下，有效抑制SARS-CoV-2 達(dá)60 倍，并能顯著抑制病毒對細(xì)胞的病變效應(yīng)。目前已注冊有鹽酸阿比多爾片治療COVID-19 的臨床研究(ChiCTR2000029621)。

3 結(jié)語

到目前為止，冠狀病毒沒有特效的抗病毒藥物或疫苗。新藥研發(fā)通常需要大量的人力、物力、財力和時間；在當(dāng)前COVID-19 疫情急需藥物的情況下，按照常規(guī)研發(fā)思路開展藥物研發(fā)，顯然“遠(yuǎn)水解不了近渴”。“老藥新用”策略的優(yōu)勢就是可以節(jié)約資源和時間,化合物的安全性已經(jīng)過驗證，可直接進(jìn)入臨床藥效研究。從戰(zhàn)略藥物儲備角度長遠(yuǎn)考慮，我們還可以利用計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)開展藥物設(shè)計及化合物庫篩選，發(fā)現(xiàn)新骨架、結(jié)構(gòu)多樣的苗頭化合物，進(jìn)而通過構(gòu)效關(guān)系研究、結(jié)構(gòu)優(yōu)化及成藥性評價，發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物、候選藥物及臨床有效藥物，可豐富抗病毒藥物的“儲備庫”。