干質(zhì)中藥材立式快速徒手切片法研究

李浩明，洪穩(wěn)穩(wěn)，張成中，魯 輪，周建理 （. 國家中藥材產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，安徽 亳州 26800；2. 亳州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽 亳州 26800；. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 20000；. 海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海200；. 安徽省質(zhì)量和標準化研究院，安徽 合肥 200）

顯微鑒定是中藥鑒定中利用顯微技術(shù)對中藥進行顯微分析，以確定其品種和質(zhì)量的一種常用鑒定方法，顯微制片是其主要的觀察對象。組織顯微鑒定則是中藥顯微鑒定最常用的方法之一[1-2]。對于一些動物、植物等組織片，徒手切片是其中最實用的方法之一[3]。使用傳統(tǒng)的方法需鑒定員具有很強的顯微觀察能力，更需操作者有扎實的切片功底。傳統(tǒng)的中藥顯微鑒定切片法是把干藥材清水泡軟，端在手上，用剃刀或刀片，快速地從水平方向由外向內(nèi)削下薄片[4-6]。這種切片方法的缺點是：藥材前處理耗時，處理軟硬程度不易掌握；操作時刀口下方?jīng)]有硬物抵托，藥材容易出現(xiàn)“讓”（在刀壓迫下彎曲）的情況，難以切到薄而完整的切片。由于傳統(tǒng)方法切片困難，導致許多實驗室不愿做此項目，故而選擇用石蠟切片[7]的方式制片觀察鑒定，而石蠟制片需要經(jīng)過蠟封、固化、切片、脫蠟等步驟，耗時較長[8]，相對來說不適合快速、準確檢測中藥的要求，影響到藥典等標準的使用，基于上述原因，制定標準時在方法上多選擇比較容易操作的粉末制片，但粉末制片可以提供的比對信息明顯少于切片，影響了鑒定的效率和準確性。冰凍切片技術(shù)是一種較為新穎的組織制片方法，它將生物組織置于低溫下，迅速凍結(jié)達到一定硬度后進行切片。相對于常規(guī)的石蠟切片，無需經(jīng)過脫水、透明、浸蠟等步驟,組織不會收縮，易保持原有生物形態(tài), 具有快速、簡便、易操作等優(yōu)點，但新鮮植物細胞因具有液泡，含水量較大使得在進行低溫切片時易形成冰晶，造成植物組織的細胞結(jié)構(gòu)受到傷害。又因為細胞壁的存在使得植物組織在冰凍后硬度變大易破碎，致使多數(shù)情況下難以切出結(jié)構(gòu)完整的切片,并且操作時需要快速冷凍設(shè)備及相適應的冰凍切片機，因此該技術(shù)在植物組織切片上的應用較少[9]。對于基層工作人員來說，如果能夠掌握一種更為簡單的切片操作方法，便可事半功倍。為此，筆者對傳統(tǒng)切片方法進行了多方面的改革，建立了一種新的切片方法，稱之為立式快速徒手切片法，本實驗隨機選擇了亳州中藥材市場上幾種具有代表性的中藥材進行切片操作，以對這一方法的可行性、精確性、操作性、實用性等進行驗證。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

顯微鏡（型號：德國徠卡DM2700P）；飛鷹刀片（上海吉列有限公司）；美工刀片（得力集團）老式剃刀（揚州天藝）。

1.2 材料

純凈水（自制）；水合氯醛、甘油（國藥集團）。廣金錢草、降香、蔓荊子、山羊角、西河柳、地錦草、堿地蒲公英、益母草等（亳州中藥材市場）。

2 方法與結(jié)果

2.1 切片方法

傳統(tǒng)顯微切片材料的處理沿用了國外研究植物組織學的工作方法。多采用新鮮植物，即“軟”的材料。而中藥材的顯微鑒定，實驗材料是干質(zhì)藥材。把干質(zhì)材料用鋸或小刀做出切面，再用細紋鋼銼加以處理使之成平整的截面，藥材下墊木板（塑料板、鋼板、載玻片等硬質(zhì)平面），刀口蘸水（蘸水可防止切片滑落）。刀片立起快速切下，切出薄片，切片不黏連（圖1A）。

2.2 藥材處理

廣金錢草、西河柳、地錦草、堿地蒲公英等脆質(zhì)的葉類、草質(zhì)莖類藥材，水浸10 s 后，紙巾壓平，處理至微軟，進行切片操作。蔓荊子、降香、人參等質(zhì)地較硬的果實種子類、木類及粉質(zhì)角質(zhì)類藥材，先在表面涂抹些許清水，讓其向內(nèi)浸潤，數(shù)十秒之后，在已處理材料表面的浸潤與未浸潤之間切或削下薄片。

2.3 制片效果

草質(zhì)莖類藥材廣金錢草莖，切片制作顯微組織片（圖1B），非腺毛、薄壁細胞、韌皮部等不同的顯微鑒定特征清晰可見，符合顯微組織切片要求；莖木類藥材降香橫切面，降香導管、纖維清晰可見，木射線特征明顯，易于觀察（圖1C）；蔓荊子橫切面干材料，制作橫切面組織片（圖1D），外果皮、中果皮細胞清晰可見；角質(zhì)類藥材山羊角橫切面（圖1E），角質(zhì)細胞清晰。

2.4 對不同種類中藥材切片的觀察

西河柳莖的橫切（圖2A），可見為葉半包莖，橫切面典型特征為下陷的氣孔集中在一側(cè)，為葉所在的位置；草酸鈣簇晶集中分布于皮層的內(nèi)側(cè)，在中柱鞘附近形成連續(xù)的纖維束鞘，韌皮部較明顯，初生木質(zhì)部中間無髓，這些特征明顯的構(gòu)造鏡下清晰可見，較之《中國藥典》(2015 年版)收載的粉末鑒定圖相比，其精確性、準確性均大大提高，且操作簡單。地錦草葉橫切面(圖2B）可見特有的C-4 花環(huán)式結(jié)構(gòu)。堿地蒲公英葉橫切面(圖2C）上表皮葉脈處向上凸起；表皮細胞壁向外加厚，側(cè)壁薄，內(nèi)側(cè)有1～2 層纖維束。益母草葉橫切（圖2D）可以見到小腺毛主要分布于上表皮，而大的腺鱗主要分布在下表皮。

生長年限較長的人參以傳統(tǒng)切片法難以得到完整的切片。用本法易于均勻用力，材料不易彎曲和滑動，可切到完整而厚薄均勻的切片 (圖2E)，顯微鏡下可清楚地觀察到其次生維管束有3 輪，形成層以外的樹脂道環(huán)有4 輪。由此可從兩個方面相互印證，確定此人參藥材的種植年限為4 年。雖然過去通過多張碎片也能得到同樣的結(jié)論，但有存在偏差的可能性。在實驗報告中提供這樣完整的照片作為佐證，其鑒定的效力可以明顯增加。

3 討論

中藥顯微鑒定是由西方植物解剖學沿用而來。西方植物組織解剖研究多用新鮮材料，中藥學家在使用這一技術(shù)時就自然想到先把藥材泡軟，使其重新恢復到新鮮植物的模樣。但這個“恢復”實則很難真正做到，在藥檢工作實踐中難以實現(xiàn)。故在顯微鑒定時也多選用其粉末顯微特征作為鑒定依據(jù)，盡管各種橫切面顯微特征通常都比單純的粉末在鑒定上更有價值。

在長期的中藥顯微檢驗工作實踐中，筆者逐漸摸索出了這種簡單、易操作、精確性及準確性較高的顯微組織制片方法，相對于傳統(tǒng)的徒手懸空切片法，創(chuàng)新的切片法區(qū)別在于藥材下墊有硬木板或塑料板支撐，也可操作在載玻片上，使刀片立起從上往下切。故我們把這種方法稱之為“立式切片法”。由于干質(zhì)藥材在刀下不易變形，切出的部分往往更薄、更完整、更便于操作。我們探索出的這種切片制片方法的特點是：①安全，由指甲頂住刀片，避免傷到手指；②便于用力，拇指或中指下壓固定藥材，便于手指用力也便于控制切片厚度；③操作時材料下墊有硬板，在切片過程中極大程度地保持切片完整不粘連。④實驗過程中省去傳統(tǒng)徒手切片法材料預處理流程，可在很短的時間內(nèi)完成切片透化觀察的鑒定工作，提高了顯微鑒定工作的效率，且簡單易學。植物分泌組織切片過程中極易因處理過度而被破壞，但用立式切片法切不同質(zhì)地、不同藥用部位的干質(zhì)藥材均得到較好的結(jié)果，故分泌組織的特征得以顯現(xiàn)，如廣金錢草在韌皮中的黃色分泌物，在降香導管內(nèi)紅棕色分泌物和蔓荊子外果皮細胞的棕色顆粒狀物十分明顯（圖1B、C、D）；山羊角切片中的曲眉樣（圖1E）構(gòu)造特點也很突出，這些都為鑒定藥材提供了很好的證據(jù)。在實驗過程中，針對刀片易損、刀片變鈍后影響切片效果這一問題，筆者選用價格低廉的刀片，目前市面上各種美工刀與剃須刀非常鋒利、價格低廉，這種刀片刀口脆硬，容易崩損變鈍，但往往十分鋒利。在材料前處理后，僅用數(shù)刀即可完成切片工作，在刀片未鈍之前就拿到滿意的切片。文中筆者并未對立式快速徒手切片法的具體切片姿勢進行細致的描述，因切藥是個人慣用姿勢的體現(xiàn)，在細微操作方面因人而異，只要經(jīng)過一段時間的練習，找到適合自己的立式徒手切片法即可。