復(fù)方滋陰顆粒對(duì)去卵巢大鼠性激素和氧化應(yīng)激水平的影響

錢 珺，謝 凡，衛(wèi)克昭，高建平，李文艷 （. 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海 0035；. 上海中醫(yī)藥大

學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203）

圍絕經(jīng)期綜合征（PMS）是指婦女從性成熟期步入老年期這一過(guò)渡階段出現(xiàn)的一系列植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂所導(dǎo)致的癥狀，又稱“更年期綜合征”。西醫(yī)通常采用激素替代治療，但臨床禁忌證較多[1]，且獲益-風(fēng)險(xiǎn)仍存在一定爭(zhēng)議[2]。中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少、療效肯定、不易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，是PMS 防治的理想選擇之一[3]。復(fù)方滋陰顆粒根據(jù)上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院中醫(yī)科臨床經(jīng)驗(yàn)方滋腎養(yǎng)陰湯（滋陰補(bǔ)腎方）改制而成，具有便于服用、攜帶、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)，患者耐受性更好[4]。經(jīng)20 余年臨床應(yīng)用和對(duì)該方先后進(jìn)行的一系列臨床研究證實(shí)，滋腎養(yǎng)陰方在改善PMS 癥候、調(diào)節(jié)雌激素受體及其相關(guān)蛋白的表達(dá)方面均有效驗(yàn)[5-7]。本課題組前期已順利建立該顆粒的制備工藝和質(zhì)控方法[8-9]?，F(xiàn)以去卵巢大鼠為模型，研究復(fù)方滋陰顆粒對(duì)其性激素和氧化應(yīng)激水平的影響，為該顆粒劑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

HH-4 型水浴鍋（江蘇杰瑞爾電器有限公司）；TGL-16G-A 型冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；JA5003AL 型天平（上海景天電子儀器有限公司）；Biotek Synergy HT 型酶標(biāo)儀（香港基因有限公司）。

1.2 藥物及配制方法

復(fù)方滋陰顆粒、滋腎養(yǎng)陰湯劑均為上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科自制，顆粒批號(hào)：171202，常溫干燥避光保存，1.00 g 浸膏粉相當(dāng)于4.21 g 生藥；湯劑濃度為167 g 生藥/150 ml 劑。六味地黃丸（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號(hào)：17C204），戊酸雌二醇片（拜耳廣州分公司，批號(hào)：383A）分別臨用前研磨后定容至所需濃度。注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F7112104），臨用前加入注射用水現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 試劑

T-SOD 測(cè)試盒（羥胺法，批號(hào)：20180726）、MDA 測(cè)試盒（批號(hào)：20180730）、GSH-Px 測(cè)定試劑盒（比色法，批號(hào)：20180731）均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；大鼠FSH ELISA 試劑盒（批號(hào)：201807）、E2 ELISA 試劑盒（批號(hào)：201807）、LH ELISA 試劑盒（批號(hào)：201807）均購(gòu)于上海哈靈生物科技有限公司。

1.4 動(dòng)物

雌性SD 大鼠，72 只，清潔級(jí)，體重200～220 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012 - 0002。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22～24 ℃，濕度（40±5）%，每天12 h 光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 方法

1.5.1 圍絕經(jīng)期大鼠模型的建立

除正常組外，其他雌性大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，假手術(shù)組大鼠切除兩側(cè)卵巢下方的部分脂肪組織后縫合，其他大鼠均切除兩側(cè)卵巢。術(shù)后3 d，每日1 次肌內(nèi)注射青霉素20 萬(wàn)U，從第4 天開(kāi)始連續(xù)5 d 陰道涂片觀察動(dòng)情周期，以動(dòng)情周期無(wú)變化確定去除卵巢徹底[10]。

1.5.2 分組及給藥方式

除正常組和假手術(shù)組，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、六味地黃丸組（0.9 g 生藥/kg）、戊酸雌二醇組（0.2 mg/kg）、滋腎養(yǎng)陰湯劑組（16.7 g 生藥/kg）和復(fù)方滋陰顆粒低、中、高劑量組（5.0、10.0、20.0 g 生藥/kg）。手術(shù)后第7 天開(kāi)始，各藥物組動(dòng)物給予相應(yīng)藥液灌胃，正常組、假手術(shù)組和模型組大鼠給予等容積的蒸餾水灌胃，每日1 次，每5 d 稱體重1 次，隨體重調(diào)整給藥量，連續(xù)灌胃給藥8 周。

1.5.3 取材及指標(biāo)檢測(cè)方法

將灌胃8 周的大鼠禁食不禁水12 h，依據(jù)體重灌胃給藥后，用25%烏來(lái)糖（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1.0 h 后離心10 min，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，取上層血清用于測(cè)定指標(biāo)。采用ELISA 法檢測(cè)血清中E2、FSH、LH 濃度；分別采用羥胺法和DTNB 法檢測(cè)血清中T-SOD 和GSHPx 活性，采用TBA 法檢測(cè)血清MDA 含量。所有操作均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果采用（±s）形式表示。采用單因素方差分析方法，LSD 法用于組間的兩兩比較，對(duì)于方差不齊者，采用Dunnett's T3 法分析，對(duì)于正態(tài)不齊者，采用秩和檢驗(yàn)法分析。以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)性激素水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清E2 顯著降低，F(xiàn)SH 水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型組相比，六味地黃丸組、戊酸雌二醇組、滋腎養(yǎng)陰湯劑組、復(fù)方滋陰顆粒中、高劑量組大鼠血清E2 水平顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），所有給藥組大鼠血清FSH 水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），六味地黃丸組、湯劑組、顆粒中劑量組大鼠LH 水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。與戊酸雌二醇組相比，顆粒高劑量對(duì)E2 水平的影響弱于戊酸雌二醇（P＜0.05），而顆粒中劑量組的FSH 水平明顯高于戊酸雌二醇組（P＜0.05）；而與六味地黃丸組、湯劑組相比，顆粒低、中、高劑量組則均無(wú)明顯差異。具體見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響

與正常組相比，假手術(shù)組大鼠血清的TSOD 活性沒(méi)有顯著降低。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清的T-SOD 和GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量沒(méi)有顯著變化。與模型組相比，各給藥組大鼠血清T-SOD 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；戊酸雌二醇組與復(fù)方滋陰顆粒中、高劑量組大鼠血清GSHPx 活性顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。與六味地黃丸組相比，顆粒低、中、高劑量組在T-SOD、MDA和GSH-Px 水平均無(wú)明顯差異；與戊酸雌二醇組相比，顆粒低劑量升高T-SOD 活性的作用強(qiáng)于戊酸雌二醇、使GSH-Px 活性升高的作用弱于戊酸雌二醇（P＜0.05），而顆粒中、高劑量組則無(wú)明顯差異；與滋腎養(yǎng)陰湯劑組相比，顆粒中、高劑量升高GSHPx 水平作用更明顯（P＜0.05），而顆粒低劑量與湯劑比則無(wú)明顯差異。具體見(jiàn)表2。

表1 復(fù)方滋陰顆粒對(duì)圍絕經(jīng)期模型大鼠性激素水平的影響（ ±s，n=8）

表1 復(fù)方滋陰顆粒對(duì)圍絕經(jīng)期模型大鼠性激素水平的影響（ ±s，n=8）

注：“—”表示不給藥。*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與假手術(shù)組比較；▲P＜0.05，與戊酸雌二醇組比較。

組別 劑量（g生藥/kg） E2（ng/L） FSH（IU/L） LH（ng/L）正常組 — 6.36±0.06 2.57±0.02 438.03±3.89假手術(shù)組 — 6.86±0.13 2.63±0.04 437.49±2.92模型組 — 4.56±0.11## 2.94±0.02# 428.50±1.55六味地黃丸組 0.9 6.76±0.13** 2.60±0.03** 393.35±2.38*戊酸雌二醇組 0.2 mg/kg 6.94±0.11** 2.62±0.02** 408.66±2.66滋腎養(yǎng)陰湯組 16.7 6.10±0.12** 2.60±0.02** 383.42±3.05*復(fù)方滋陰顆粒組 低劑量 5.0 6.03±0.18 2.56±0.03** 382.25±6.30 中劑量 10.0 6.73±0.10** 2.71±0.03*▲ 367.96±2.13** 高劑量 2 0.0 5.80±0.14*▲ 2.70±0.02** 370.22±4.91

3 討論

目前學(xué)術(shù)界較為認(rèn)可的PMS 的發(fā)病機(jī)制是圍絕經(jīng)期性器官逐漸萎縮，卵巢停止排卵，以E2 為主的雌激素和孕激素水平不斷降低，對(duì)下丘腦-垂體反饋抑制作用減弱，進(jìn)而LH 和FSH 濃度升高；同時(shí)卵泡產(chǎn)生抑制素減少，使LH 和FSH 濃度升高，下丘腦-垂體對(duì)雌激素敏感性降低，最終導(dǎo)致內(nèi)分泌和植物神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，引起一系列臨床癥狀[11]。從中醫(yī)診治角度，本病屬陰虛證，病因多為腎精虧損，天葵衰竭，精血兩虛，沖任不調(diào)，其中腎精虧損是其根本所在。因此治療當(dāng)以補(bǔ)腎虛為主[12-13]。方中生地、菟絲子共為君藥，奏填精益髓，滋補(bǔ)腎陰之效；女貞子、墨旱蓮、黃精、山茱萸共為臣藥，助君藥共行滋陰養(yǎng)血，益肝腎而補(bǔ)精之效；佐藥茯苓、澤瀉、淮山藥利水滲濕，健脾寧心；牡丹皮清熱涼血，制諸藥溫澀之性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，女貞子、墨旱蓮、菟絲子黃酮提取物具有雌激素樣活性[14]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清E2 明顯降低，F(xiàn)SH 水平明顯升高，與臨床PMS 的激素變化吻合；復(fù)方滋陰顆粒、湯劑組均能顯著升高血清E2 水平，降低FSH 和LH 水平，作用與六味地黃丸、戊酸雌二醇相當(dāng)。

表2 復(fù)方滋陰顆粒對(duì)圍絕經(jīng)期模型大鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響（ ±s，n=8）

表2 復(fù)方滋陰顆粒對(duì)圍絕經(jīng)期模型大鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響（ ±s，n=8）

注：“—”表示不給藥。*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較；#P＜0.05，與假手術(shù)組比較；▲P＜0.05，與戊酸雌二醇組比較；△P＜0.05，與滋腎養(yǎng)陰湯組比較。

組別 劑量（g生藥/kg） MDA（nmol/ml） T-SOD（U/ml） GSH-Px（酶活力單位）正常組 — 5.60±0.10 26.53±0.77 689.19±1.91假手術(shù)組 — 5.78±0.09 24.03±0.25 669.60±7.95模型組 — 6.59±0.20 21.12±0.36# 608.79±3.33#六味地黃丸組 0.9 5.28±0.10** 26.84±0.38** 629.77±3.67戊酸雌二醇組 0.2 mg/kg 4.69±0.10** 24.39±0.20* 668.24±4.15**滋腎養(yǎng)陰湯組 16.7 4.40±0.07** 25.62±0.56* 621.89±3.44復(fù)方滋陰顆粒組 低劑量 5.0 4.72±0.10** 28.30±0.54**▲ 627.04±2.79▲ 中劑量 10.0 5.28±0.07* 26.50±0.37** 670.17±5.78*△ 高劑量 20.0 4.93±0.12** 25.09±0.22** 674.04±6.10**△

衰老的機(jī)體存在著一定的抗氧化能力下降趨勢(shì)，圍絕經(jīng)期陰虛火旺的癥狀與代謝過(guò)程中氧化還原反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[15]。體內(nèi)MDA 含量升高，SOD、GSH-Px 等抗氧化酶活性降低，使過(guò)多的自由基聚集，線粒體內(nèi)膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致新陳代謝紊亂，調(diào)節(jié)功能失調(diào)，加速衰老。SOD 是需氧生物體內(nèi)唯一可以消耗超氧化物自由基的酶蛋白，可阻斷超氧化物自由基引發(fā)的一級(jí)反應(yīng)，較高的SOD 濃度對(duì)清除內(nèi)環(huán)境代謝及藥物等外環(huán)境引入的氧離子起積極作用；GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化物引發(fā)的二級(jí)反應(yīng)，減少對(duì)機(jī)體的損害；MDA 則是脂質(zhì)過(guò)氧化重要產(chǎn)物之一，具有細(xì)胞毒性[16]。三者均為反映機(jī)體自由基水平和清除自由基能力的主要指標(biāo)。大量藥理學(xué)研究結(jié)果表明，方中女貞子、墨旱蓮、菟絲子、山茱萸、黃精等藥味均具有抗氧化、抗衰老的作用。本研究結(jié)果表明，復(fù)方滋陰顆粒較其他組可顯著升高血清TSOD 和GSH-Px 活性，具有一定優(yōu)勢(shì)。

本研究證實(shí)復(fù)方滋陰顆?？赡孓D(zhuǎn)去卵巢圍絕經(jīng)期模型大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸性激素分泌功能的異常情況，提高雌激素水平，并可提高機(jī)體抗氧化能力。與傳統(tǒng)湯劑比較，該顆粒藥效一致，且在劑型上有一定優(yōu)勢(shì)。本課題組將進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)方滋陰顆粒的毒理學(xué)等研究，為其安全性提供依據(jù)。