響應(yīng)面優(yōu)化糯米茶酒生產(chǎn)工藝

王 琪，吳 麗，趙維薇，周書來*

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學院 五糧液技術(shù)與食品工程學院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000；3.大理大學 公共衛(wèi)生學院，云南 大理 671000；4.樂山職業(yè)技術(shù)學院 藥學系，四川 樂山 614000）

茶葉是我國重要的經(jīng)濟作物之一且產(chǎn)量豐富，但目前大部分中低檔茶葉特別是夏秋茶，因品質(zhì)因素價格普遍較低，常出現(xiàn)滯銷現(xiàn)象[1-4]。為了提高中低檔茶葉的經(jīng)濟附加值，需運用科技手段對茶葉進行深加工[5-6]。研究表明，一些企業(yè)通過萃取、微生物發(fā)酵等技術(shù)手段對中低檔茶葉中的黃酮類物質(zhì)加以利用，以獲得較高的經(jīng)濟價值[7-8]；也有部分企業(yè)利用中低擋茶葉生產(chǎn)茶酒，并取得了一定的成效[9-10]。發(fā)酵型茶酒是一種以茶葉、蔗糖為主要原料，通過微生物發(fā)酵，兼具茶香與酒香的新型飲料酒[11]。目前，市場上的茶酒大多存在成分和口感較為單調(diào)且風味不夠優(yōu)雅等問題，因此在其發(fā)酵過程中選擇較好的酒基進行生產(chǎn)尤為重要[12]。

黃酒是一種酒精度低、營養(yǎng)成分豐富的發(fā)酵型飲料酒[13]，林娟等[14]利用綠茶和糯米研制出一種香醇濃郁、酸甜適中的發(fā)酵型茶酒。此外，我國糯米加工的副產(chǎn)物利用程度低及深加工結(jié)構(gòu)層次不夠高，制約著我國糯米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[15]。由此，試驗選擇糯米作為酒基并采用黃酒的生產(chǎn)工藝制作茶酒。通過比較綠茶、紅茶、黃茶、黑茶、白茶、青茶等我國六大茶類與黃酒香氣的相似程度，發(fā)現(xiàn)紅茶的香氣與黃酒相似度最高，而且夏秋茶也較為適合作為紅茶[16]。試驗擬以糯米與紅茶為原料，采用能起到節(jié)能減排作用的生料釀酒法發(fā)酵糯米茶酒[17]，以期獲得感官特性優(yōu)良的糯米茶酒，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，實現(xiàn)提高中低檔茶葉與糯米附加值的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶（茶葉原料為四川小葉種群體品種，采摘標準為一芽二葉）：宜賓川紅茶業(yè)集團有限公司；糯米（水分含量為13.01%，淀粉含量為78.31%）：四川省宜賓市高縣釀酒原料種植基地；黃酒生料釀酒曲：麗水力克生物科技有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；蘆丁、楊梅素、木犀草素、槲皮素、山奈酚標準品（純度均＞98%）：成都曼思特生物科技有限公司；叔戊酸：美國Sigma-Aldrich公司；CH2Cl2、NaCl、Na2SO4（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S型電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；AZL-2500C型粉碎機：永康市紅太陽機電有限公司；HN-25S型電熱恒溫培養(yǎng)箱：浙江力辰儀器科技有限公司；PHs-3c型精密pH計：上海理達儀器廠；1200型高速液相色譜系統(tǒng)、6890N-5973MSD氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）儀：美國Agilent公司；QYN100-2型氮吹儀：成都喬躍儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糯米茶酒生產(chǎn)工藝流程

操作要點：將紅茶中的雜質(zhì)及梗等異形物去除，粉碎后過60目篩；將挑選好的優(yōu)質(zhì)糯米用純凈水淘洗干凈，用無菌紗布過濾后將紅茶粉按試驗添加量加入發(fā)酵罐中，并加入糯米質(zhì)量2倍的純凈水進行調(diào)配，之后加入一定比例的黃酒生料釀酒曲；在試驗設(shè)定的溫度條件下靜置發(fā)酵，發(fā)酵前5 d每天攪拌1次；發(fā)酵結(jié)束后濾布壓榨、抽濾，85 ℃熱水煎酒20 min后得成品。

1.3.2 糯米茶酒生產(chǎn)工藝單優(yōu)化因素試驗

參考黃建等[18]的單因素試驗方法，在茶粉添加量、酒曲添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間分別為1.5%、3%、30 ℃、12 d的基礎(chǔ)條件下，保持其他因素不變，只改變其中一個因素，考察茶粉添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酒曲添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）及發(fā)酵時間（8 d、10 d、12 d、14 d、16 d），以感官評分及酒精度為評價指標，每組試驗重復(fù)3次進行單因素試驗。

1.3.3 糯米茶酒生產(chǎn)工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以茶粉添加量（A）、酒曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）為評價因素，以感官評分為評價指標，進行響應(yīng)面試驗，因素與水平如表1所示。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation conditions optimization

1.3.4 糯米茶酒感官評分方法

感官評分由13名（6男7女）專業(yè)人員組成的感官評定小組參照GB/T 13662—2018《黃酒》[19]對糯米茶酒從外觀、香氣、滋味、風格等4個方面進行感官評分，評分標準見表2。

表2 糯米茶酒的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of glutinous rice tea wine

1.3.5 糯米茶酒理化指標測定

酒精體積分數(shù)測定：密度瓶法[19]；總糖（以葡萄糖計）測定：廉愛農(nóng)法[19]；總酸、氨基酸態(tài)氮的測定：電位滴定法[19]；非糖固形物的測定：重量法[19]；pH：酸度計法[19]。

1.3.6 糯米茶酒中黃酮類物質(zhì)測定

應(yīng)用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測糯米茶酒中黃酮類成分，并根據(jù)峰面積使用外標法進行定量分析。流動相A為0.2%磷酸，流動相B為80%甲醇；洗脫梯度程序在孫麗芳等[20]的基礎(chǔ)上改為：0～0.5 min，B液從10%增加至45%；0.5～10 min，B液從45%增加至50%；10～18 min，B液從50%增加至100%；18～21 min，B液100%保持不變；21～22 min，B液從100%降低至10%后停止。

1.3.7 糯米茶酒中香氣成分測定

試驗采用液液萃?。╨iquid liquid extraction，LLE）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對糯米茶酒的香氣成分進行測定：將100 mL酒樣加入分液漏斗中，隨后加入NaCl至飽和，使用30 mL重蒸CH2Cl2進行振蕩萃取10 min。重復(fù)上述過程2次，合并CH2Cl2的萃取物，并加入內(nèi)標物質(zhì)叔戊酸5μL（990μg/L）與10 g Na2SO4，然后利用氮吹儀將萃取液濃縮至1 mL。氣相色譜-質(zhì)譜條件參照鄭佳等[21]對五糧液香氣成分的分析方法。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用Origin Pro 12.1軟件進行數(shù)據(jù)制圖，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，利用Design Expert 10.1軟件進行響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米茶酒單因素試驗

2.1.1 茶粉添加量對糯米茶酒品質(zhì)的影響

圖1 茶粉添加量對糯米茶酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of tea powder addition on the quality of glutinous rice tea wine

由圖1可知，糯米茶酒的感官評分隨著茶粉添加量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當茶粉的添加量為2.0%時，糯米茶酒的感官評分達到了最高的（73.89±1.06）分。適量的茶粉能提高糯米茶酒的感官評分，其原因在于紅茶茶粉中含有的香葉醇、芳樟醇及其氧化物能賦予糯米茶酒愉悅的花香與果香[22]，使復(fù)合米酒的感官評分在香氣方面獲得較高的分數(shù)。但當復(fù)合米酒中茶粉添加量＞2.0%之后，因紅茶茶粉中的苦澀味在糯米茶酒中突顯出來，進而對糯米茶酒的感官特性造成不良影響，造成其感官評分顯著下降（P＜0.05）。糯米茶酒的酒精度隨著茶粉添加量的增加而下降，其原因是茶粉中含有的酚類物質(zhì)對微生物的生長繁殖具有一定的抑制作用[23]。雖然當茶粉的添加量從0增加至2.0%時，糯米茶酒的酒精度顯著下降（P＜0.05），但只下降了8.52%，感官評分增加了30.16%。故選擇茶粉添加量為2.0%用于后續(xù)試驗。

2.1.2 酒曲添加量對糯米茶酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著黃酒生料酒曲添加量的增加，糯米茶酒的酒精度也隨之增加，最高達到了（13.31±0.07）%vol。但糯米茶酒的感官評分隨著黃酒生料酒曲添加量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當酒曲添加量為2%時，糯米茶酒的感官評分為最高的（82.93±0.76）分。由圖2亦可知，酒曲添加量從1%增加至2%時，由于微生物及相關(guān)酶類的增加，能較快將淀粉質(zhì)原料轉(zhuǎn)化成乙醇及其他香味物質(zhì)，故在相同的發(fā)酵時間內(nèi)，2%的酒曲添加量能使糯米茶酒獲得較高的感官評分及酒精度[24]。當酒曲添加量從2%開始繼續(xù)增加時，糯米茶酒的酒精度也隨之增加，但感官評分反而呈現(xiàn)出下降的趨勢。其主要原因是增加曲量能提高發(fā)酵飲品的酒精度，但也會造成酒醅升溫過快，使糯米中的蛋白質(zhì)脫氨脫羧產(chǎn)生過量的高級醇，尤其是異丁醇，使糯米茶酒呈現(xiàn)出苦味[25]。故選擇酒曲添加量2%用于后續(xù)試驗。

圖2 酒曲添加量對糯米茶酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of Jiuqu addition on the quality of glutinous rice tea wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對糯米茶酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，在發(fā)酵溫度在26～34 ℃之間時，糯米茶酒的感官評分隨發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，發(fā)酵溫度30 ℃是糯米茶酒發(fā)酵的最適溫度，其感官評分達到最高的（82.93±0.76）分。當發(fā)酵溫度低于30 ℃之前，糯米茶酒酒體不夠醇厚、口感較為淡?。划敯l(fā)酵溫度高于30 ℃之后，糯米茶酒開始出現(xiàn)苦澀味，進而使其感官評分均顯著低于82.93分（P＜0.05）。糯米茶酒的酒精度隨發(fā)酵溫度的升高而升高，當發(fā)酵溫度高于30 ℃之后，其酒精度未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），故選擇發(fā)酵溫度為30 ℃進行后續(xù)試驗。

圖3 發(fā)酵溫度對糯米茶酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of glutinous rice tea wine

2.1.4 發(fā)酵時間對糯米茶酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，發(fā)酵時間從8 d增加至16 d，糯米茶酒的酒精度隨之從（8.42±0.06）%vol增加至（12.21±0.10）%vol。由于酒精度的升高能使糯米茶酒酒體更加豐滿，故其感官評分也隨之升高，最高達到了（90.94±1.24）分。發(fā)酵時間的延長也有助于釀酒微生物產(chǎn)生較為豐富的香氣物質(zhì)，使糯米茶酒獲得不錯的感官評分[26]。由圖4可知，當發(fā)酵時間從14 d增加到16 d時，糯米茶酒的酒精度與感官評分均未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。故選擇發(fā)酵時間為14 d用于后續(xù)響應(yīng)面試驗。

圖4 發(fā)酵時間對糯米茶酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of glutinous rice tea wine

2.2 糯米茶酒工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

通過單因素試驗，表明感官評分對糯米茶酒的品質(zhì)較酒精度而言更為重要，故通過Box-Behnken中心組合設(shè)計[27]，對茶粉添加量（A）、酒曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）4個因素為響應(yīng)因素，并以感官評分（Y）為響應(yīng)值進行響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表3。

對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表4。以感官評分為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到相應(yīng)的回歸方程：

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization

表4 響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of response surface methodology

由表4可知，模型的決定系數(shù)R2=0.993 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9862。4個因素對糯米茶酒感官評分的影響次序為D＞A＞C＞B，即發(fā)酵時間對糯米茶酒感官評分的影響最為顯著，其次是茶粉添加量，再次是發(fā)酵溫度。一次項A、D，交互項CD，二次項A2、B2、C2、D2對糯米茶酒感官評分的影響極為顯著（P＜0.01）；一次項C，交互項AD、BC對糯米茶酒感官評分的影響達到了顯著水平（P＜0.05）。

4個因素的兩兩相互作用的響應(yīng)面圖如圖5所示。由圖5可知，4個因素的兩兩相互作用中，因素C與因素D所形成的響應(yīng)面曲面坡度最為陡峭，與方差分析中交互項CD對糯米茶酒感官評分的影響極為顯著（P＜0.01）的結(jié)論相吻合。此外，因素AD與BC交互作用影響顯著（P＜0.05）。

根據(jù)響應(yīng)面軟件分析，糯米茶酒在茶粉添加量2.08%、酒曲添加量2.00%、發(fā)酵溫度29.95 ℃和發(fā)酵時間13.84 d的條件下，感官評分可獲得最高的理論值91.42分。為了試驗的可操作性將軟件得出的最優(yōu)浸提條件進行適當調(diào)整為茶粉添加量2.1%、酒曲添加量2.0%、發(fā)酵溫度30.0 ℃和發(fā)酵時間13.8 d，進行3組平行驗證試驗后，糯米茶酒的感官評分實際值為（91.87±1.24）分。

圖5 各因素交互作用對浸提率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between eachfactor on extraction rate

2.3 糯米茶酒理化指標與黃酮類物質(zhì)分析

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后測定糯米茶酒的理化指標及黃酮類物質(zhì)的含量，用未添加茶粉的酒樣作為對照，測定結(jié)果見表5。

由表5可知，糯米茶酒的理化指標與對照酒樣之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中，糯米茶酒的總糖、非糖固形物、氨基酸態(tài)氮、pH、感官評分均顯著高于對照酒樣（P＜0.05）；總酸和酒精度則顯著低于對照酒樣（P＜0.05）。以上6項理化指標均符合中華人民共和國GB/T 13662—2018《黃酒》標準[19]。紅茶茶粉的添加能將其中的黃酮類物質(zhì)（蘆丁、槲皮素、山奈酚、楊梅素分別為1.46 mg/g、0.93 mg/g、0.85 mg/g、0.21 mg/g）帶入糯米茶酒中，使其具有一定的生物活性，如蘆丁能防治腦溢血、高血壓、急性出血性腎炎等疾病[28]，槲皮素可改善機體脂肪代謝、抑制甘油三酯積累[29]，山奈酚對心血管疾病等的治療與預(yù)防有不錯的療效[30]，而楊梅素可改善由免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)[31]。綜上，糯米茶酒具有一定的保健價值。

表5 兩個酒樣的理化指標與黃酮類物質(zhì)含量Table 5 Physicochemical indexes and flavonoids contents in two wine samples

2.4 糯米茶酒香氣成分分析

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后通過GC-MS測定糯米茶酒的香氣物質(zhì)及其含量，用未添加茶粉的酒樣作為對照，測定結(jié)果見表6。

表6 兩個酒樣的香氣物質(zhì)含量Table 6 Contents of aroma compounds in two wine samples

續(xù)表

由表6可知，在糯米茶酒中共檢出42種香氣物質(zhì)（包括酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、酸類物質(zhì)、醛酮類物質(zhì)和其他類物質(zhì)），在香氣物質(zhì)的種類上多于對照酒樣的33種香氣物質(zhì)。其中，乙酸乙酯、異戊醇、苯乙醇、乙酸是糯米茶酒的主要香氣物質(zhì)，其含量均顯著高于對照酒樣（P＜0.05）。乙酸苯甲酯、已酸-2-已烯酯、水楊酸甲酯、橙花醇、芳樟醇、氧化芳樟醇、反式-2-己烯酸、香葉醛、2,6,6-三甲基環(huán)已烷酮、α-紫羅酮、β-大馬酮、β-紫羅酮、N-乙基琥珀酰亞胺、N-乙基乙酰胺、咖啡堿、十二烷等16種化合物是糯米茶酒相對于對照酒樣所特有的香氣物質(zhì)，其中，乙酸苯甲酯、已酸-2-已烯酯、水楊酸甲酯、橙花醇、芳樟醇、氧化芳樟醇、香葉醛、α-紫羅酮、β-大馬酮、β-紫羅酮、咖啡堿、十二烷等12種香氣物質(zhì)是紅茶中原有的香氣物質(zhì)[32-33]，而其余4種香氣物質(zhì)則可能是在發(fā)酵過程中紅茶的某些成分經(jīng)微生物代謝后生成，進而使糯米茶酒兼具紅茶茶香。綜上，經(jīng)試驗優(yōu)化后可獲得酒香與茶香和諧、濃郁的糯米茶酒。

3 結(jié)論

以糯米與紅茶為主要原料，采用生料法釀造黃酒，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken中心組合設(shè)計優(yōu)化糯米茶酒的釀造條件。結(jié)果表明，在洗凈的糯米中添加2.1%的茶粉、2.0%的酒曲及2倍質(zhì)量的純凈水，30.0 ℃發(fā)酵13.8 d。后經(jīng)濾布壓榨、抽濾，85 ℃熱水煎酒20 min，待冷卻后可獲得感官評分91.87分、酒精度12.33%vol的糯米茶酒，酒體呈黃褐色、酒香與茶香和諧、酒體豐滿，理化指標符合GB/T 13662—2018《黃酒》標準。利用HPLC檢測糯米茶酒中黃酮類物質(zhì)及其含量，其中，蘆丁、槲皮素、楊梅素、山奈酚含量分別為98.23 mg/L、25.45 mg/L、16.71 mg/L、2.72 mg/L；采用LLE-GC-MS分析共檢測出糯米茶酒中42種香氣物質(zhì)，其中芳樟醇、香葉醛、β-大馬酮等16種香氣物質(zhì)是由原料中添加了紅茶所致。因此，該糯米茶酒不僅感官特性優(yōu)良而且具有一定的保健價值，進而具有廣闊的市場潛力。